文摘

越来越多的证据表明,增加脂联素的方案将为炎症和心血管疾病提供新的治疗策略。这里,我们测试的影响troglitazone (TG)和新合成的导数,5 - [4 - (8-tetramethyl-chroman-2-yl-methoxy 6-hydroxy-2 5 7日)苯亚甲基]2,4-thiazolidinedione(Δ2troglitazone(Δ2TG)),在单核细胞/巨噬细胞和脂联素表达的相关机制。脂联素的表达是位于巨噬细胞的动脉粥样硬化病变患者和cholesterol-fed兔子。TG和Δ2TG增强脂联素mRNA和蛋白表达在THP-1细胞定量实时PCR,免疫印迹和免疫细胞化学。通过PPAR TG诱导脂联素mRNA的表达γ端依赖途径而Δ2TG增强脂联素通过PPAR mRNA的表达γ独立在THP-1细胞通路。TG和Δ2TG增强脂联素mRNA表达通过活化蛋白激酶(AMPK)激活。TG和Δ2TG THP-1细胞的粘附降低TNF-α-treated HUVECs和抑制作用被废除由特定antiadiponectin抗体。TG -和Δ2TG-induced抑制单核细胞粘附被选择性抑制AMPK抑制剂化合物c,我们的数据表明,TG和Δ2TG单核细胞粘附的抑制作用可能至少部分通过新创脂联素的表达和激活AMPK-dependent通路,从而可能在抗炎和antiatherosclerosis发挥重要作用。

1。介绍

吞噬细胞巨噬细胞是异构和塑料的人口,这源于循环myeloid-derived血液单核细胞,进入目标组织,获得表型和功能属性部分取决于他们居住组织(1]。这些细胞在炎症过程中起关键作用和心血管疾病。他们积累了大量的脂质形成泡沫细胞,启动病变的形成和积极参与动脉粥样硬化病变的发展。良好的细胞模型系统研究巨噬细胞向泡沫细胞的关键转型是人类THP-1单核细胞的细胞系(2]。脂联素,adipocytokine专门表达和分泌脂肪细胞和循环在高浓度等离子体中,被证明能抑制巨噬细胞泡沫细胞形成的表达下调清道夫受体表达和acyl-coenzyme:胆固醇acyltransferase-1表达式(3]。虽然脂联素被认为是表达和分泌主要从脂肪组织脂联素mRNA表达被发现在其他几个细胞类型,包括原发性肝正弦内皮细胞、星状细胞,巨噬细胞(4]。它也被报道,脂联素可以抑制炎症过程和动脉粥样化形成抑制单核细胞/巨噬细胞的迁移,转换成巨噬细胞泡沫细胞,巨噬细胞的脂质积累(5,6]。因此,增加脂联素表达已经成为一种很有前途的药物目标心血管和其他相关疾病的治疗。

糖尿病thiazolidinediones已成为有效的代理和抗炎(7]。一般认为他们函数通过激活过氧物酶体proliferator-activated受体-γ(PPARγ)。通过PPAR thiazolidinediones-induced脂联素的表达γ激活脂肪细胞可能构成其药理作用,脂联素导致insulin-sensitizing和antiatherogenic效果是良好的8]。Troglitazone, PPARγ催化剂,减少肿瘤坏死因子-α(TNF) -α-induced活性氧(ROS)生产和细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1)表达内皮细胞(9]。PPARγ活化剂提高PPAR的表达γ在巨噬细胞和抑制清道夫受体的合成和矩阵metalloproteinase-9 [10]。我们先前的研究表明,PPARγ受体激动剂罗格列酮抑制单核细胞粘附fibronectin-coated板块新创脂联素生产在人类单核细胞(11]。thiazolidinediones的功能可以改善胰岛素敏感性增加脂联素的浓度,减少游离脂肪酸和炎性因子TNF-α水平在糖尿病患者和动物模型(12,13]。脂联素表达的调节需要涉及PPAR的一系列复杂的细胞内信号通路γ和AMPK14,15]。是知之甚少的影响troglitazone (TG)和新合成的导数,5 - [4 - (8-tetramethyl-chroman-2-yl-methoxy 6-hydroxy-2 5 7日)苯亚甲基]2,4-thiazolidinedione(Δ2troglitazone(Δ2TG)图1)脂联素表达在炎症条件下,这些影响的机制,和更好的理解这些点可能提供重要的见解炎症和心血管疾病的发展。本研究的目的是调查TG的影响和Δ2TG THP-1细胞脂联素表达和确定PPARγAMPK和参与。我们的研究结果表明,TG和Δ2TG增加脂联素mRNA和蛋白表达,这种效应是由AMPK磷酸化。TG和Δ2TG也明显减少了单核细胞的粘附TNF-α-treated HUVECs。

2。材料和方法

2.1。样本收集和免疫组织化学染色

本研究机构审查委员会批准的国立台湾大学医院,台北,台湾。所有的参与者提供了纳入研究前书面知情同意。所有实验程序和协议涉及动物是依照当地动物保健机构的指导方针,被批准的机构国立台湾大学动物保健委员会(台北,台湾),并符合指南的护理和使用实验动物(NIH没有出版。86 - 23,1985年修订)。冠状动脉3例获得接受心脏移植手术的或动脉粥样硬化。手术后,立即组织与冰冷的磷酸盐(PBS)冲洗,在4%多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋。组织连续切片在5μ米的间隔和组织部分deparaffinized,水化,并与PBS洗。内源性过氧化物酶活性与3% H被孵化₂O₂。部分被孵化与PBS含5毫克/毫升的牛血清白蛋白(BSA)阻止非特异性结合。

确定血管壁和脂联素的表达水平是否与巨噬细胞有关,两个串行部分被免疫染色检查,分别,脂联素或巨噬细胞的标记。第一部分顺序孵化了一夜之间在4°C 1: 100稀释兔抗体人脂联素(Epitomics)磷酸盐(PBS)含10%普通马血清(Gibco) (PBS-NHS)和90分钟在室温下与1:200稀释的生物素化的山羊anti-rabbit PBS-NHS免疫球蛋白抗体(圣克鲁斯生物技术),然后结合抗体可视化使用3,3′-diaminobenzidine(轻拍,Sigma-Aldrich)。特定的信号被主要的抗体是棕色的。消极的控制,主要抗血清是取代了正常兔免疫球蛋白。对巨噬细胞的识别,第二部分是孵化与小鼠单克隆抗体人类巨噬细胞(DAKO、日本)。这些部分被孵化与异硫氰酸荧光素(FITC)共轭山羊anti-mouse二级抗体(σ)和荧光显微镜观察到。

2.2。细胞培养

人类单核细胞的白血病THP-1 RPMI 1640培养基培养细胞(美国纽约Gibco,生活技术)补充10%胎牛血清,青霉素(100 U /毫升,Biologival行业,以色列),和链霉素(100毫克/毫升)有限公司37°C的5%₂。所有试剂都添加到培养基中最小体积(< 0.1%)的二甲亚砜(DMSO),并在每种情况下承运人证明不影响测量的参数。对于每一个实验,至少三个独立实验的样品一式三份。

2.3。制备的细胞溶解产物和免疫印迹分析

准备细胞溶解产物,这些细胞被细胞溶解1 h在20毫米Tris-HCl 4°C, 150毫米氯化钠,EDTA 1毫米,1毫米EGTA,特里同x - 100 1%, 1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,和pH值7.4;然后溶解产物离心机在4000 g 30分钟在4°C和上层的保留。样品的细胞溶解产物(80μ克蛋白质)受到10%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳和转移到聚偏二氟乙烯膜(美国纽约笼罩在公司),然后在室温下培养30分钟5%脱脂牛奶Tris-buffered盐水含0.2%渐变20 (TBST)阻止非特异性结合的抗体。所有使用的抗体稀释TBST。膜被孵化一夜之间在4°C兔抗体人脂联素(Abcam;1:2000稀释)或人工phospho-AMPK(细胞信号;1:1000稀释),然后在室温下1 h与辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白抗体(σ;1:5000稀释),结合抗体被发现使用化学发光试剂+(美国欧宁,波士顿,MA)和每个乐队的强度量化使用密度计。抗体AMPK(细胞信号;1:1000稀释)或肌动蛋白(圣克鲁斯;1:10000稀释)被用作加载控制。

2.4。定量实时聚合酶链反应分析

总RNA提取REzol(普鲁泰克技术,火花,NV),根据制造商的指示。单链互补脱氧核糖核酸合成与上标二世逆转录酶(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。执行Q-PCR ABI 7000实时PCR体系,与引物测量脂联素(转发:5′aga亚美大陆煤层气有限公司GAG ATC CAG GTC TTA TTG GT-3′,相反:5′aac GTA AGT CTC CAA太极拳CAC法3′)。实时PCR进行初始变性在94°C 5分钟,其次是变性在94°C 30年代,退火30年代,在62°C和聚合在72°C 30年代总共35周期,然后通过最后一个在72°C扩展了10分钟。mRNA的表达水平被管家基因的表达规范化甘油醛脱氢酶(GAPDH)。

2.5。免疫细胞化学

原位本地化脂联素表达,细胞(控制或细胞治疗24 h TG或Δ2TG)坚持fibronectin-coated封面眼镜在PBS和4%多聚甲醛固定了15分钟。治疗后0.1% Triton x - 100 1分钟,他们对牛血清白蛋白PBS(5毫克/毫升)1 h阻止非特异性结合。这些细胞被孵化与脂联素(1:50稀释;研发系统)抗体在一夜之间在4°C。然后他们被孵化FITC-conjugated二级抗体(1:100稀释;σ)在室温下1 h和DAPI染色(1:6000稀释)10分钟。被观察到的细胞共焦荧光显微镜(EZ-C1;尼康,日本东京)。消极的控制是由省略孵化与初级抗体的细胞。

2.6。Monocyte-Endothelial细胞粘附试验

单核细胞悬浮在4×10的浓度⁵每口井的细胞,无血清培养系统在有或没有TG或Δ2TG (9µ米)18 h。评估的影响脂联素在单核内皮细胞粘性,THP-1细胞preincubated 30分钟与脂联素抗体(英国Abcam)或GW9662或是AMP-dependent蛋白激酶(AMPK)抑制剂化合物C(默克公司)。随后THP-1细胞被标记为1 h在37°C 1毫米BCECF / AM(勃林格曼海姆,曼海姆,德国)在DMSO,然后悬浮在同一介质用于HUVECs文化。的主要文化HUVECs准备如前所述[16]。199细胞生长在介质(美国纽约Gibco) penicillin-streptomycin含有1%,30岁μ克/毫升的内皮细胞生长补充(研发系统、明尼阿波利斯、MN),和10%胎牛血清(的边后卫;生物产业、以色列)在37°C在湿润的气氛中95%的空气中,5%的公司₂。通道1和3之间的细胞用于实验。HUVECs孵化了4 h TNF-α3 ng / mL。对于测试,标记THP-1细胞被添加到4×10⁵附着TNF-α-treated HUVECs 24-well板和孵化1 h,然后不依从细胞被两个温和洗PBS和绑定单核细胞的数量统计的荧光显微镜。

2.7。统计分析

所有的数据表示为均值±SEM。不同群体之间的平均值的差异分析单向方差分析和随后的事后Dunnett测试。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。脂联素的表达是位于巨噬细胞的动脉粥样硬化病变患者和Cholesterol-Fed兔子

探讨脂联素表达与巨噬细胞有关在活的有机体内人类动脉粥样硬化病变,cholesterol-fed兔子被使用并进行免疫组织化学染色检测脂联素的表达。观察脂联素表达主要在人类患者的动脉粥样硬化病变,特别是巨噬细胞的存在,通过抗体识别巨噬细胞(图2(一个))。如图2 (b)正常组,脂联素染色疲软,而cholesterol-fed集团强大的巨噬细胞(图中脂联素染色2 (c))。见高放大,所有的脂联素染色存在于巨噬细胞(图2 (d))。免疫组织化学结果表明脂联素表达与巨噬细胞密切相关。

3.2。TG和Δ2TG增强脂联素mRNA和蛋白表达THP-1细胞

当TG的细胞毒性或Δ2TG THP-1细胞MTT试验检测孵化24小时后,细胞生存能力并不影响1 - 9的存在μM TG或Δ2TG(数据没有显示)。TG来确定最优条件或Δ2TG-induced THP-1脂联素mRNA表达的细胞,我们第一次执行时间响应和剂量反应研究THP-1细胞培养与不同浓度的TG或Δ2TG各种时间间隔。脂联素mRNA表达时间的方式诱导治疗后与9μ米的TG 6、12或18 h (,,,分别地。,of control levels) (Figure3(一个))。造成的感应两个最高的时间进程意义重大。脂联素mRNA表达诱导剂量依赖性的方式治疗后1、3、9μM 18 h TG (,,,分别地。,of control levels) (Figure3 (b))。造成的感应两个最高浓度是重要的。Δ2TG也增强脂联素mRNA表达THP-1细胞在两种时间——(图3 (c),,,,分别地。,of control levels) and dose-dependent manners (Figure3 (d),,,,分别地。,of control levels). To illustrate the expression and cellular localization of the新创脂联素在巨噬细胞蛋白质合成TG或Δ2TG治疗也研究了免疫印迹和免疫荧光染色。THP-1细胞孵化有或没有9μM TG或Δ2TG 18 h;然后进行免疫印迹。TG或Δ2TG治疗导致显著增加脂联素表达(图3 (e))。如图3 (f)未经处理的细胞中,脂联素表达弱(C),而THP-1细胞处理9μM TG或Δ2TG 18 h显示强烈的脂联素表达在细胞质中。在所有后续实验中,除非另有规定,9μM TG或Δ2TG使用。

3.3。通过PPAR TG诱导脂联素mRNA的表达γ端依赖途径而Δ2TG增强脂联素通过PPAR mRNA的表达γ独立在THP-1细胞通路

PPARγ已成为一个关键调节器的脂肪细胞和巨噬细胞的功能。PPARγ激活与潜在影响密切相关的表达和分泌脂联素(8]。检查是否TG的影响或Δ2TG脂联素mRNA表达依赖于PPARγ,我们雇佣了PPARγ拮抗剂,GW9662和废除TG-induced脂联素mRNA表达(图4(一))。相比之下,它没有影响的调节脂联素mRNA表达Δ2TG治疗(图4 (b))。这些数据表明,TG诱导脂联素通过PPAR mRNA的表达γ端依赖途径而Δ2TG增强脂联素通过PPAR mRNA的表达γ独立在THP-1细胞通路。

3.4。TG和Δ2TG增强脂联素mRNA表达THP-1通过AMPK活化细胞

Thiazolidinediones可以激活AMPK在脂肪细胞,增加脂肪氧化和葡萄糖运输途径(17]。THP-1细胞孵化与TG 15 30或45分钟表现出时间增加AMPK的磷酸化。磷酸化的显著增加倍和倍,分别在30分钟和45分钟治疗(图5(一个))。THP-1细胞孵化与TG 1, 3,或9μ米45分钟表现出剂量依赖性增加AMPK的磷酸化。磷酸化的显著增加倍和在3倍μM和9μ分别为米治疗(图5 (b))。细胞治疗Δ2TG,平行的TG处理的结果,显示了AMPK磷酸化增加时间——(图5 (d),,,,分别地。,of control levels) and dose-dependent manners (Figure5 (e),,,,分别地。,of control levels). The phosphorylation of AMPK by both TG and Δ2TG could be abolished by compound C, an AMPK inhibitor (Figures5 (c)和5 (f))。检查是否调节效应的TG和Δ2TG脂联素mRNA表达THP-1细胞是通过AMPK活化,爱卡,AMPK活化剂受雇。爱卡治疗增强脂联素mRNA表达THP-1细胞在时间和剂量依赖性的举止(数字6(一)和6 (b))。复合C, AMPK抑制剂,减少爱卡的影响脂联素mRNA表达(图6 (c))。复合C治疗也减少了TG的调节效应或Δ2TG脂联素mRNA表达(数字6 (e)和6 (f))。这些结果TG -或通过AMPKΔ2TG-increased脂联素mRNA表达介导的磷酸化。

3.5。TG和Δ2TG THP-1细胞的粘附降低TNF-α-Treated HUVECs

探索TG的影响和Δ2TG内皮cell-leukocyte交互,THP-1细胞的粘附TNF-α-treated HUVECs受雇。图中所示7(a),支流HUVECs没有任何治疗(N)孵化THP-1细胞1 h显示最少的绑定,但是附着力显著增加当HUVECs使用3 ng / mL的TNF-α4 h (C)。这种效应显著减少了治疗THP-1细胞9μM TG或者Δ2TG 18 h。评估的参与脂联素在TG或Δ2TG-reduced THP-1细胞的数量一定会TNF-α-treated HUVECs, THP-1细胞与antiadiponectin抗体进行预处理。图中所示70.2,当THP-1细胞被使用μg / mL antiadiponectin抗体1 h,然后孵化与TG或Δ2TG 18 h,绑定的THP-1细胞TNF-α-treated HUVECs是显著高于non-antibody-treated THP-1细胞,表明脂联素起着重要的作用在THP-1细胞的粘附TNF-α-treated HUVECs。此外,GW9662预处理减毒TG-induced巨噬细胞的抑制TNF-α-treated HUVECs。相比之下,它没有影响抑制巨噬细胞的粘附TNF-α-treated HUVECsΔ2TG治疗。TG -和Δ2TG-induced抑制单核细胞粘附抑制了选择性AMPK抑制剂化合物c .综上所述,这些数据表明,TG或Δ2TG-mediated抑制单核细胞粘附TNF-α-treated HUVECs,至少部分的新创THP-1细胞合成的脂联素,AMPK途径。

4所示。讨论

在这项研究中,我们首次展示,TG和Δ2TG有效增加脂联素mRNA表达THP-1细胞剂量和时间的方式。TG和Δ2TG也上调脂联素蛋白表达。此外,新创合成脂联素在巨噬细胞显著减少单核细胞粘附TNF-α-treated HUVECs通过AMPK途径。

脂联素主要由脂肪组织分泌,产生多个保护特性与肥胖、糖尿病、炎症、心血管疾病等(18,19]。脂联素也可检测多种细胞类型,包括内皮细胞、星状细胞和巨噬细胞(4]。目前的研究表明,脂联素表达明显的巨噬细胞在动脉粥样硬化病变cholesterol-fed兔子和人类在心血管疾病的发展。脂联素积累更多最好受伤血管壁比完整的血管。先前的研究表明,脂联素表达的功能在巨噬细胞泡沫细胞可以显著减少甘油三酸酯和胆固醇积累在这些细胞通过减少oxLDL吸收进入细胞而提高HDL-mediated胆固醇流出(20.]。巨噬细胞的治疗用重组脂联素蛋白导致减少活性氧和交换向抗炎表型(21]。一些见解也已通过脂联素基因的超表达的工作保护apoE-deficient老鼠从减少动脉粥样硬化病变形成主动脉窦(22]。这些结果表明,脂联素表达在动脉粥样硬化病变可能发挥重要作用在脂质代谢和胆固醇流出调节脂质代谢信号通路抑制macrophage-to-foam细胞转变。所有这些调查指出,抗炎和antiatherogenic脂联素在动脉粥样硬化的作用。基于这些发现,增加脂联素的方案将为心血管疾病提供新的治疗策略和其他相关疾病。

thiazolidinediones家族的某些成员的过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγ)受体激动剂、TG和ciglitazone等对活性氧具有有益的行动,炎症和adipocytokine失调(23,24]。此外,thiazolidinediones-mediated PPARγ激活可以促进分化的preadipocytes模仿某些基因影响脂肪细胞的胰岛素,调节脂联素的表达和内分泌组织的监管机构(25]。3 t3-l1脂肪细胞治疗TG调节脂联素mRNA表达(26]。目前的研究表明,TG和Δ2TG增强脂联素mRNA和蛋白表达THP-1细胞定量实时PCR,免疫印迹和免疫细胞化学。此外,GW9662 PPAR -γ拮抗剂,对巨噬细胞被发现显著降低TG-induced脂联素mRNA表达而并不影响Δ2TG-induced脂联素mRNA的表达。数据显示,TG强烈增强通过PPAR - THP-1细胞中脂联素的表达γ信号通路,而Δ2TG没有。这些发现表明,脂联素mRNA表达的诱导机制之间的TG和Δ2TG治疗是不同的。Δ2TG的以前的报告表明,结构引入双键毗邻thiazolidinedione环取消产生的分子激活PPAR的能力γ(27]。Δ2TG, PPARγ活动模拟TG,适度比他们的父母更强有力的化合物在抑制细胞增殖的癌细胞(28]。因为TG有一些副作用18],Δ2TG可用作额外的替代药物。然而,进一步的研究需要确定Δ2TG的情感作用和安全的预防和治疗心血管疾病和炎症。

AMPK, fuel-sensing酶,参与调节葡萄糖和脂类体内平衡和胰岛素敏感性可能占观察thiazolidinediones对巨噬细胞的影响(29日,30.]。AMPK在多个组织和表达是由不同的刺激激活增加AMP-to-ATP比率(例如,运动和缺氧)以及激素(如脂联素和瘦素)。此外,罗格列酮已被证明在H-2Kb敏锐地激活AMPK肌肉细胞,当管理的周他们增加AMPK磷酸化和老鼠的肝脏和脂肪组织的活动(31日]。TG可迅速刺激AMPK活性在孤立的哺乳动物的骨骼肌(32]。由于先前的研究表明,脂联素的能力激活AMPK在细胞和肝细胞(33),我们探讨了AMPK磷酸化对脂联素表达的影响在TG或ΔTG-treated巨噬细胞。细胞治疗与TG或Δ2TG显示AMPK磷酸化的增加时间和剂量依赖性的举止。我们还发现,爱卡,AMPK催化剂,提高了脂联素mRNA表达时间和剂量依赖性的方式。相比之下,复合C, AMPK抑制剂,减少TG的调节效应或Δ2TG脂联素mRNA的表达。这些结果表明,TG -或Δ2TG-increased脂联素mRNA表达是通过AMPK介导的信号通路。一个假定的PPARγ必须绑定(PPAR-responsive元素)的网站,C / EBPα,sterol-regulatory-element-binding蛋白质(如),和营地反应元件结合蛋白(分子)出现在人类和小鼠脂联素启动子,和点突变在这个网站可能会导致改变TZD-induced脂联素启动子transactivation [15]。以前的研究报道,罗格列酮促进了调制AMPK-dependent CRTC2 (cAMP-dependent引进的分子调控转录辅激活2)活动影响肝醣类(34]。替米沙坦,血管紧张素ⅱ1型受体(₁)阻断剂,可以增加脂联素通过PPAR在白色脂肪组织生产γ独立的机制,包括AMPK-Sirt1通路的激活35]。准确理解分子机制的AMPK激活参与Δ2TG-increased脂联素mRNA表达需要进一步调查。

单核细胞粘附内皮表面被认为是主要的早期动脉粥样硬化的起始步和炎症(36]。早期的研究表明,重组脂联素的加入对单核细胞粘附蛋白有显著抑制作用,在TNF-α-treated内皮细胞粘附分子的表达37]。也被报道,脂联素可以抑制动脉粥样硬化炎症过程和通过抑制单核细胞/巨噬细胞的迁移和转换成巨噬细胞泡沫细胞在血管壁5,6]。在目前的研究中,TG和Δ2TG monocyte-EC粘附在炎症条件下减少,这种效应是通过增加脂联素表达介导的。由antiadiponectin抗体的影响被封锁。结果表明,单核细胞粘附是减少了脂联素表达的依赖性。这些抑制单核细胞粘附的影响也废除了AMPK抑制剂的存在,复合c与之前的研究一致,AMPK磷酸化参与单核细胞粘附的抑制38]。目前的研究表明,TG的抑制效果和Δ2TG单核细胞粘附TNF-α-treated HUVECs是通过介导的新创脂联素表达和激活AMPK信号。的基础上的脂联素可能参与单核细胞招聘早期动脉粥样硬化病变,我们发现一个额外的机制TG和Δ2TG治疗可能是重要的预防炎症和动脉粥样硬化的进展。

总之,本研究首次记录TG和Δ2TG可以上调脂联素的表达和功能在人类单核细胞/巨噬细胞。此外,调节脂联素的表达通过TG和Δ2TG抑制单核细胞粘附通过激活AMPK TNF-α-treated内皮细胞信号通路。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢贾谊小姐唱做实验和八核心实验室和癌症登记处的工作人员,医疗信息管理办公室,国立台湾大学医院。这项工作是支持的资助(NSC 101 - 2314 - b - 002 - 042和102 NSC - 2314 - b - 002 - 031)从美国国家科学委员会,台湾。金融赞助商在任何方面没有发挥作用的研究。