文摘

本研究旨在比较几种制剂的抗炎作用在活的有机体内,即一种合成抑制剂的NF -κB级联,脂溶性抗氧化剂,胸腺肽thymulin。LPS-treated小鼠细胞因子反应分析与下列参数:合成的诱导HSP72和热休克蛋白质的形式α;活动的NF -κB和SAPK /物信号通路;和TLR4的表达。雄性小鼠使用Inflammation-bearing Balb / c IKK——的抑制剂α/β激酶(第十二IKK抑制剂);thymulin;与饮食辅酶Q₉,α生育酚,β胡萝卜素;或抑制剂的组合和肽或抗氧化剂。inflammation-bearing同类抗炎效果观察小鼠分别与thymulin或膳食抗氧化剂对前两周的日常管理有限合伙人的待遇。当LPS-injected老鼠对待抑制剂和抗氧化剂在一起,无论是血浆细胞因子信号蛋白、热休克蛋白恢复更有效地比老鼠分别用这些药物治疗。抗氧化剂饮食相比,thymulin显示其增加的影响第十二IKK抑制剂在预防IKK激活LPS-treated老鼠。

1。介绍

核因子(NF -κBκB)家庭由转录因子能够激活多种细胞压力(1]。转录因子NF -κB细胞反应的是一个关键的组件损坏,压力,和炎症(2,3]。NF -κB蛋白由5单元,结合DNA作为一个二聚体;最常见的子单元是p65 / p50异质二聚体。NF -κB通过规范化途径激活是由抑制性κB(我κB)激酶(IKK)激活在回应各种致病因素(4]。我激活IKK磷酸化的抑制蛋白κB,这导致我κB的降解,从而允许NF -κB可能促使核和诱导炎性分子的合成。研究利用酶活动的直接封锁IKK的物或p38 MAPK演示了这种治疗方法的巨大潜力引起抗炎作用。不同的信号通路的选择性抑制剂,包括NF -κB级联,因此可能有用的治疗炎症。我们最近报道,合成抑制剂的toll样受体4(地),压力激发了蛋白激酶物(SAPK /物,和NF -κB信号(cli - 095、SP600125 IKK抑制剂第十二,resp)。减少了在体外有限合伙人对264.7 macrophage-like原始细胞的影响。在这三个研究抑制剂,抑制NF -κB级联,第十二IKK抑制剂,已被证明是最有效的抗毒素的代理在体外(5]。

第一本研究的目的是确定第十二IKK抑制剂是否有效在活的有机体内时,这种抑制剂的有效性是如何影响与其他抗炎剂结合使用。为了解决这些知识空白,我们使用小鼠模型的急性感染性炎症引起的有限合伙人的革兰氏阴性细菌大肠杆菌。大量研究报道增加活性氧的生产在脓毒症。众所周知,相互之间存在相互活性氧和NF -κB信号(6]。因为抗氧化剂不是单独行动,但表现为协同作用,维生素E,泛醌Q₉,β胡萝卜素是添加到动物的饮食。此外,为了获得更多的了解每个脂溶性抗氧化的影响,我们研究了辅酶Q₉,α生育酚,β胡萝卜素在细胞模型中。之前我们已经表明,氧化应激与急性炎症是可以预防的混合膳食脂溶性抗氧化剂辅酶Q₉,α生育酚,β胡萝卜素(7]。本研究的第二个目的是为了测试这些抗氧化剂可以加强IKK抑制剂十二活动。

最后,第三的研究目的是筛选的抗炎活性IKK第十二抑制剂结合胸腺肽thymulin。这种肽已经报道的活动不仅在胸腺还在血液中,影响extrathymic免疫细胞(8]。目前,胸腺肽的作用在感染性炎症的控制尚不清楚。它已经表明,胸腺肽会影响信号通路在正常条件下和系统性炎症(9]。其他作者认为胸腺肽的抗炎作用的机制,包括thymulin,可能涉及NF -κB和p38信号级联,在炎症(扮演至关重要的角色10,11]。最近我们已经证明thymulin在体外和在活的有机体内影响了NF -κB级联配合生产促炎细胞因子、一氧化氮、热休克蛋白在免疫细胞(12,13]。我们提出,抗氧化剂和/或thymulin可以作为佐剂,加强第十二IKK抑制剂的抗炎效果。

2。材料和方法

2.1。协议的实验

两个独立的一系列在活的有机体内实验进行。第一个系列包括七个组,每组4组成的老鼠,这项研究的结果显示在数字1和2。执行在另一个点的时候,第二个系列包括五组,每组4组成的老鼠,这项研究的结果显示在数字3和4。

2.2。动物,动物炎症模型、饮食、Thymulin,抑制NF -κB级联

雄性Balb / c小鼠8 - 10周大(g) 25日- 27日维持在标准实验室条件下(20 - 21°c, 10 - 14 h光暗周期,和65%的湿度)提供食物和水随意。标准的食物颗粒含有均衡的饮食与蛋白质,维生素和矿物质。程序遵循的伦理委员会批准的机构,并按照指南的护理和使用动物的伦理行为。饮食富含β胡萝卜素(2毫克/公斤体重),α生育酚(2毫克/公斤体重),和辅酶Q Q₉(8毫克/公斤体重)管理每日15天前有限合伙人的待遇。抗氧化剂都购自σ,美国。考虑使用的抗氧化剂公式近似水平的这些抗氧化剂在动物的组织14- - - - - -16),这样每个化合物没有超过在小鼠体内的生理水平。抗氧化剂混合搅拌成2 g的丸,每日上午8点之前喂养;抗氧化剂单独每个老鼠喂食。早上喂之前,其他组动物喂养丸没有抗氧化剂。

炎症是引起一腹腔内注射脂多糖(LPS)大肠杆菌(血清型026。B6,“σ”,美国)(2.5毫克/公斤体重)。Thymulin解决方案(1.5毫克/公斤)腹腔注射1.5人力资源有限合伙人治疗前和制备血清胸腺因子(美国美国肽),ZnCl的克分子数相等的浓度₂是补充道17]。第十二IKK抑制剂,在浓度范围从5到20毫克/公斤前腹腔注射1 h有限合伙人的待遇。老鼠斩首LPS注射后6 h与相应的对照组。所有测量进行了单独为每个鼠标,用九个复制。

2.3。血浆和细胞

等离子体是孤立的从血液收集在动物的斩首。血液样本保存3 - 5 h在4°С和离心机在200克;浮在表面的细胞因子分析被收集。199年从脾脏淋巴细胞分离介质(美国σ)含1% 1 M消息灵通的解决方案,100年μg / mL链霉素,10%胎牛血清。红血球细胞溶解在Tris-buffered氯化铵与0.15米(0.01米Tris-HCl NH氯化钠- 0.83%₄Cl, 9: 1)。洗后,样本存储在一个集中的1×10⁸细胞/毫升RPMI 1640中等−20°C到西方墨点法。

2.4。ELISA

ELISA用于确定在血浆细胞因子的浓度。肿瘤坏死因子- ELISA开发工具包老鼠α,il - 1αil - 6, IL-17、il - 10和干扰素-γ(美国Peprotech)。想象绑定,100μ美国L abt绿色染料(σ)溶解在0.05柠檬酸缓冲(pH值4.0)与0.01%过氧化氢是补充道。光密度测量在405 nm板分光光度计(多屏幕前,热电子公司)。

2.5。免疫印迹分析

准备标本,1×10⁸脾细胞细胞溶解使用超声粉碎机与恒定搅拌2分钟。每个样本的总蛋白浓度是由布拉德福德的方法。每个样本中的蛋白质被沉淀在丙酮、水溶性,煮5分钟,储存在−70°C。解决了蛋白质电泳凝胶超过10%的页面,然后从凝胶转移到硝酸纤维素(通用电气医疗集团,Amersham,英国)transblot室。阻塞后,膜暴露了2小时以下鼠标蛋白质抗体:HSP70抗体(兔子anti-mouse HSP 72年克隆spa - 812诱导形成,StressGen),一半抗体(兔子anti-Hsp90α[Hsp86], StressGen), phospho-NF -κB抗体(phospho-NF -κ536 B p65 (Ser), # 3031,细胞信号技术,丹弗斯,MA),兔子磷的IKKα/β第二抗体(Ser 176/180(细胞信号技术,美国),兔子phospho-SAPK /物抗体合成phospho-peptide SAPK /物,或兔子TLR4抗体(# 2246,细胞信号技术,美国)。洗后,硝化纤维膜被孵化的1小时anti-rabbit生物素化的抗体(杰克逊ImmunoResearch西树林,PA)和peroxidase-conjugated链霉亲和素增加了1小时。加载控制是兔单克隆抗体合成肽羧基端附近的人类glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)(细胞信号)。ECL-plus化学发光的鸡尾酒(Amersham / GE)被用来开发这些墨迹根据制造商的指示,然后污点是暴露于电影。蛋白质的定量评价乐队当时使用Qapa执行计算机程序(Pushchino、俄罗斯)。

2.6。在体外添加抗氧化剂

五十μM辅酶q 10μ米α生育酚,或10μ米β胡萝卜素被添加到培养介质water-alcohol乳剂(Q₉和α生育酚)或water-Tween 85乳液(β胡萝卜素)。样品与介质只补充等量的酒精或渐变85作为控制。细胞培养24 h在37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂。在所有情况下,最终的酒精和渐变85浓度不超过1%的控制或实验样本。

2.7。血糖测量

血糖水平在所有化验组老鼠在操作之前,1,2,后6 h有限合伙人的待遇。在葡萄糖测量,尾巴尖(2 - 3毫米)切除和按摩收获血液体积小(1.0 -10μL)是放在血糖测试条的孔(Accu-Chek性能、德国)。葡萄糖测量得到使用快速血糖仪(Accu-Chek性能、德国)。

2.8。统计分析

统计分析了使用Statistica /赢得6.0软件(塔尔萨,好吧)。单向方差分析(方差分析),后跟一个事后图基测试是用来确定组间差异的意义,值≤0.05被认为是重要的。所有的值被表示为手段(±SE)。

3所示。结果

初步实验研究揭示每个使用的抗氧化剂的能力(β胡萝卜素,α生育酚,辅酶Q Q₉)在小鼠腹腔巨噬细胞消除活性氧。众所周知,氧化应激与LPS处理导致促炎细胞因子的反应,包括极TNF -α生产(18]。所以,我们测试的保护作用的抗氧化剂通过测量TNF -的生产α水平LPS-treated巨噬细胞如表所示1。

一系列的观测结果强烈表明,单独添加泛醌,α生育酚,β胡萝卜素的培养基在体外在LPS-treated巨噬细胞显著降低TNF生产。此外,三个化合物混合效果更为显著,表明脂溶性抗氧化剂之间协同互动。

在每一个实验组,血糖水平下降到70% - -80%相比,控制有限合伙人治疗后一个小时,但迅速恢复到控制水平,在2和6的h。此外,没有发现血糖水平的实质性差异实验群体之间(数据没有显示)。我们可以假设一个glucose-independent制剂的抗炎作用机理研究。

3.1。膳食抗氧化剂和第十二IKK抑制剂的影响LPS-Treated小鼠免疫力

3.1.1。小鼠血浆细胞因子在LPS-Treated Presubjected膳食抗氧化剂和第十二IKK抑制剂

检查大量的促炎与急性炎症分子和抑制剂和饮食的保护作用,同时测定血浆细胞因子浓度在七个鼠标第十二组IKK抑制剂处理,膳食抗氧化剂,或组合。有限合伙人单独治疗导致预期增加血浆促炎细胞因子(例如,il - 1α干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α)。有超过2倍增加血浆TNF -α水平和干扰素-增加三倍以上γ水平(图1)。

此外,抗炎细胞因子il - 10的水平增长了约1.5倍。这一发现表明,有限合伙人的同意之前报道的数据在活的有机体内增加在腹膜老鼠巨噬细胞il - 10生产(7]。

在老鼠身上使用不同浓度的第十二IKK抑制剂,血浆细胞因子值显著下降,最大的效果是观察到的浓度为20毫克/公斤。老鼠的预处理与膳食抗氧化剂影响细胞对有限合伙人的反应;细胞从老鼠处理富含抗氧化剂的食物,血浆细胞因子值降低(图1)。应该注意的是,抗氧化剂的影响在炎症反应的细胞因子抑制生产低于IKK抑制剂诱导的影响;区别,然而,对il - 1是具有统计学意义α、il - 10和干扰素-γ值。此外,当老鼠同时暴露在抑制剂和抗氧化剂,非相加效应从IKK抑制剂和膳食抗氧化剂被观察到。

3.1.2。信号和压力蛋白质LPS-Treated老鼠Presubjected膳食抗氧化剂和第十二IKK抑制剂

检查的范围NF -кB激活与炎症有关,磷酸化二聚体的水平p65 / RelA和磷酸化IKK -α/β测定脾淋巴细胞的免疫印迹。有一个磷酸化p65超过2倍增加,这与显著增加(超过7倍)的磷酸化水平IKK在这些细胞(图2)。老鼠的预处理分别与抑制剂或膳食抗氧化剂显著减少的磷酸化p65和我кB的组合抑制剂和抗氧化剂并没有导致添加剂效果。

阐明一个重要的角色LPS受体TLR4,我们分析了细胞TLR4利用免疫印迹分析水平。如图2,LPS诱导的预期在脾细胞TLR4水平显著增加。然而,在老鼠的细胞进行预处理与第十二IKK抑制剂或抗氧化剂,这些增加的TLR4表达完全去除,表明TLR4途径可以通过NF interregulated -кB信号以及氧化还原平衡。

另外,评估的压力反应水平LPS-treated老鼠,两种诱导热休克蛋白的表达,Hsp72和一半б,在脾淋巴细胞进行了研究。LPS诱导一半寿命增长4倍增加Hsp72表达和超过8倍(图生产2)。再一次,老鼠的预处理与第十二IKK抑制剂或抗氧化剂导致Hsp72和一半的完全消融α峰值在细胞注射LPS。此外,这两个同时应用治疗没有相互交互,展示的测量的热休克蛋白,细胞因子和信号蛋白。

3.2。Thymulin的影响和第十二IKK抑制剂LPS-Treated小鼠免疫力

3.2.1之上。小鼠血浆细胞因子在LPS-Treated Thymulin和第十二IKK抑制剂

第十二thymulin是否有或没有IKK抑制剂可以表达下调在活的有机体内有限合伙人,血浆il - 6的值,IL-17,干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α测量LPS-injected老鼠使用五个老鼠组表示在图的传说吗3。注意,其他的细胞因子在这些实验测试小组对thymulin活动基于我们之前的数据。事实上,这些细胞因子是倾向于thymulin控制(19]。

基于上述结果,20毫克/公斤抑制剂的最佳浓度是本系列实验研究中使用的综合效应thymulin第十二IKK抑制剂。这些实验证实,增加血浆TNF -α水平有限合伙人治疗后发生,支持实验的结果显示在图中1。第十二IKK的预处理与thymulin或抑制剂降低TNF -的积累α在等离子体。血浆TNF -的浓度α在老鼠身上使用抑制剂和thymulin没有显著不同于以LPS-treated老鼠。有超过三倍增加等离子体干扰素-γ在小鼠只有有限合伙人;第十二IKK抑制剂和thymulin阻止了这一增长。抑制剂的组合效果和防止thymulin LPS-mediated增加等离子体干扰素-γ没有大于每个代理的个人活动。

在这些实验中,我们发现在il - 6的浓度显著增加LPS-treated老鼠,由预处理部分但不是显著降低小鼠与第十二IKK抑制剂或thymulin,证明这些治疗不能完全切除血浆il - 6水平。重要的是要注意,当这两个特工被一起接种,il - 6水平仍不完全正常化。此外,有超过三倍增加等离子IL-17 LPS-treated老鼠,但抑制剂和thymulin,单独或结合,不能防止IL-17的增加(图3)。

3.2.2。信号和压力蛋白质LPS-Treated老鼠受到Thymulin和第十二IKK抑制剂

从第一个系列实验结果相似,治疗小鼠有限合伙人导致增加RelA和IKK(图的磷酸化4)。

第十二Thymulin特别是IKK抑制剂减少IKK磷酸化。有趣的是,与单独的治疗与肽或抑制剂相比,联合治疗与thymulin抑制剂导致的保护作用明显增加针对预防过度IKK磷酸化。之前它已经表明,第十二IKK抑制剂在体外影响SAPK /物264.7原始细胞通路(5]。检查在活的有机体内抑制剂的影响和thymulin SAPK /物信号的活动,磷酸化水平SAPK /物测定淋巴细胞从5动物组。264.7线性原始细胞相比,生成两个磷酸化亚型,JNK1 JNK2,体外细胞只表达一个形式的磷酸化SAPK /物。LPS诱导约7倍增加SAPK /物磷酸化,并分别在老鼠thymulin或第十二IKK抑制剂治疗,磷酸化SAPK激增/物明显减少。应该注意的是,联合治疗thymulin和抑制剂导致求和的效果和正常化SAPK /物磷酸化。

也有减少细胞Hsp72表达细胞inflammation-bearing老鼠使用thymulin或抑制剂(图4)。总的来说,这些数据表明,药物抑制IKK / NF -кB和SAPK /物激活导致的衰减LPS-related炎症。

4所示。讨论

在过去的十年里,NF -的抑制剂кB信号通路,第十二IKK抑制剂,已发现并追究其临床潜力在炎性疾病18]。这种抑制剂合成小疏水分子可以自由渗透进入细胞。第十二IKK抑制剂,cell-permeable amino-diarylbenzamide化合物,作为一个潜在的靶向抑制剂对IKK-1和IKK-2 ATP网站。第十二IKK抑制剂,有趣的是,NF -的选择性抑制剂к通过减少NF - B信号功能кB磷酸化,从而减少易位的NF -的概率кB到细胞核,也防止SAPK /物激活LPS-treated细胞(图2)。这些结果与发现证明SAPK /物信号是由NF -кB通路(20.,21]。事实上,它通常是建议NF -кB激活中起关键作用LPS-induced反应的抑制NF -кB途径活性使其激活的转录的能力广泛的免疫相关基因编码的蛋白质。它也知道靶向IKK也可能影响其他途径除了NF -кb .例如,IKK影响p53, FOXO3A, HIF-1除了NF -кB (22,23]。

我们证明了药物抑制IKK / NF -кB通路通过第十二IKK抑制剂延迟促炎反应LPS-treated老鼠。因此,许多流程所示改变小鼠发生炎症,包括细胞因子的增加生产,热休克蛋白的刺激和TLR4的表达,和NF -的激活кB和SAPK /物信号,至少部分纠正在活的有机体内NF -кB抑制。这一发现提供了额外的实验证据表明,增加了NF -кB活动起着因果作用LPS-related炎症。

我们的数据表明,饮食补充抗氧化剂防止NF -кB激活小鼠接受有限合伙人。应该注意的是,一些以往的研究使用类似动物炎症模型表明,预处理与抗氧化剂防治或防治结合α生育酚之前内毒素管理导致减少在NF -кB激活(24,25),降低TNF -α释放,增加生存(26]。此外,政府和维生素E的防治作用β胡萝卜素减少脂质过氧化反应和恢复大鼠内毒素的谷胱甘肽水平(27]。此外,它是证明了基因减少NF -кB减少了mitochondrial-derived ROS (28]。

在目前的研究中,我们假设辅酶Q的过度饮食,连同其他脂溶性维生素,可能是非常有用的独特性能泛醌抑制胆固醇的合成,从而提高膜流动性。显著降低胆固醇合成和随后的胆固醇浓度下降的细胞膜被观察到在老鼠的饮食补充辅酶Q Q₉。另外,胆固醇合成的抑制淋巴细胞培养在体外辅酶Q₉证明(29日,30.]。有趣的是,我们的数据表明,preintervention与膳食抗氧化剂减少炎症反应的大小,但饮食没有放大第十二IKK抑制剂的影响。这些结果表明非相加第十二IKK抑制剂和膳食抗氧化剂的抗炎作用显示研究了抑制剂的抗氧化活性。因此,理论上可以假定有一个巧合的保护机制之间的相互作用抑制剂和抗氧化剂,这可能都是通过减少活性氧介导。这种假设是符合最近的数据表明抑制NF -кB活动减少氧化应激和损伤在体外和在活的有机体内(28]。

胸腺肽thymulin, metallopeptide组成的九肽(Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp)夫妇与锌离子,主要有抑制免疫反应的影响12,31日]也刺激内分泌系统,说明它的作用在经济复苏从炎症条件32]。使用thymulin作为immune-modulator第二实验线,我们测试了细胞因子的曲目,包括il - 6和IL-17。尽管IL-17超过15年前被称为CD4的产物⁺T细胞,这是最近才证明IL-17优先生产的T细胞的一个子集,特别是Th17,这已被证明在自身免疫性疾病的发病机制是非常重要的。此外,它已被证明最近thymulin显著减少小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎急性的疾病严重程度(33]。IL-17和il - 6是重要的在许多疾病的特点是免疫自我识别,和il - 6是诱发Th17细胞的分化(19,34),但Th17细胞在感染性炎症的作用尚不清楚。我们证明了独立管理抑制剂和thymulin或其组合不显著改变等离子体IL-17浓度。其他细胞因子,即tnf和IFN-gamma显著降低小鼠使用thymulin,第十二IKK抑制剂,或组合。这些数据支持了假设Th17细胞不会发挥积极作用在LPS引起的炎症发病机制。血浆细胞因子观测当然不能提供一个完整的图片关于应对损害。可能暂时分化细胞因子的释放,释放的程度和利用对不同的细胞因子似乎非同步的。事实上,据报道,在人类内毒素静脉管理后,慢慢增加血浆il - 6与血浆tnf (35,36]。

交替、监控短暂的蛋白质在细胞信号和压力使细胞反应的更完整的评价。事实上,抑制IKK / NF -к使用IKK B通路抑制剂十二延迟NF -磷酸化两个独立的步骤кB信号、IKK和p65。此外,激活SAPK /物的途径也减少了从LPS-plus-inhibitor-treated老鼠细胞中。本研究的结果表明,thymulin提高第十二IKK抑制剂的活动。综上所述,这些研究结果表明,减少NF -кB活动同时使用thymulin和第十二IKK抑制剂减少炎症反应在活的有机体内。的抑制NF -к使用thymulin + NF - BкB抑制剂提供了我们认为小说延迟策略或衰减炎性疾病患者SIRS(全身炎症反应综合征)或脓毒症。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

支持的工作是项目“分子和细胞生物学”和俄罗斯基础研究基金会的项目没有。13-04-00378。作者感谢自然出版集团语言编辑服务帮助语言编辑。