文摘

系统性和intraplaque生物标志物在临床广泛调查人群心血管脆弱性的作为有前途的替代参数。在本试验研究中,我们调查了如果系统性和intraplaque钙化生物标志物水平的影响与他汀类药物治疗的严重颈动脉狭窄患者和无症状的缺血性中风。患者他汀类药物治疗降低了血清骨桥蛋白(OPN), RANKL / osteoprotegerin(功能)的比率,和MMP-9 / pro-MMP-9活动比未经处理的病人。剩的病人表现出增加胶原蛋白水平和减少中性粒细胞浸润在颈动脉斑块的下游部分比未经处理的控制。功能在上游斑块的部分,内容增加心血管剩患者比控制。其他组织学参数(如脂质、巨噬细胞、平滑肌细胞和MMP-9内容)以及RANKL、等级和功能mRNA水平患者两组之间没有差别。血清RANKL /功能比与血清水平呈正相关的中性产品,intraplaque嗜中性粒细胞,在下游部分颈动脉斑块和MMP-9内容。总之,他汀类药物治疗与改善血清RANKL水平和降低中性粒细胞活动系统和动脉粥样硬化斑块。

1。介绍

动脉粥样硬化斑块钙化是一个共同的过程中先进的动脉粥样化形成,尽管它与增加斑块易损性仍不清楚。一方面,冠状动脉钙评分(CAC)显示改善弗雷明汉风险评分预测中间风险个人(1)和中风的一个独立预测受试者认为在低风险(相应的基于临床传统风险集中工具)(2]。另一方面,从人类组织学检查发现颈动脉粥样硬化斑块显示症状性动脉粥样化的特点是减少水平的钙化和增加比无症状炎症斑块(3]。此场景进一步复杂化最近建议,“intraplaque脆弱性”只是视为心血管风险(即多个因素之一。,intraplaque, circulating, and peripheral tissue risk factors), suggesting the importance of defining systemic risk biomarkers and of understanding their pathophysiological role [4,5]。潜在的“系统性”intraplaque钙化的生物标志物包括骨桥蛋白(OPN) osteoprotegerin(功能),配体和受体激活核因子kB (RANKL) [6- - - - - -8]。在这种背景下,我们最近发现,RANKL促进脱粒解放proatherosclerotic产品中性粒细胞(9]。值得注意的是,特定anti-RANKL中和抗体的临床应用(即。,denosumab) have been developed and are currently investigated as a way to block skeletal bone resorption in cancer diseases [10]。因为心血管结果没有视为端点在癌症相关试验(11),这些治疗的潜在影响动脉粥样化形成化合物仍然难以捉摸,和知道传统antiatherosclerotic治疗可能影响RANKL信号仍然是一个悬而未决的问题。

因此,在这项工作中,我们研究了anti-RANKL 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme的潜在影响(β)还原酶抑制剂(他汀类药物)严重颈动脉斑块狭窄患者和无症状的急性缺血性疾病。

他汀类药物是最常见的降脂药物在世界范围内,预防心血管疾病的建议12]。antiatherosclerotic的影响不仅包括血脂的改善,还额外“效”活动(如抗炎、抗氧化和免疫调节活动),所有有助于稳定动脉粥样硬化斑块(13,14)和减少全身动脉粥样硬化的因素,如c反应蛋白(CRP) (15]。由于这些原因,他汀类药物可能会非常有前途的候选人可能减少系统性和intraplaque RANKL水平和/或生物活性(中性粒细胞激活)先进的动脉粥样硬化。

2。方法

2.1。病人和研究设计

我们进行了一项观察性队列研究单个医院2010年12月至2011年11月(圣马蒂诺医院)在热那亚(意大利)。患者()进行颈动脉内膜切除术(CEA)额外的颅高档颈内动脉狭窄腔的狭窄(> 70%)(4- - - - - -6)和缺血性中风被包括在研究无症状。病人被定义为无症状的缺血性症状,当他们没有历史没有脑坏死迹象与扩散磁共振成像(MRI)序列。排除标准是恶性高血压、急性冠状动脉疾病、心律失常、充血性心力衰竭(II、III和IV NHYA类)、肝或肾功能障碍或功能异常、急性和慢性感染性疾病,自身免疫性和风湿性疾病、骨质疏松症、癌症、内分泌疾病、炎症性肠道疾病和抗炎(除了阿司匹林)药物,口服抗凝治疗、激素和细胞因子或生长因子疗法。

动脉内膜切除术的前一天,血样从这些患者在禁食状态通过外周静脉穿刺收集血清和血浆和血液参数进行评估。药物的报道在表12个月没有修改之前报名。在队列中,患者接受治疗他汀类药物()而没有他汀类药物的患者()对系统性和intraplaque炎症和血管参数。患者采取不同的他汀类药物和剂量见表2。圣马蒂诺医院医学伦理委员会批准了这项研究,和参与者提供书面知情同意。这项研究是进行符合《赫尔辛基宣言》。

2.2。能力评估

动力计算是基于之前发表的文献[16,17]。样本容量下(26患者他汀类药物和12名患者没有服用他汀类药物)允许我们探测大尺度效应(> 0.80)系统性炎症标记物或intraplaque参数之间有症状和无症状的患者80%的力量,采取双边第一类误差为5%。

2.3。系统性炎症标记物检测

血清c反应蛋白(CRP),骨桥蛋白(OPN) osteoprotegerin(功能)、髓过氧化物酶(MPO)、基质金属蛋白酶(MMP) 8日MMP-9,的金属蛋白酶组织抑制剂1 (TIMP) TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4,和MMP9 / TIMP-1水平比色测定的酶联免疫吸附试验(ELISA),从研发系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州),制造商的指示。血清RANKL水平衡量ELISA (BioVendor GmbH,海德堡,德国),制造商的指示。血清中性粒细胞弹性蛋白酶水平评估ELISA (Bender医疗系统GmbH,维也纳,奥地利),制造商的指示。的极限为CRP检测0.78 ng / mL, OPN 0.312 ng / mL,功能0.0625 ng / mL, MPO 0.156 ng / mL, MMP-8 0.156 ng / mL, MMP-9 0.312 ng / mL, TIMP-1 0.156 ng / mL, TIMP-2 0.156 ng / mL, TIMP-3 0.0625 ng / mL, TIMP-4 0.0781 ng / mL, MMP / TIMP-1 0.0469 ng / mL, RANKL 31.25 pg / mL,中性粒细胞弹性蛋白酶的0.156 ng / mL。意味着内部和interassay变异系数(CV)对所有标记低于8%。葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇和高密度脂蛋白(HDL)胆固醇在mg / dL经常测量和表达。血清胰岛素和c -肽经常测量和μ/ L和表达μ分别g / L。

2.4。Pro-MMP-9 Zymographic化验

Pro-MMP-9 zymographic活动在人类血清进行评估,如前所述[18]。9%的SDS-polyacrylamide凝胶共聚凝胶(σ,圣路易斯,密苏里州)。等量的病人血清(2μL,储存在−80°C)和1 ng重组pro-MMP-9标准(Calbiochem、苜蓿、瑞士)加载到凝胶没有减少代理。然后,凝胶被冲洗,沾Coomassie蓝色的r - 250。Zymographic结果表示为pro-MMP-9蛋白水解活性和计算的基础上,下面的公式:血清pro-MMP-9 =,在那里和在凝胶强度产生的裂解领域通过样品和标准pro-MMP-9和是标准的体重(1 ng) pro-MMP-9加载到凝胶。Zymographic数据表示为ng / mL的血清。用凝胶Gelatinolytic乐队测量分析系统(GeneGenius Syngene,剑桥,英国)。

2.5。人类的颈动脉斑块标本处理

手术切除后不久,颈内动脉斑块标本被从所有的病人,并立即在4°C转移到实验室进行处理。颈动脉斑块钙化的形态先进lipid-rich非细胞病变的核心。颈内动脉斑块标本将垂直地长轴通过最大狭窄的点获得两份(上游和下游血流)[18]。每个部分进一步把中间的长轴垂直地分为两个子分段。一半在液氮和存储snap-frozen−80°C的mRNA隔离,而另一半在cryoembedding冷冻介质进行组织学分析。

2.6。免疫组织化学

冰冻的上游和下游人类颈动脉标本连续切成八7μ105年米部分每一部分分开μ互相m [18]。部分被固定在丙酮和应用特定的抗体,反平滑肌肌动蛋白(稀释:1:100;斯特鲁普Dako公司、丹麦),反CD68(稀释:1:100;Dako公司)、反CD66b(稀释:1:50;贝克曼库尔特尼翁,CH),反基质金属蛋白酶(MMP) 9(稀释:1:250;Sothern生物技术、伯明翰、AL)、反功能(稀释:1:20;研发系统)和反RANKL(稀释:1:20;研发系统)。量化与MetaMorph软件进行。结果这些参数计算和表达为染色面积的百分比总损伤面积或毫米上的浸润细胞数量²的病变区域。

2.7。油红O染色脂质含量

八个部分每一部分(上游和下游血流)人类的颈动脉斑块是沾油红O,如前所述[18]。部分与迈耶的hemalum复染色并在蒸馏水冲洗。量化与MetaMorph软件进行。数据计算总损伤面积染色面积的比率。

2.8。小天狼星红染色胶原蛋白含量

八个部分每一部分(上游和下游血流)人类的颈动脉斑块用水冲洗和孵化0.1%天狼星红(密苏里州圣路易斯西格玛化工有限公司)在饱和苦味酸90分钟。部分是冲洗两次0.01 N HCl 1分钟,然后浸在水里。与乙醇脱水后30秒和cover-slipping,相同的部分拍摄普通多色或偏振光显微镜下曝光设置。多色的灯光下总胶原蛋白含量是评价。间质胶原蛋白亚型进行评估使用偏振光照明;在这种条件下厚I型胶原纤维出现橙色或红色,而薄III型胶原纤维是黄色或绿色16]。量化与MetaMorph软件进行。数据计算总损伤面积染色面积的百分比。

2.9。实时rt - pcr

总mRNA孤立与三试剂(MRC Inc .)从上游或下游人体颈动脉斑块标本。逆转录执行使用ImProm-II逆转录系统(Promega,麦迪逊,WI)根据制造商的指示。执行实时PCR (StepOnePlus,应用生物系统公司)与绝对QPCR混合(ABgene)。

特定的引物和探针(表3)被用来确定等级的mRNA表达,RANKL、功能,和RPS13(管家基因)。的褶皱变化mRNA水平计算比较C_t方法。测量C_t价值观第一RPS13内部控制规范化,通过计算三角洲C_t(ΔC_t)。这是通过减去RPS13C_t值感兴趣的基因C_t价值。δδC_t(ΔΔC_t)计算减去指定基线对照组ΔC_t从研究小组Δ价值C_t值。的ΔΔC_t然后绘制相对褶皱变化用以下公式:。

2.10。统计分析

动脉内膜切除术之前病人特点介绍了一天。对缺血性中风患者无症状和他汀类药物治疗相比,患者没有他汀类药物使用皮尔逊卡方检验或确切概率法(在适当的时候)的比较定性变量。的Mann-Whitney非参数测试是用于连续变量的比较。结果表示为中位数(四分位范围(差))。斯皮尔曼等级相关系数是用来评估血清RANKL /功能之间的相关性比和水平的血清中性粒细胞产品和intraplaque参数在颈动脉粥样硬化斑块的上游和下游地区,分别。的值(双尾)被认为是重要的。所有分析都是用GraphPad Instat软件版本3.05 (GraphPad软件)。

3所示。结果

3.1。基线人口特征

的临床特征、实验室参数,和药物的患者无症状严重颈动脉狭窄()如表所示1。病人下没有显著差异或没有与他汀类药物治疗的年龄,性别,传统心血管危险因素,血液参数,和药物除了轻微的但重要的(剩组)减少循环单核细胞计数。表2总结了他汀类药物使用的病人和他们的用量。只有与低剂量的他汀类药物治疗19在本研究调查(表2)。

3.2。他汀类药物治疗与调制相关的血清水平的钙化生物标志物和MMP-9

本研究的首要目标是确定他汀类药物治疗与心血管风险因素的系统性水平的改善,钙化生物标志物,和嗜中性粒细胞脱颗粒产品,c反应蛋白是第一个生物标志物进行分析。剩患者类似的血清CRP水平相比statin-untreated控制(表4)。钙化生物标志物,血浆OPN水平和RANKL均明显降低,而功能增加心血管剩病人与他汀类药物的病人。符合观察到的变化在RANKL和功能水平,RANKL /功能比率(表明循环RANKL免费分数)显著减少心血管剩病人比控制。对中性粒细胞脱颗粒产品,我们没有发现任何区别两个患者组血清MPO、中性粒细胞弹性蛋白酶,MMP-8水平和保护的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1 2、3和4)(表4)。然而,MMP-9水平和pro-MMP-9活动显著降低接受他汀类药物治疗的病人中,相比那些没有他汀类药物(表4)。

3.3。他汀类药物治疗与减少中性粒细胞浸润和脆弱性在颈动脉斑块部分下游血流

考虑到人类颈动脉斑块的高异质性(17,18,20.),他汀类药物的治疗效果的intraplaque炎症模式和钙化生物标志物评估在不同地区(上游和下游血流,resp)。在上游部分,没有两个病人组之间的差异被发现的脂质和胶原蛋白含量和细胞成分(smc、巨噬细胞、中性粒细胞和MMP-9)(表5,数据1和2)。下游地区,总胶原蛋白和胶原蛋白我内容明显高于剩组相比没有他汀类药物的使用。值得注意的是,这种效应与一个虚拟的废除intraplaque嗜中性粒细胞浸润在与他汀类药物治疗的患者相比,治疗病人。尽管接近意义(),一个类似的趋势intraplaque中性产品内容MMP-9也观察到(表5)。没有发现区别两个病人组intraplaque脂质和其他细胞渗透的子集,smc和巨噬细胞等(表5)。

钙化生物标志物以前报告表达在动脉粥样硬化斑块(21]。因此,我们专注于这些标记物的表达在我们的患者群mRNA和蛋白水平。RANKL在两组几乎无法觉察的信使rna(上游斑块:可检测14他汀类和10没有他汀类药物;下游斑块:17他汀类和11没有他汀类)和蛋白质水平(可检测4下游部分从剩患者颈动脉斑块,数据未显示)。他汀类药物治疗并非与RANKL表达的改变,功能等级(RANKL的受体),信使rna比控制患者他汀类药物(表5)。在蛋白质水平,intraplaque功能表达弱的两组(表5)。功能显著增加蛋白质含量是上游区域所示的颈动脉斑块剩留与未经治疗的患者,而在下游斑块没有统计上的显著差异部分可以发现(表5)。最后,表达式模式功能的颈动脉斑块显示这种蛋白质不colocalize巨噬细胞和中性粒细胞,而是与内膜smc和脂质(数字1和2)。这结果是相似的患者组(数字1和2)。

3.4。RANKL /功能比积极与中性粒细胞脱颗粒产品体循环和颈动脉斑块内

斯皮尔曼秩相关性进行以识别潜在的自由血清RANKL水平之间的关联(RANKL /功能比)一方面,系统性和intraplaque中性粒细胞产品在其他两组患者(他汀类药物治疗对他汀类药物治疗)。RANKL /功能比被发现积极与血清CRP、MPO、中性粒细胞弹性蛋白酶的水平,以及与血清pro-MMP-9活动(表6)。虽然没有统计学意义(),一个积极的RANKL /功能之间的联系比和MMP-9观察血清水平(表6)。功能之间没有明显的联系RANKL /率和血清MMP-8检测(表6)。血清RANKL /功能比也显示反向与intraplaque脂质含量在颈动脉斑块的上游地区,并积极与中性粒细胞和MMP-9下游部分中的内容。没有额外的显著相关性显示其他intraplaque参数,如胶原蛋白含量、smc,巨噬细胞,在不同的intraplaque区域(表6)。

4所示。讨论

本研究的主要结果发现所代表的是一个正在进行的与他汀类药物治疗与生物标志物的血清水平的变化等斑块钙化OPN, RANKL和功能无症状严重的颈动脉狭窄患者进行颈动脉内膜切除手术。特别是,RANKL的自由流通分数(不绑定功能,表示为RANKL /功能比)强烈降低剩患者相比没有他汀类药物的控制。相反,我们没有发现任何有关改变intraplaque RANKL /功能水平剩留与未经治疗的患者。值得注意的是,我们只能够检测极低intraplaque RANKL的水平,这表明这个中介可以优先表达了血液中,而不是在动脉粥样硬化斑块(9]。我们的数据也表明一个新的、潜在的有益影响的他汀类药物可以直接减少循环自由RANKL的水平,从而防止其不利影响proatherosclerotic细胞子集(包括中性粒细胞)。减少潜在功能和RANKL阿托伐他汀治疗后血清以前Dimitrow和同事所示主动脉硬化或轻度主动脉瓣狭窄患者22]。在这篇文章中,我们证实他汀类药物治疗与减少RANKL血清水平,但是,令人惊讶的是,我们显示功能的增加血清(可溶性RANKL的诱饵受体,其生物活性)。心血管疾病中的功能作用,需要进一步的澄清,水平一直以来与心血管风险没有报告清晰proatherosclerotic直接相关的生物活性分子(23- - - - - -25]。在功能^−−/老鼠,治疗功能重组诱导纤维化的迹象,提升intraplaque smc积累,胶原纤维形成,纤维帽和发展,因此支持了致病作用的功能开发,发展,和不稳定的动脉粥样硬化病变26]。然而,额外的研究,应该是目的,例如,在识别功能血清截止值,需要澄清的确切性质功能作为一个无辜的旁观者或一个活跃的播放器在心血管疾病。

调制的他汀类药物的缺乏疗效intraplaque RANKL /功能水平可能也解释了不同的结果。首先,从我们的队列的患者服用他汀类药物在低剂量(19]。因此,他们的组织浓度可能是没有高到足以降低intraplaque炎症。在某种程度上,证实了这一假设弱改善斑块稳定性参数,我们发现在他汀类药物的患者相比,治疗控制。也就是,我们只检测到一个小中性粒细胞减少和MMP-9内容和增加intraplaque胶原蛋白的下游部分剩患者颈动脉斑块与控制,而Crisby和他的同事们(16)曾发现,普伐他汀治疗明显改善颈动脉斑块稳定性与控制病人通过减少巨噬细胞,T细胞,MMP-2和通过增加防护intraplaque胶原蛋白含量。

另一个可能的原因我们无法检测的调制intraplaque RANKL /功能水平是我们的方法研究了动脉粥样硬化斑块非常异构组织(由于接触不同类型的剪切应力)(20.),而Crisby和同事评估斑块单一均匀的组织。因此,研究可能的潜在差异反映了不同的方法。

最后,事实上,不同的他汀类药物(伐、辛伐他汀和阿托伐他汀)是管理我们研究的患者也可能解释,至少在某种程度上,他汀类药物对intraplaque参数的有限的活动,我们观察到。类似的结果也报道了Verhoeven和同事(27),他发现巨噬细胞内容可能会特别受到阿托伐他汀治疗但不是由其他他汀类药物。

值得注意的是,在患者群,他汀类药物治疗并没有减少斑块lipid-rich核心大小,这是一个关键漏洞在动脉粥样硬化斑块标记。这个结果可能令人惊讶因为Crisby和他的同事们(16)清楚地表明,pravastatin-treated症状性颈动脉狭窄患者的斑块已经大幅减少脂质少(3倍),与对照组相比。另一方面,我们的发现支持一个更近期的研究中,在冠状动脉粥样硬化,作者表明,他汀类药物的显著减少斑块大小只有低密度是< 100毫克/毫升(28]。在我们的研究中,我们没有观察到这些重要的他汀类药物患者低密度脂蛋白水平降低(中位数104 mg / dL和低密度脂蛋白水平< 100 mg / dL只有12个病人(46.2%))。因此,考虑到所有的这些方面,按照当前国际建议(12),我们的研究表明,使用高剂量和长期与他汀类药物降脂策略时要考虑的目标是减少intraplaque脆弱性和心血管不良事件在晚期动脉粥样硬化患者29日,30.]。

本研究的另一个重要的结果是由血清的确认直接免费RANKL水平之间的相关性和嗜中性粒细胞的产品。是成正比的RANKL /功能比和其他嗜中性粒细胞产品(MPO和中性粒细胞弹性蛋白酶等)也证实,证实了一个强大的细胞因子诱导的中性粒细胞脱颗粒由(9]。这种强劲的激活的中性粒细胞(积极与我们的研究相关血清RANKL水平)尤其在体循环而不是在颈动脉斑块。证实了先前的研究表明RANKL的积极作用循环嗜中性粒细胞脱粒proatherosclerotic产品(如MMP-9)患者的CAC和增加在体外(9),本研究进一步证实了这些细胞的主要来源蛋白酶有利于全身动脉粥样硬化的弱点。

这个飞行员解释性研究有几个模仿。首先,参与者的数量是相对较小的(也不剩患者之间()和未经处理的控制(),从而防止小的差异的检测两组之间的所有标记。其次,在讨论中提到的,我们不知道如何不同的降脂方案(即。,different statins and high-dose versus low-dose therapeutic approaches) can modulate the inflammatory burden within serum and atherosclerotic plaques. Anyway, our results might unveil a novel “pleiotropic” activity for statins selectively targeting RANKL/OPG system and potentially neutrophil activation and plaque calcification. In conclusion, we demonstrated that patients treated with a statin (low-dose) for severe carotid stenosis had reduced serum levels of free RANKL (RANKL/OPG ratio) as compared to controls without statins. This reduction of RANKL levels was positively associated with a concomitant reduction in neutrophil degranulation products, primarily in the systemic circulation and also within carotid plaques. This hypothesis-generating study may suggest that treatments that more selectively target the RANKL/OPG system might be beneficial in advanced atherosclerosis to reduce neutrophil-mediated patient vulnerability.

利益冲突

所有作者声明不存在利益冲突。

确认

这项研究是由欧盟FP7,之下批准号201668年,AtheroRemo博士f·马赫。这项工作是由瑞士国家科学基金会也支持f·马赫(没有博士资助。310030 - 118245年)和f . Montecucco博士(没有。32003 b-134963/1)。这项工作被从诺华基金会的资助也支持f . Montecucco博士和意大利卫生部(gr - 2008 - 1135635)博士Nencioni。