文摘

的一个₃腺苷受体(₃AR)过表达在炎症细胞和外周血单核细胞的炎症条件。受体激动剂的一种₃AR已知诱导特定治疗慢性抗炎作用。LUF6000是一个变构复合调制的₃基于“增大化现实”技术,使结合受体的内源性配体腺苷高亲和力。变构调节器的优点是他们的能力目标具体领域腺苷水平增加炎症和肿瘤等网站,而正常的身体细胞和组织是耐火材料的变构调节器由于腺苷水平低。LUF6000政府诱导抗炎效果在3实验动物模型大鼠佐剂诱导关节炎,monoiodoacetate诱导骨关节炎,伴刀豆球蛋白诱导小鼠肝脏炎症。行动点放松管制的分子机制包括PI3K信号蛋白质,IKK,我κB、Jak-2 STAT-1,导致下降的NF -水平κB,调节炎症的影响。此外,LUF6000引起轻微刺激影响正常的白细胞和中性粒细胞的数量。LUF6000的抗炎效果、作用机理和微分对炎症的影响,正常细胞这变构调节剂定位成一个有吸引力的和独特的药物候选。

1。介绍

的一个₃腺苷受体(₃AR)属于家族Gi-protein耦合受体(GPCR)。多的证据包括临床前和临床研究,积累了显示抗炎作用是通过一个中介₃基于“增大化现实”技术(1- - - - - -8]。一个₃基于“增大化现实”技术的受体激动剂诱导抗炎作用在小鼠和大鼠免疫性关节炎模型(2,9的差别,通过对这些基因的核转录因子(NF -κBκB)和相关蛋白质以及肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子α)[2),导致炎性细胞因子的抑制1,10,11]。一个₃基于“增大化现实”技术是在细胞炎性组织而正常细胞低表达的受体(12,13]。此外,₃的基于“增大化现实”技术被发现调节外周血单核细胞(PBMCs)自身免疫性炎症性疾病的患者13- - - - - -16]。PBMCs来自类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣、克罗恩病(CD)患者显示₃AR upregulation健康受试者的相比,这表明高₃炎症组织中AR表达水平反映在PBMCs [15]。

一个₃AR受体激动剂如CF101 (IB-MECA)和CF102 (Cl-IB-MECA)一直在调查一些二期临床研究包括类风湿性关节炎、牛皮癣、肝细胞癌、显示清晰的证据效力和安全性极好(17- - - - - -19),证明的有效性₃基于“增大化现实”技术的治疗目标。

而一个₃AR受体激动剂结合在一个orthosteric受体结合位点诱导激活,一个积极的变构调制(PAM)绑定到另一个结合位点的受体受体激动剂结合位点的不同,从而提高天然配体的亲和力和/或效果在一个腺苷₃AR。别构调节器的优点是他们的能力目标具体领域腺苷水平增加在炎症和肿瘤等网站,而正常的身体细胞和组织是理论上耐火材料的变构调节器由于腺苷水平较低20.]。

2-cyclohexyl-lh-imidazo 4-Dichloro-phenyl N -(3日)quinolin-4-amine (LUF6000)是一种imidazoquinolinamine变构剂的人类₃基于“增大化现实”技术,在绑定更改本机配体与受体相互作用提出了45%的最大效应(21)(图1)。

在一个三磷酸鸟苷γ年代绑定化验,LUF6000能够将核苷拮抗剂MRS542转换为A₃基于“增大化现实”技术的受体激动剂和被发现是非常有效的提高low-efficacy受体激动剂的最大效果。LUF6000独自没有诱导受体激活,因此可能是比orthosteric安全受体激动剂(22]。

在本研究中我们提出数据显示,LUF6000具体和有效的抗炎效果在活的有机体内。与这些影响提出相关的分子机制。

2。材料和方法

2.1。试剂

变构调制器LUF6000 (N - (3, 4-dichloro-phenyl) 2-cyclohexyl-lh-imidazo [4, 5 c] quinolin-4-amine)合成在莱顿学术Can-Fite生物制药药物研究中心(荷兰莱顿)/ Haoyuan Chemexpress有限公司有限公司(上海,中国)。10毫米的原液制备在DMSO和进一步稀释在PBS的准备。ConA (Canavalia ensiformis,杰克Bean血凝素)是购自Calbiochem-EMD微孔(CA)圣地亚哥。谷氨酸钠碘乙酸(米娅;σ,圣路易斯,密苏里州)准备在生理盐水。

兔多克隆抗体鼠₃基于“增大化现实”技术,磷酸肌醇3-kinase (PI3K),我κ我激酶(IKK)κ核因子B (NF -κBκB), Janus激酶2 (Jak-2)和信号传感器和转录激活1 (STAT-1) glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)β肌动蛋白是购自圣克鲁斯生物技术有限公司(美国达拉斯,TX)。

2.2。LUF6000对佐剂诱导关节炎的发展

女性刘易斯老鼠,9周的年龄,得到从哈伦实验室(耶路撒冷,以色列)。老鼠被保持在一个标准化的颗粒状的饮食和提供自来水。实验按照准则建立的动物保健和使用委员会制度Can-Fite生物制药,Petach瓦以色列。老鼠皮下注射(SC)与100年在尾巴基地μL的悬架由不完全弗氏佐剂(IFA)与10毫克/毫升热死结核分枝杆菌(Mt) H37Ra (Difco,底特律,美国)。每组包含10个动物。LUF6000 (100μ克/公斤)治疗口头由填喂法,每天三次,从疾病发作。对照组只收到车辆(DMSO溶液稀释的DMSO LUF6000股票的解决方案)。

临床疾病活动指数为评估,蒙蔽,如下:动物每天都检查临床关节炎的迹象。评分系统的范围从0到4的每个肢体:0,没有关节炎;1、发红或肿胀的脚/手指关节;2,红肿的不止一个脚趾/手指关节,3,脚踝和tarsal-metatarsal关节参与;4、发红或肿胀整个爪子。临床评分计算通过添加四个人腿最多的分数。

在研究结束时,老鼠牺牲使用有限公司₂方法。后爪子切割踝关节上方。此外,收集血液样本和Ficoll-hypaque梯度。PBMCs被用PBS和蛋白质提取准备如下详细。

骨性组织被打破成碎片,液氮快速冻结,储存在−80°C到使用。添加了爪子组织(4 mL / g组织)radioimmunoprecipitation化验(里帕)包含150毫米氯化钠提取缓冲,50毫米三,NP40 1%, 0.5%脱氧胆酸盐,0.1% SDS。组织均质在冰polytron,离心机和上层清液进行免疫印迹分析。每组包含10个动物,研究重复了至少3次。

2.3。米娅诱导OA实验模型

雄性Wistar鼠(150 - 175 g)获得从哈伦实验室(耶路撒冷,以色列)。老鼠被保持在一个标准化的颗粒状的饮食和提供自来水。实验按照准则建立的动物保健和使用委员会制度Can-Fite生物制药,Petach瓦以色列。

与米娅OA实验模型诱导,2 50毫克的总量μl·米娅是关节内注射的髌韧带右膝使用26个G针麻醉。左侧膝关节(控制)注射生理盐水。

口服治疗LUF6000, 100年μ克/公斤,投标开始7天(MIA注射后),一直持续到终止了这项研究。对照组治疗LUF6000车辆。每组包含10个动物,研究重复了至少3次。

膝盖的直径测量每隔一天使用一个数字卡尺(Mitotoyo、东京、日本)。

2.4。肝脏炎症模型

8周龄雄性C57BL / 6 j小鼠获得从哈伦实验室(耶路撒冷,以色列)。动物被维护在一个标准化的颗粒状的饮食和提供自来水。实验按照准则建立的动物保健和使用委员会制度Can-Fite生物制药,Petach-Tikva,以色列。

雄性C57BL / 6 j小鼠静脉注射(尾静脉)与伴刀豆球蛋白(Con)(20毫克/公斤)。LUF6000口头由填喂法,一剂10 - 100μ克/公斤,每天两次8 h后开始反对政府。对照组只收到了DMSO溶液稀释对应于100年μ克/公斤LUF6000的剂量。收集血液样本21 h后反对政府从retroorbital静脉和血清肝酶(血清和血糖)水平测定。老鼠被公司牺牲₂吸入的方法。肝脏是进行免疫印迹和病理分析。每组包含8 - 10小鼠,研究重复3次。

2.5。微分LUF6000血液细胞计数在口服治疗

只有雄性老鼠(第23 - 25 g)治疗与LUF6000每日三次,100年μ克/公斤48小时。血样撤回24和48小时后治疗。一个微分进行血细胞计数。每组包含10个老鼠,这项研究是重复4次。

2.6。免疫印迹分析₃基于“增大化现实”技术和额外的信号在PBMCs蛋白质

免疫印迹分析是根据以下协议。样本冲洗与冰冷的PBS和转移到冰冷的裂解缓冲(TNN缓冲区,50毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液150毫米氯化钠,NP 40)。细胞碎片被离心10分钟,享年7500岁使用Bio-Rad g。蛋白质浓度测定蛋白质测定染料试剂。等量的样例(50μg)通过sds - page分离,使用12%聚丙烯酰胺凝胶。解决了在硝化纤维膜蛋白质被electroblotted (Schleicher & Schuell基恩,NH,美国)。膜被封锁与1% BSA和孵化所需的主要抗体(稀释1:1000)24小时在4°C。屁股被清洗和孵化与二次抗体在室温下1 h。乐队记录使用BCIP /电视台颜色开发工具包(W1 Promega,麦迪逊,美国)。单位是由计算比率看家基因和蛋白质。β肌动蛋白是用于米娅和友邦保险模型,虽然GAPDH是用于肝脏炎症模型由于先前的实验表明一个更准确的结果与GAPDH肝脏。

2.7。统计分析

结果学生的评价以及,有统计学意义。比较不同实验的平均值。所有数据报告为平均数±标准差。

3所示。结果

3.1。LUF6000抑制佐剂诱导关节炎(AIA)的发展

LUF6000减少了RA临床评分在佐剂诱导关节炎大鼠模型中,展示一个重要的抗炎效果(图2)。

一个₃AR表达水平在爪子提取物和PBMCs LUF6000-treated中表达下调大鼠相比vehicle-treated(图3(一个)),证明₃AR水平PBMCs反映的远程炎症器官受体水平。PI3K、IKK和我κB表达水平在PBMCs表达下调对治疗LUF6000导致减少在NF -κ(图B的表达水平3 (b))。

3.2。LUF6000抑制MIA-Induced骨关节炎(OA)的发展

LUF6000抑制骨关节炎发展体现在实验大鼠模型减少膝盖肿胀和水肿LUF6000-treated组相比,车辆(图4)。一个₃AR表达水平在PBMCs监管LUF6000-treated组(图5(一个))其次是调节炎性蛋白的表达水平Jak-2和STAT-1相比vehicle-treated组(图5 (b))。

3.3。LUF6000防止肝脏炎症

的一个₃CF102 AR兴奋剂,被发现有保护作用在肝脏炎症模型小鼠的急性肝炎(23]。在当前的研究中,我们探索的影响LUF6000欺诈引起的肝脏炎症诱导。减少在血清谷氨酸丙酮酸氨基转移酶(血糖)和血清谷氨酸草酰乙酸的转氨酶(血清)水平,相比vehicle-treated组(图6)。LUF6000显示10和100年的保护作用μ克/公斤组织,导致dose-dependency 100μ克/公斤剂量比10展示一个更好的保护作用μ克/公斤。

3.4。LUF6000诱发白细胞和中性粒细胞增加

LUF6000管理正常ICR小鼠连续2天导致增加白细胞(WBC)计数在过去48 h后治疗。嗜中性粒细胞计数增加24小时和48小时后LUF6000政府展示一个轻微的刺激影响骨髓髓系细胞(图7)。

4所示。讨论

小分子结合从地形上截然不同的网站GPCRs已知orthosteric生成一个构象变化的受体,从而调节天然配体的亲和力或疗效。交替这样的变构调节器,这可能提高或降低本机受体激动剂的作用,是安全、有效的药物的候选人。

LUF6000是imidazoquinolinamine变构调制器在人类₃基于“增大化现实”技术,提高受体受体激动剂的功效作用的受体orthosteric网站。这是两所示三磷酸鸟苷γ年代绑定化验(22和其他一些功能分析23]。积累的内源性腺苷受体激动剂炎症微环境的网站被广为记载和作为一个好的基础利用LUF6000变构的配体₃基于“增大化现实”技术的唤起特定的抗炎效果。LUF6000也是提高肌苷的受体激动剂的效果,这是第二个,虽然弱,内生受体激动剂在人类₃基于“增大化现实”技术(21- - - - - -23]。

在这项研究中我们研究了变构的影响调制器LUF6000在三个不同的实验动物模型,共享通用机械的通路。

在友邦保险和米娅模型,一个抗关节炎的效果,通过降低该病的临床评分,观察。有趣的是一个₃发现AR表达水平在动物的PBMCs表达下调,表明受体调制,最有可能内化和退化。下游分子机制引起抑制PI3K的表达,IKK和我κB导致抑制NF -κb这机械的途径证实与描述的一个₃AR受体激动剂,支持的观点自然配体腺苷介导LUF6000的响应和积极的变构调制器,其他机制不能排除,而且它应该记住₃基于“增大化现实”技术的配体药理学啮齿动物之间可能有所不同(本研究)和人(22,23]。

这项研究是第一个显示数据显示LUF6000的抗炎效果在活的有机体内。的角色₃AR在介导炎症反应被广泛描述的临床前和临床研究。一个₃AR upregulation被描述在RA患者(24和在动物中,关节炎是诱导2]。受体upregulation归因于等转录因子NF -κB,已知在关节炎。治疗用₃基于“增大化现实”技术的受体激动剂如CF101和CF502导致的疾病有明显改善,参数在活的有机体内(2,4,25]。的差别在实验动物模型,对这些NF -κB和Wnt信号通路已被证明调解的抗炎效果₃基于“增大化现实”技术的受体激动剂(2,25]。机械的通路中描述这项研究表明LUF6000诱发其抗炎效果通过类似机械的途径如前所述₃基于“增大化现实”技术的受体激动剂。

额外的机制探讨OA模型继承STAT-1和Jak-2蛋白质减少炎症。抑制Jak-2已知块STAT-1激活以及基质金属蛋白酶13在软骨细胞,导致保护软骨细胞和软骨在OA (26]。

我们下一个检查LUF6000的影响肝脏炎症Con A-induced肝炎小鼠模型。LUF6000管理导致减少肝酶,从而抵消反对一分之一方式存在剂量依赖的相关性的影响。这些结果表明,LUF6000政府对肝脏有保护作用。早期的研究表明一个₃基于“增大化现实”技术的受体激动剂对肝脏王亚南的差别,通过对这些基因的肿瘤坏死因子介导的α水平和抑制凋亡蛋白伯灵顿和坏26,27]。

LUF6000对正常细胞的影响是探讨在其政府ICR小鼠和跟踪外周白细胞和中性粒细胞计数。有趣的是,白细胞计数正常在LUF6000治疗,甚至在中性粒细胞数量略有增加。这种效应表明,LUF6000在正常和病理细胞有不同的作用,类似于的效果₃AR受体激动剂IB-MECA和Cl-IB-MECA,介导通过分泌粒细胞集落刺激因子(g - csf) [27- - - - - -32]。

5。结论

LUF6000已被证明是有效的口服时,诱导特定的抗炎作用,呈现这种分子被认为是一种潜在的候选药物。

利益冲突

作者与潜在利益冲突详细如下:Shira科恩,就业和股票期权持有人;Faina仅有的、就业和股票期权持有人;Pnina Fishman,就业和股票期权持有人。作者没有利益冲突的详细如下:Sara Bar-Yehuda Adriaan p . IJzerman,肯尼斯·a·雅各布森。

承认

肯尼斯·a·雅各布森支持NIDDK, NIH校内的研究项目。