文摘

这项研究调查了CCl 12月的抗炎作用₄全身的C57BL / 6小鼠肝毒性。慢性炎症是引起CCl ip管理₄0.5μ通过两个注射L / g的体重6周。12月(50毫克/公斤)是由CCl填喂法12天前完成₄归纳。组织学分析DEC-treated集团表现出减少炎症过程和预防肝坏死和纤维化。DEC-treated组织的免疫组织化学和免疫荧光分析显示降低cox - 2,摘要意思、MDA、TGF -,SMA immunopositivity,除了表现出减少摘要意思、cox - 2 NFB,干扰素,TGF免疫印迹分析表达式。12月组显著增强il - 10的表达。减少肝脏损伤证实了DEC-treated组cox - 2和伊诺mRNA表达水平。基于本研究的结果,12月可以作为潜在的抗炎药用于慢性肝脏炎症。

1。介绍

慢性肝病导致一些并发症,发病率和死亡率高。一个全球卫生问题、慢性肝脏炎症和缓慢的阶段,是一种进步的疾病导致肝功能异常,表现为肝纤维化的形成(1]。的慢性炎症,以及炎症的类型(即。,Th2 versus Th1), is often important in many types of liver disease, as is the interplay between inflammation and environmental/metabolic/genetic factors [2]。过量摄入酒精和病毒性肝炎等肝脏疾病的最常见的原因(3]。肝脏是主要的器官负责药物的代谢和有毒化学物质,因此,它是几乎所有的主要靶器官有毒化学物质(4]。

CCl四氯化碳(₄)是一个著名的肝毒素,被广泛用于诱导实验动物模型中毒性肝损伤(5,6]。肝毒性被认为源于两个事件:第一个涉及创新领导力₄代谢的细胞色素p - 450三氯甲基自由基(),其中部分生成三氯甲基过氧化氢自由基()[7,8),导致脂质过氧化(9];第二个涉及枯氏细胞的激活,这是伴随着生产的促炎介质(10]。CCl四氯化碳(₄)应该是一个有效的刺激前列腺素在肝细胞合成,因为它被认为释放花生四烯酸在肝脏通过激活磷脂酶A2 (11,12]。

疾病的进展包括各种炎性分子如白细胞介素、细胞因子、核因子-B (NF -B) (13- - - - - -15]。激活NF -B,如果易位到细胞核,将促进许多下游基因的转录,包括诱导一氧化氮合酶(间接宾语)和cyclooxygenase-2 (cox - 2),招聘的关键调解人的炎症细胞(16,17]。iNOS-derived一氧化氮产量,激活下游的NF -B,紧随其后的是活性氧的生成和其他对细胞有害的自由基。细胞脂质很容易受到自由基的攻击,从而导致细胞内积累的丙二醛(MDA) (18]。虽然氧化应激之间的关系,细胞毒性细胞因子和肝细胞损伤并不完全理解,NF -B被认为是肝细胞损伤起着重要的作用。研究表明,增加激活NF -B通过四氯化碳肝损伤引起的氧化应激(19,20.]。

任何病因的慢性肝损伤后肝细胞受损,他们的膜组件,代谢物有毒代理人,浸润炎症细胞激活枯氏细胞,释放可溶性代理,包括细胞因子,如血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子-1 (TGF -)、肿瘤坏死因子(TNF -),endothelin-1 (ET-1),以及活性氧(ROS) (21]。这些因素作用于肝星状细胞(hsc),经过反应称为激活并开始新受体表达,如PDGF和TGF -受体,和新的蛋白质,如平滑肌肉肌动蛋白(sma)。肝星状细胞的激活触发的表达sma和增加细胞增殖和细胞外基质堆积22]。激活肝星状细胞被认为扮演一个角色在ECM的过度沉积蛋白质,如I型胶原蛋白(Col-1)和破坏正常的肝纤维发生过程中薄壁组织。的慢性炎症和重复维持肝脏损伤,例如那些与肝炎和酒精性肝病,通常会发展为肝硬化和hepatocarcinogenesis23]。

抑制促炎细胞因子、酶、核转录因子,自由基可以提供一种新的治疗策略对炎症性肝脏疾病。

乙胺嗪(DEC)有消炎的作用,由于其干扰花生四烯酸代谢,包括脂氧合酶(LOX)和环氧合酶(COX)酶[24- - - - - -27]。12月导致肺损伤,减少中性粒细胞迁移,形成没有生产,促炎细胞因子的释放和cox - 2在角叉菜胶引起的急性炎症模型28]。12月是一个潜在的药物治疗急性肺的炎症,为Queto等人表明,12月起着重要的作用在阻塞肺嗜酸性小鼠炎症与卵清蛋白致敏,有效地防止后续的气道阻力的影响,Th1 / Th2细胞因子的生产,肺嗜酸性粒细胞聚集,eosinophilopoiesis在活的有机体内和体外(29日]。12月的影响造成了减少肝异常引起的营养不良(30.]。此外,12月减少肝损伤,酗酒在实验模型,揭示了临床抗炎治疗的应用潜力15]。

本研究的目的是调查12月CCl抗击慢性的保护作用₄全身的伤害和其抗炎和王亚南活动的可能机制。

2。材料和方法

2.1。动物

四十岁男性5-week-old C57BL / 6小鼠,权重15 - 16 g,用于所有实验。老鼠检查来确定他们的健康状况和适应实验室环境,23 - 24日°C。他们被保存在一个12/12 h日夜周期光周期。动物们被安置在金属笼子里,吃普通食物的水随意。Oswaldo Cruz研究所的动物实验伦理委员会批准所有的实验报告在此协议下数量11/2010。

2.2。乙胺嗪的解决方案

解决方案是由蒸馏水和12月(Farmanguinhos、FIOCRUZ、巴西)和调整按照每个动物的体重。他们是由填喂法(0.2毫升)。对照组(C)只收到蒸馏水通过相同的管理路线(15,30.,31日]。

2.3。实验设计

慢性炎症是引起CCl ip管理₄0.5μ体重的L / g (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)溶解在橄榄油(最后一卷,0.1毫升/鼠标)32]。有两个注射一周6周。12月(50毫克/公斤)是由填喂法12天前完成肝脏损伤。对照组收到蒸馏水通过同样的路线。C57BL / 6小鼠被分为四组():(1)对照组(C),只有蒸馏水;(2)DEC-treated组(12月);(3)创新领导力₄CCl集团(₄);(4)创新领导力的₄+ 12月集团(三地₄+ 12月)。

2.4。组织学分析

肝脏碎片在10%福尔马林固定24小时,前处理和嵌入式在石蜡30.]。五个部分的4 - 5μ从每一组被削减和安装在玻璃幻灯片。片沾hematoxylin-eosin,检查一个倒置显微镜(观察者Z1,蔡司缩微成像,GmbH)配备了照相机和4.7.4图像分析软件(AxionCam MRm蔡司)400倍的放大。五个随机领域的纤维化地区量化每个幻灯片使用GIMP 2.6成像软件(15]。

2.5。测量肝胶原蛋白含量

肝胶原蛋白含量也评估了五Sirius-red染色石蜡包埋部分。Sirius-red积极方面分析了五个随机领域(放大×400)每个幻灯片和量化使用GIMP 2.6成像软件(15]。

2.6。电子透射显微镜分析

肝脏的片段是固定在一个解决方案包含2.5%戊二醛和4%甲醛在0.1甲次砷酸盐缓冲。固定后,样品被洗了两次相同的缓冲区,然后后缀在溶液中含有1%的四氧化锇,2毫米氯化钙、铁氰化钾和0.8% 0.1甲次砷酸盐缓冲pH值为7.2,在丙酮脱水,嵌入在环氧树脂812树脂(σ公司,圣路易斯,密苏里州)。聚合进行了60°C 2天。超薄部分收集300 -网铜网格,复染色与醋酸双氧铀及柠檬酸铅,和检查Morgani范透射电子显微镜(15]。

2.7。免疫组织化学(包含IHC)

五个部分(5μ米厚)从每组剪切和坚持幻灯片处理3-amino-propyl-triethoxy-silane(猿(美国σ))。在分级deparaffinized二甲苯和水化的部分乙醇(70%到100)。增加抗原决定基接触,部分加热30分钟在柠檬酸钠缓冲(0.01米,pH值6.0)。尽量减少内源性过氧化物酶活动,幻灯片处理0.3% (v / v) H₂O₂在水中5分钟。部分是用PBS (pH值7.2)0.01米洗净,然后用1% BSA和0.2%阻塞渐变20在PBS 1 h在室温下。部分是培养12小时在4°C单克隆抗体anti-cyclooxygenase (cox - 2, Abcam ab15191)抗体与转化生长因子(TGF -、Abcam ab66043), anti-mouse白介素1 (il - 1、Abcam ab9722)。使用的最佳浓度是1:100为这些抗体。的抗原抗体反应是可视化avidin-biotin过氧化物酶(Dako普遍LSAB +工具包,过氧化物酶),使用3.3 -diaminobenzidine作为发色体。幻灯片在苏木精复染色。布朗阳性染色导致反应产物。消极的控制被视为以上,除了第一个抗体,省略了。五张照片在同一放大定量分析使用GIMP 2.6软件(GNU图像处理程序,UNIX平台)。

2.8。免疫荧光(如果)

麻醉后,动物安乐死和肝脏的碎片被固定在4%多聚甲醛溶液(Sigma-Aldrich)(40毫升)0.1米磷酸盐(磷酸氢钠和氢七水硫酸锌,Sigma-Aldrich)缓冲盐水(PBS), pH值为7.2的两个小时。肝脏是沉浸在15%蔗糖一夜之间,其次是30%蔗糖第二个晚上(36小时总)。标本被嵌入在OCT-Tissue Tek化合物(美国樱花Finetek托兰斯,CA),冻结在正己烷(Dinamica、圣保罗、SP、巴西),用液态氮冷却。Cryosections (8μ米厚)permeabilized Triton x - 100年(0.3%)和孵化1 h和屏蔽解决方案(3% BSA + 0.2%渐变20三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐)。随后,部分被孵化与cox - 2抗体(Abcam ab15191),SMA (Abcam ab66043)和il - 1(Abcam ab9722) (1: 100)。主要的部分是孵化与多克隆抗体过夜然后孵化Cy3-conjugated二级抗体(杰克逊,猫。不。705-165-147)对兔免疫球蛋白(1:200)1 h。幻灯片是清洗和安装在荧光延长黄金不变色介质(生活技术,猫。不。P36930)观察在倒置荧光显微镜下观察(蔡司缩微成像GmbH),配备了照相机(蔡司AxioCam MRM)和释放4.7.2图像分析软件。

2.9。免疫印迹

肝脏很快被解剖,然后均质惠顿开销搅拌器(没有。903475)使用以下提取鸡尾酒:10毫米乙二胺四乙酸(EDTA);2毫米phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF);100毫米氟化钠;10毫米焦磷酸钠;10毫米原钒酸钠(衣饰归宿₄);10毫克抑肽酶和100毫米三(羟甲基)氨基甲烷(pH值7.4)。匀浆离心机在3000年g为10分钟和上层的收集和储存在−70°C,直到它的使用在免疫印迹。蛋白质含量测定采用布拉德福德法,以牛血清白蛋白为标准(33]。蛋白质(40毫克)分离为10% (IL10, il - 1NF -B-p65、cox - 2、干扰素,TGF -)钠十二烷基sulfate-polyacrylamide减少条件下凝胶电泳,electrophoretically转移到硝化纤维素膜(生物Rad、钙、美国Ref。162 - 0115年)。阻塞后一夜之间在4°C和5%脱脂牛奶TBS-T(三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐0.1% + 0.05%渐变20,pH值7.4),膜在室温下孵化,3 h,兔多克隆抗体anti-IL10和anti-IL-1(1:1000稀释;美国Abcam), anti-IFN,anti-TGF(1:2000稀释、Abcam、钙、美国)和兔多克隆抗体anti-NF -B-p65和anti-COX-2(1: 1500稀释,Abcam、钙、美国),在缓冲溶液稀释TBS-T含有3%脱脂牛奶。洗后(六次,每10分钟)在TBS-T,膜的进一步反应辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit二级抗体(1:8000 (Ref A6154)稀释,σ,美国),稀释在TBS-T 1%脱脂牛奶,1小时30分钟,在室温下。增强化学发光试剂(超级信号,皮尔斯,Ref。34080)被用来可视化标记蛋白质乐队和x射线胶片上的墨迹开发(富士医疗、柯达、裁判Z358487-50EA)。量化,每个乐队的像素密度是由图像1.38 J程序(可用http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html;由韦恩Rasband,马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院)。研究结果证实了在三组每个蛋白质的实验研究。的免疫印迹肌动蛋白被用作控制上述蛋白质印迹。与增强化学发光蛋白污点可视化后,蛋白质的抗体被膜,reprobed单克隆抗-肌动蛋白抗体(1:1000稀释,σ,美国)。蛋白质微随后进行。

2.10。RNA隔离、rt - PCR和实时定量PCR

从小鼠组织总RNA是孤立使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。RNA是对待RNase-free DNase我和放大与低聚糖(dT)引物,使用上标第一链合成系统RTPCR(表达载体)。然后,1μ克总RNA reverse-transcribed使用QuantiTec逆转录工具包(试剂盒、希尔登,德国),使用随机hexameric引物,根据制造商的指示。定量实时PCR进行SYBR绿色PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA),使用GAPDH作为内部控制规范化。RTqPCR ABI棱镜7500进行仪器(美国应用生物系统公司,CA)。正向和反向引物用于每个基因如下:5′-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC-3′, 5′-GCACGTAGTCTTCGATCACTATC-3′cox - 2;5′-GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA-3′, 5′-GTGGACGGGTCGATGTCAC-3′间接宾语;和5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′, 5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′为GAPDH(内生控制)。所有反应进行了一式三份,包括以下几点:1μL的互补;5μ米的每个引物;2 x SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司);和水添加到最后一卷25µl . mRNA的相对数量决定使用比较阈值(Ct)方法通过规范化目标cDNA GAPDH的Ct值。成倍增加比率计算相对于控制(基本条件)每组使用公式。

2.11。测定血清氧化氮(NO)活动

的血清中水平测定方法的基础上,格里斯反应(34]。格里斯比色反应被用来测量一氧化氮,涉及检测亚硝酸盐(在等离子体)和氧化的。一式两份,50μL的等离子体添加到96 - ELISA板,其次是同样体积的格里斯试剂,由1%磺胺,稀释2.5% H₃阿宝₄(解决方案)和N-1-naphtyl-ethtylenodiamina稀释2.5% H₃阿宝₄(解决方案B)。亚硝酸钠溶液初始浓度的100μM在PBS准备连续稀释的标准曲线。在黑暗中孵化10分钟后,阅读是由分光光度计在490海里。比较了不同样品的吸光度标准曲线和结果表达的意思标准错误的重复,使用GraphPad棱镜软件(v . 5.0)。

2.12。统计分析

GraphPad棱镜软件(版本5)是用于统计分析。数据表示使用的意思标准差。控制和治疗组之间的差异进行了分析,方差分析(方差分析),其次是Dunnett测试,图基的测试,或以及事后测试。概率值小于0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。组织病理学

组织学分析对照组小鼠(图1(一)显示正常肝的架构。动物从12月组表现出类似的模式(图1 (b))。CCl的₄组,一些持续的炎症过程的组织学特征被发现,尤其是中心周围的坏死和纤维化,空泡的脂肪变化,轻微的炎症细胞浸润,胞质变性,核无序(图1 (c))。12月CCl对待动物接触₄完全阻止肝坏死和纤维化。也减毒炎症浸润,以最小的肝损伤(图1 (d))。

3.2。胶原蛋白分析

肝纤维化评估了Sirius-red染色(标记I型和III型胶原纤维)。控制和12月组没有表现出显著的Sirius-red积极区域(数据2(一个)和2 (b))。CCl的₄组表现出显著的门户空间和周围胶原沉积在纤维领域(图2 (c))。然而,同₄+ 12月组表现出减少胶原蛋白沉积在肝组织,作为对照组(图中观察到2 (d))。积极Sirius-red地区量化GIMP 2.6成像软件,见图2 (e)。

3.3。超微结构分析

肝细胞的超微结构分析对照组表现出典型的形态模式,如粗面内质网,线粒体,糖原颗粒,核(图常染色质3(一个))。CCl的超微结构的分析₄组显示慢性细胞损伤,表现为大量的线粒体肿胀和过氧化物酶体的存在,扩张r,和几个液泡包括自噬小体,以及与核酸领域凝聚染色质溶解坏死过程(数据的特征3 (b),3 (c),3 (d))。CCl的肝细胞₄+ 12月组表现出典型的形态保存完好的细胞器,常染色质的细胞核,细胞质中的线粒体和大量和r的许多水池,类似于对照组(这些观察到的数据3 (e)和3 (f))。

3.4。免疫组织化学和免疫荧光

炎性细胞因子的释放可以激活其他肝细胞(内皮细胞、星状细胞和肝细胞)和诱导趋化因子的表达,细胞因子和酶,吸引和激活炎症细胞从循环35,36]。

CCl的管理₄产生严重肝损伤的显著增加,丙二醛(MDA)(图4(一))。免疫组织化学染色显示,控制和12月组织中的MDA不是immunopositive。另一方面,肝组织MDA高度积累,特别是在CCl perivenular地区₄组。相比之下,MDA CCl已经没电了₄+ 12月组。免疫染色定量的MDA进行使用GIMP 2.6图像软件。

TGF -已经作为一种重要的细胞因子介导肝纤维发生特点。枯氏细胞和肝星状细胞(hsc)是细胞外基质的主要生产商在肝纤维化的肝脏和基本纤维发生(23,37]。TGF -免疫组织化学(图4 (b)12月)的控制和组织证实没有immunopositivity TGF -。然而,同₄集团在TGF -表现出显著增加纤维化的地区,主要在肝星状细胞。显著减少CCl中可观察到细胞因子₄12月+ 12月组,表明参与肝纤维化的减少。

cox - 2的表达在炎症条件下增加,导致不同刺激的感应,包括促炎细胞因子如TNF -和il - 1(34]。cox - 2抑制了王亚南在四氯化碳引起的肝损伤38]。

cox - 2生理水平观察对照组和12月集团(数字4 (c)和4 (d))。然而,这种酶的表达水平显著增高CCl的被发现₄组。cox - 2免疫反应性纤维化领域,主要是观察到的优势中心周围的染色。创新领导力的cox - 2表达显著降低₄+ 12月组。免疫染色定量、免疫组织化学和免疫荧光对cox - 2进行使用GIMP 2.6成像软件和数据中所示4 (c)和4 (d),分别。

免疫荧光分析,控制和12月组织没有immunopositive il - 1(图4 (e))。然而,在三地₄集团高促炎细胞因子il - 1的表达被观察到。这个表达式在CCl的显著降低₄+ 12月CCl组比₄组(图4 (e))。

激活肝星状细胞是变成myofibroblasts,生产sma和增加胶原纤维的分泌,导致纤维基质成分的沉积39]。

在目前的研究中,发现的肝星状细胞的活化是表达增加CCl sma的₄组(图4 (f)),而的表达sma在CCl的显著降低₄+ 12月组(图4 (f))。这表明12月可以减少HSC的活化,防止启动纤维的过程。这一发现与Sirius-red染色结果(图2)。

3.5。表达分析(免疫印迹)的支持和抗炎标记IL10 il - 1NF -B, cox - 2,干扰素,TGF -

il - 10的能力(18 kDa)调节炎症反应和限制肝损伤的肝毒性已经在几个模型(40]。根据本研究的结果,创新领导力₄+ 12月组有显著提高抗炎细胞因子的表达,相比其他组(图5(一个))。

白介素il - 1(kDa 17日)显示CCl的表达显著增加₄组。CCl的₄+ 12月组,细胞因子的表达明显减少(图5 (b))。

同样,低表达p65-NF -B (60 kDa)在12月控制和组。相比之下,表达NF -含量严重超标CCl的观察₄组,而NF -B在CCl的显著降低₄+ 12月集团相比,炎症组(图5 (c))。

12月集团并没有改变cox - 2 (42 kDa)表达与对照组相比。CCl的cox - 2的水平₄组增加,与对照相比,和12月组。然而,同₄+ 12月组显著降低这种酶的表达,表明对慢性肝脏炎症(图抗炎作用5 (d)),从而证实了免疫组织化学和免疫荧光(的结果数据4 (c)和4 (d))。

干扰素表达式中没有观察到控制和12月组。然而,CCl中可观察到显著增加₄组。CCl的₄+ 12月组降低干扰素显著水平(图5 (e))。

TGF -在所有组中发现。CCl的观察₄由于CCl造成的肝损伤组₄(图5 (f))。然而,CCl中可观察到表达的减少₄12月+ 12月组,表明有益效应对慢性炎症,以及antifibrotic效果,确认在免疫组织化学(图获得的数据4 (b))。

3.6。分析cox - 2 mRNA表达的和间接宾语

cox - 2的水平和伊诺mRNA表达CCl增加了4.6倍和9.7倍₄组,分别与对照组相比。cox - 2和伊诺mRNA表达显著减弱三地₄+ 12月集团(数字6(一)和6 (b))。

3.7。一氧化氮水平

的水平在血清中,显著增加CCl没有代谢物的检测₄集团(),与其他组相比。CCl的₄+ 12月集团(),CCl相比,可观察到明显降低₄组(图6 (c))。

4所示。讨论

随后慢性炎症导致持续的肝细胞损伤和肝纤维化(23,36,41]。

广义响应,带有多个器官系统。在肝脏,各种不同类型的损伤导致炎症和纤维发生,这意味着一个共同的发病机制。招聘和迁移的枯氏细胞和肝星状细胞是关键事件发展的肝脏炎症和纤维化(32]。

尽管许多特定的治疗已成功开发不同肝脏疾病患者,包括抗病毒治疗乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染的患者,具体和有效的肝抗炎和antifibrotic治疗仍然是难以捉摸的。说明这些机制的根本重要性的凸显新的潜在疗法(2]。

根据罗查et al。15治疗酒精性动物,12月50毫克/公斤阻止脂质积累和提升减少炎性渗出和坏死区域由酗酒引起的。此外,12月25到50毫克/公斤是用于治疗营养不良的动物和防止脂质积累,同时促进减少营养不良造成的损害(30.]。

一个同₄全身的肝损伤是一种广泛使用的抗炎实验模型,王亚南药物筛选,促进肝脏病理学类似于观察人类[42- - - - - -45]。CCl的₄施加影响免疫细胞如t细胞、NK细胞、巨噬细胞、吞噬细胞和淋巴器官,除了增加炎症细胞因子(2、鉴定及)46,47]。本文使用了三地₄肝损伤模型分析DEC潜在治疗在预防慢性肝毒性通过衰减炎症反应和肝纤维化。

冈萨雷斯et al。48CCl]表明,大鼠肝脏炎症引起的₄减少了12月治疗后肝损伤在25 - 50毫克/公斤。动物有保存完好的细胞器和肝细胞的膜系统,显示12月有保护作用。在目前的研究中,三地₄CCl集团(₄)表现出一个明显的炎症过程,以及坏死和纤维化。然而,减少炎性浸润,肝坏死和纤维化CCl被观察到₄+ 12月组。因此,12月治疗引起的肝损伤的明显减少,确凿的先前的研究的结果。

多项研究表明,慢性肝脏炎症和纤维化有关的慢性阶段枯氏细胞积累,HSC激活,和胶原沉积49- - - - - -51]。目前的研究表明,有一个显著增加CCl在肝组织胶原纤维沉积₄组。它已经表明,肝纤维化主要是紊乱的内稳态的结果合成、沉积,变性,胶原蛋白的吸收。在肝纤维化,myofibroblasts典型假设的能力改造细胞外基质(ECM)通过ECM肝脏中蛋白质的生产(52,53]。12月治疗后明显降低纤维胶原口供被Sirius-red染色评估。因此,目前的研究表明,12月一个antifibrotic效果。

一氧化氮(NO)和超氧化物自由基反应,形成过氧亚硝基,一个更强大的氧化剂(54,55]。过氧亚硝基反应在细胞膜和DNA直接与含巯基的残留,导致脂质过氧化和细胞毒性54,56]。目前的研究表明有海拔CCl血清一氧化氮水平₄治疗小鼠和12月治疗能够减毒血清没有水平。这可能与减少伊诺肝组织的水平。

伊诺酶表达肝细胞和炎症细胞在急性和慢性疾病的发展57,58),但没有的作用^•在组织损伤仍然是有争议的。尽管王亚南伊诺的函数已经观察到不同类型的肝损伤,包括慢性三地₄中毒(59,60),伊诺肝毒素的影响也被报道(61年]。伊诺基因表达的肝细胞的许多生理和病理生理条件影响肝脏,包括感染性、出血性休克和酗酒(62年]。iNOS-derived似乎没有^•可能导致nitrosative压力(63年)但也调节促炎基因表达,从而导致炎症性肝损伤(45]。罗查et al。15)表明,12月抑制NF -的激活B和下游促炎介质,包括伊诺。本研究的结果建议antinitrosative CCl 12月的抗炎作用₄全身的肝损伤。

众所周知,不同类型的细胞和细胞因子参与炎症参与慢性肝损伤。这些细胞因子,如细胞外刺激,调节基因表达的各种因素通过与transcription-modulating互动因素。NF -B被认为是调节因子,调节免疫反应和细胞凋亡,调节急性和慢性炎症反应(64年]。NF -据报道B所导致的慢性肝损伤中发挥着重要作用是创新领导力的作用₄(65年]。NF -的主要行动B在肝损伤是调解细胞毒性细胞因子和炎症细胞毒素的释放。目前的研究提供了额外的发现支持12月的活动调节炎症的严重程度等几个关键转录因子NF -B。

几项研究已经表明,某些非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药),如水杨酸钠,苏灵大,布洛芬,flurbiprofen,表现出抗炎作用独立于环氧酶通路。兴趣主要集中在NF -某些非甾体抗炎药(B)作为一个潜在的目标66年- - - - - -68年]。同样,12月也展品抗炎作用而降低NF -B的表达。

NF -超过一百个目标基因在过去的几年中B已确定。其中一个是cox - 2的基因。众所周知,cox - 2负责炎性反应和肝细胞癌的致癌作用69年]。考克斯是另一个关键分子在炎症通路,引起一些刺激,包括细胞因子和有丝分裂原。cox - 2表达导致前列腺素的释放的炎症。在目前的研究中,cox - 2蛋白的水平和CCl mRNA表达增加₄这些增加组和12月明显减弱。高水平的伊诺和cox - 2引起的生产高浓度的没有二十烷类,通过启动COX-prostanoid通路(26,70年),导致细胞炎症、坏死、纤维化。综上所述,本研究的结果显示,12月主要调节生产伊诺和cox - 2在转录水平。

尽管CCl肝损伤相关的结果₄新陈代谢,连带损坏发生由于炎症过程由枯氏细胞激活(9,71年]。枯氏细胞激活炎症介质的释放,包括TNF -和il - 1。Interleukin-1是一个强有力的炎性细胞因子,参与前列腺素的合成,巨噬细胞激活,诱导中性粒细胞浸润,以及炎症的几个方面13,72年]。目前的研究表明,12月治疗CCl有效减少₄通过抑制il - 1全身的肝损伤。

本研究的结果表明,有一个重要的海拔在CCl的肝组织MDA含量₄治疗的老鼠。这种增强脂质过氧化导致组织损伤和抗氧化防御机制的失败。在目前的研究中,有一个重要的海拔在CCl肝脏MDA含量₄组和12月治疗组显著减少,这表明脂质过氧化反应增强的失败导致组织损伤和抗氧化防御机制,防止过多的自由基的形成(73年]。因此,自12月治疗降低MDA水平,可能表现出一种抗氧化剂的行动。

干扰素在调节免疫反应中扮演了至关重要的作用。先前的研究已经报道,干扰素的水平呈正相关,血清肝损伤的标志和纤维发生74年]。干扰素水平升高的原因肝损伤的发展和纤维发生尚不清楚75年]。目前的研究表明,干扰素12月治疗后表达降低,表明对创新领导力的一个有利的反应₄使得受伤的动物。

某些免疫调节细胞因子可以促进建立一个抗炎状态在肝脏,改善损伤。其中一个例子是il - 10,有力的抗炎和免疫抑制特性,减少促炎细胞因子的生产,包括TNF -和il - 1(76年]。il - 10的能力调节炎症反应和限制肝损伤的肝毒性已被证明在几个模型(77年- - - - - -79年]。il - 10可能也antifibrogenic属性的差别与对这些profibrogenic细胞因子,如TGF -(80年]。增加内源性il - 10的表达改善慢性炎性破裂,随后CCl重复刺激后肝纤维化₄(40]。同样的,本研究的结果显示,12月CCl中il - 10的表达增加₄中毒和减少肝脏炎症和随后的纤维发生的反应。

慢性损伤,如肝脏炎症反应,导致纤维化与ECM的积累蛋白质,大多数类型的慢性肝病的特征(81年,82年]。肝星状细胞是主要ECM-producing受伤的肝细胞(83年]。肝星状细胞激活或transdifferentiated myofibroblast-like细胞获得收缩,促炎和纤维发生的属性(49,84年,85年]。关键细胞因子参与肝纤维化,调节炎症反应损伤,调节肝纤维发生。TGF -和人类纤维发生(SMA似乎至关重要的介质86年]。激活肝星状细胞的刺激TGF -被认为是一个至关重要的纤维发生的反应肝纤维化有以下原因:更高的TGF -在活化HSC表达式;效力TGF -上调ECM表达式;更高的TGF -表达式受体在肝星状细胞;和增加TIMP-1 / TGF -的表达式肝纤维化引起的(87年,88年]。策略,旨在扰乱TGF -合成和/或减少信号通路减少纤维化实验模型(89年]。免疫组织化学和免疫荧光分析表明,TGF -CCl的显著增加₄组与其他组相比,与创新领导力₄+ 12月显著降低TGF -表情,确认以前的观测。

α-平滑肌肌动蛋白(sma)是一种蛋白质,参与组织修复的过程,在一个特定的纤维母细胞分化阶段。这些细胞被证明负责肉芽组织的萎缩和纤维化病变(90年]。激活肝星状细胞是肝损害负责,生产也I型胶原蛋白在肝纤维化和表达sma丝。活化的肝星状细胞是肝纤维化的重要特征,这激活的表达式表示sma,尽管它可以表示在其他细胞类型(91年]。一个显著更高的标签观察sma三地₄组比对照组。另一方面,低水平的CCl sma的观察₄+ 12月组。这些结果表明,12月可以抑制TGF -和sma表达,因此减少肝星状细胞的增殖和活化的影响。这些结果与以前的观测,12月治疗显著降低纤维胶原蛋白口供,确认12月有一个antifibrotic效果。

总之,本研究首次证明CCl 12月可以预防₄全身的慢性肝毒性,会产生一个antifibrotic效应通过减少炎症标记物TGF -,sma, Sirius-red染色,12月的潜在临床治疗antifibrotic应用程序。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究支持行动党/ FIOCRUZ / CNPq,西班牙de Biologia Estrutural e Bioimagem (INBEB), Fundacao德帕罗Ciencia e Tecnologia做Estado de伯南布哥(FACEPE)和Aggeu Magalhaes Oswaldo Cruz基金会研究中心在累西腓,巴西(CPqAM / FIOCRUZ)。