文摘
最近21-O-Angeloyltheasapogenol E3 (ATS-E3)是一种三萜皂苷分离茶叶树的种子茶树(l)o . Kuntze。ATS-E3几个有益的属性包括抗炎、抗糖尿病的antiatherosclerotic,抗癌效果。与其他酚类化合物分离茶植物,没有研究报道ATS-E3的药理作用。在这项研究中,因此,我们旨在探索细胞和分子抑制活动ATS-E3 macrophage-mediated炎症反应。ATS-E3显著减少巨噬细胞细胞反应,如FITC-dextran-induced吞噬吸收,硝普酸钠- (SNP)诱导激进的一代,和LPS-induced一氧化氮(NO)的生产。分析表明这种化合物分子活动显著抑制诱导的表达没有合酶(间接宾语),核易位的核因子- (NF)κB亚基(p50和p65)的磷酸化抑制剂κB激酶(IKK), AKT1的酶活性。综上所述,这部小说三萜皂苷化合物ATS-E3有助于茶植物的有益作用发挥抗炎和抗氧化活动的一种蛋白激酶/ IKK / NF -κB-dependent方式。
1。介绍
巨噬细胞是免疫细胞代表调节炎症性障碍,一个重要的防御系统对感染的病原体如细菌,病毒,真菌(1,2]。这些细胞产生炎症反应,使用特殊的表面受体(例如,toll样受体(通常)参与识别生物材料来自病原体和管理作为核心分子免疫病理过程中巨噬细胞的功能。这些受体的激活也能传感各种细胞内的信号级联组成的phosphatidylinositide 3-kinase (PI3K) phosphoinositide-dependent激酶1(基因),一种蛋白激酶的抑制剂κ(我κB)激酶(IKK),和我κBα。这些信号通路与核易位等转录因子核因子- (NF)κB合成新的inflammation-regulatory基因细胞因子和趋化因子等。同时,巨噬细胞产生大量的有毒化学物质,如一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)直接攻击并吞噬病原体感染以减少感染微生物的数量。虽然macrophage-mediated炎症性障碍是一个有用的生物事件,应对的函数通过这些细胞可能会导致额外的病理生理现象导致免疫性疾病。据报道,长期由巨噬细胞炎症反应诱发某些组织或器官功能的缺失,导致严重的疾病,包括癌症、动脉粥样硬化、自身免疫性疾病和阿尔茨海默氏症。因此,抑制急性或慢性炎症被认为是可以接受的治疗方法为目的的预防或改善疾病(3- - - - - -7]。
到目前为止,已经有超过1800篇论文发表在茶植物(茶树(l)o . Kuntze),因为茶是一个非常受欢迎的饮料与高浓度的酚类化合物。与咖啡不同,大多数茶药理学的研究强调了这些植物的有益的角色包括神经、王亚南,抗氧化,抗糖尿病的,抗癌,各类典型,抗菌、anticardiovascular antilipogenic,延缓衰老的活动。这样的活动让科学家研究活性成分产生这些不同的药理活性。因此,许多化学物质如儿茶素、茶黄素,丹宁酸,和类黄酮已确定的叶子,树种子或根茶。先前的报道表明,多酚类化合物可能是药物价值的组件。相比之下,已发表的论文很少从茶植物三萜皂甙。的药理作用olean-12-ene-type三萜皂甙从茶植物的根是未知的8]。Oleiferasaponin一1凋亡的活动,已经从茶种子油渣分离(山茶花鉴定亚伯)[9]。考虑到皂素分数人参和党参生长状况已经被提议作为无毒抗炎药物和化妆品的来源,我们也旨在孤立三萜皂苷抗炎作用。因此,在这项研究中,我们报告一个新颖的三萜皂苷,21-O-angeloyltheasapogenol E3 (ATS-E3)(图1)从茶树种子分离及其抗炎活动macrophage-mediated炎症反应。
2。材料和方法
2.1。材料
硝普酸钠(SNP), 3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT) dihydrorhodamine 123 (DHR123),异硫氰酸荧光素(FITC)葡聚糖,Nω-nitro-L-arginine甲酯(L-NAME)和脂多糖(LPS);大肠杆菌0111:B4)从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。bay11 - 7082(湾),LY294002,渥曼青霉素获得Calbiochem (La Jolla、钙、美国)。胎牛血清,RPMI 1640人获得Gibco(美国纽约大岛)。小鼠巨噬细胞的细胞株RAW264.7和人类胚胎肾细胞(HEK) 293从美国购买类型文化集合(罗克维尔市,医学博士,美国)。所有其他化学试剂均为分析纯,从σ。一个包含绑定网站NF -荧光素酶构建κB是一个礼物有年轻教授涌(釜山国立大学、釜山、韩国)。DNA结构与FLAG-MyD88 Myc-Syk被用作报道之前(10]。Phosphospecific和/或总抗体NF -κB亚基(p50 p65),我κBαIKK AKT,核纤层蛋白A / C基因β肌动蛋白从细胞信号(美国贝弗利,MA)。
2.2。21-O-Angeloyltheasapogenol E3的准备
21-O-Angeloyltheasapogenol E3 (ATS-E3)准备ethanolic提取的茶的种子植物。提取被分割在乙酸乙酯和蒸馏水,然后是乙酸乙酯层干产生乙酸乙酯部分。ATS-E3从乙酸乙酯部分纯化使用MPLC(醋酸hexane-ethyl溶剂梯度下)和被孤立为白色固体。其物理化学和光谱数据(见补充图1和图2在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/658351)是发布的相同值(11- - - - - -13]。茶的种子植物用于本研究获得在韩国济州岛。
2.3。细胞培养
RAW264.7 HEK293细胞培养在RPMI 1640中补充heat-inactivated 10%胎牛血清(的边后卫;Gibco,宏伟的岛,纽约,美国),谷氨酰胺,抗生素(青霉素和链霉素)37°C下5%的股份有限公司2。对于每个实验,细胞被分离细胞刮刀。当细胞培养的实验2×10的密度6细胞/毫升,死细胞的比例还不到1%,由台盼蓝染料排斥。
2.4。吞噬吸收测定
测量RAW264.7细胞的吞噬活性,我们修改之前报道的方法14]。RAW264.7细胞(5×104)使用ATS-E3(0到10μ米)或bay11 - 7082(10和15μ米)1 h,然后resuspended在100年μL磷酸盐(PBS)含1%人类AB血清和孵化FITC-dextran(1毫克/毫升)在37°C为20分钟。反应是停止通过添加2毫升的冰冷的PBS包含1%的人类血清和0.02%的叠氮化钠。细胞被洗了三次与冷PBS-azide和分析FACScan流式细胞分析仪(美国正欲,圣何塞,CA)此前报道(15]。
2.5。活性氧测定的一代
细胞内ROS水平的决心通过记录荧光的变化造成的氧化荧光探针DHR123。简单地说,5×105RAW264.7细胞暴露于ATS-E3(0到10μ米)30分钟,然后孵化与SNP在37°C(0.25毫米)20分钟诱导活性氧的生产。这些细胞被进一步孵化20μ为30分钟的荧光探针DHR123 37°C。荧光的程度,这与细胞内ROS水平,确定使用FACScan流式细胞分析仪(becton dickinson)此前报道15]。
2.6。流仪结果
FITC-dextran或RAW264.7细胞ROS水平取决于流仪分析(16,17]。RAW264.7细胞(2×106细胞/毫升)处理存在与否的AP736 FITC-dextran(1毫克/毫升)或DHR123与染色洗缓冲区包含2%的兔血清和1%的叠氮化钠在PBS和孵化直接标记抗体对冰额外的45分钟。与染色缓冲洗涤三次后,染色细胞分析在FACScan流式细胞分析仪(正)。
2.7。没有生产
RAW264.7细胞巨噬细胞(1×106细胞/毫升)培养18 h,使用ATS-E3(0到10μ30分钟),进一步孵化有限合伙人(1μg / mL) 24 h。ATS-E3的抑制作用LPS-induced没有生产由分析水平使用格里斯试剂如前所述[18,19]。在550 nm (OD OD550年)测量使用SpectraMax 250标(分子器件、桑尼维尔,美国)。
2.8。细胞生存能力测试
RAW264.7细胞(1×106细胞/毫升)培养18 h,然后ATS-E3(0到10μ米)被添加到细胞的最后24或8 h文化,分别。ATS-E3当时的细胞毒性效应评估传统MTT测定先前报道(20.,21]。最后3 h(文化、10μL MTT方法(10毫克/毫升在PBS, pH值7.4)被添加到每个。孵化了添加15%十二烷基硫酸钠(SDS)到每个好,而随着甲瓒(22]。吸光度在570 nm (OD570 - 630)测量使用SpectraMax 250标(BioTek坏Friedrichshall,德国)。
2.9。伊诺表达式的分析实时逆转录-聚合酶链反应
RAW264.7细胞(1×106细胞/毫升)培养18 h,使用ATS-E3(0到10μ米)为30分钟,进一步培养与有限合伙人(1μg / mL) 6 h。的抑制作用ATS-E3伊诺的表达是由实时定量逆转录-聚合酶链反应(存在)18,23]。确定伊诺基因表达水平,总RNA隔绝LPS-treated RAW264.7细胞使用试剂盒试剂(Gibco BRL)根据制造商的指示。总RNA是储存在−70°C到使用。实时执行中存在报道之前(24,25]。引物(Bioneer、大田、韩国)中使用这些反应是列在表中1。
2.10。质粒转染和荧光素酶报告基因活性测定
HEK293细胞(1×106细胞/毫升)转染有1μ克的质粒的表达β牛乳糖和NF -κB-Luc或AP-1-Luc存在与否的一个诱导分子MyD88或酪氨酸激酶Myc-Syk。转染进行使用12-well板块中的裴方法如前所列出(26,27]。转染细胞用于48 h posttransfection实验。细胞治疗ATS-E3每个实验的最后8 h。荧光素酶检测进行使用荧光素酶检测系统(Promega,麦迪逊,WI),如前所报道(28]。
2.11。制备的细胞溶解产物和免疫印迹分析
RAW264.7细胞(5×106细胞/毫升)清洗三次在寒冷的PBS补充1毫米原钒酸钠,resuspended裂解缓冲(20毫米Tris-HCl, pH值7.4,2毫米EDTA, 2毫米ethyleneglycotetraacetic酸,50毫米β二硫苏糖醇甘油磷酸酯1毫米原钒酸钠1毫米,特里同x - 100 1%, 10%的甘油,10μ10 g / mL抑肽酶μg / mL抑肽素,1毫米苯甲酰胺和2毫米PMSF),细胞溶解,声波降解法和旋转30分钟在4°C。的溶解产物被离心澄清在16000 g×10分钟4°C和储存在−20°C到使用。细胞溶解产物的可溶性分数免疫印迹,和总磷蛋白质水平的p50, p65,我κBαIKK AKT,核纤层蛋白A / C基因β肌动蛋白被可视化为之前报道(29日]。
2.12。基因和AKT1激酶试验
评估的能力ATS-E3抑制纯化基因的活动和AKT1,我们使用了微孔激酶分析器服务(美国马Billerica)此前报道(30.]。人类的基因或AKT1(1 - 5μ)孵化反应缓冲在最后反应体积的25μl . MgATP的反应是由添加。在室温下孵化了40分钟后,反应是停止添加5毫升的3%磷酸溶液。反应产物(10μL)被发现在e Filtermat和洗了三次5分钟都有75毫米磷酸和甲醇在干燥和闪烁计数。
2.13。统计分析
数据表示为平均值±标准偏差(SD),计算从一个()两个独立的实验。其他数据是代表三个不同的实验也得到了类似的结果。结果进行统计比较,分析了使用方差分析/菸害的因果测试和克鲁斯卡尔-沃利斯/ Mann-Whitney测试。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。所有统计测试进行了使用SPSS(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。
3所示。结果与讨论
没有先前的研究报告ATS-E3的生物活性,小说三萜皂苷分离茶树;因此,我们的目的是评估在macrophage-mediated炎症条件下其药理活性。开始这项研究,我们第一次检查的细胞毒性活动在macrophage-like ATS-E3 RAW264.7细胞。如图2(一个)所示,没有明显毒性作用影响细胞生存能力的治疗下,这种化合物10μ米,这表明ATS-E3在0到10的活动μM浓度范围可能是由于其特殊的药理活性。
(一)
(b)
(c)
(d)
在先天免疫反应,巨噬细胞的主要功能是吞噬感染或外源性材料。这种吞噬能力可以很容易的模仿与大分子和FITC标记。事实上,FITC-dextran显示增加10倍RAW264.7 macrophage-like细胞(图2 (b)),如评估流仪分析以前的报告(31日]。有趣的是,ATS-E3阻塞FITC-dextran吞噬作用的剂量依赖性的方式(图2 (b)左面板)。此外,IKK抑制剂湾11 - 7082也显著减少FITC-dextran的吸收,表明FITC-dextran通过巨噬细胞吞噬功能依赖于IKK / NF -κB(图2 (b)右面板),此前报道,(32]。巨噬细胞的附加功能包括释放大量的有毒分子ROS和RNS等,造成细胞损伤的组织或器官,由于炎症导致的损失函数(33]。因此,我们下一个检查ATS-E3能否消除有毒分子通过激进的发电机SNP。产生抗氧化活性细胞的条件下,我们也与SNP RAW264.7细胞治疗使用。如图2 (c)这种化合物完全中和生成的自由基。因为三萜皂甙等parkioside B从根树皮牛油树parkii(34),3β- o -α-l-arabinopyranosyl-19α,23-dihydroxy-20α-urs-12-en-28-oic酸啊,,β-d-glucopyranosyl酯从空中的部分冬青属植物冬青(35),和3β-hydroxy-23-oxo-30-noroleana-12 20 (29) -diene-28-oic酸3 -O- - - - - -β- - - - - -D-glucuronopyranosyl-28 -O- - - - - -β- - - - - -D吡喃葡萄糖苷的蓬子herbacea(36显示强大的抗氧化活性,ATS-E3的清除作用可能是由于他们的植物化学的性质。因此,这些结果暗示ATS-E3可以下调吞噬作用,防止自由基的生成功能激活的巨噬细胞介导的。
IKK / NF -这一事实κB抑制剂湾抑制FITC-dextran-induced RAW264.7细胞吞噬作用(图2 (b)右面板)让我们假设ATS-E3可以阻止NF -κB-dependent炎症反应。为了确定这一点,我们首先测试生产皂素的抑制活性,代表NF -κB-dependent响应(37),在LPS-treated RAW264.7细胞。如左边面板的图所示2 (d)强烈,没有水平下降(80%)的浓度为10μ克/毫升ATS-E3。然而,没有抑制细胞的生存能力,根据MTT测定(图2(一个)),这意味着ATS-E3没有生产的抑制活动不是简单的非特异性细胞毒性和ATS-E3可以阻止NF -κB-mediated巨噬细胞的功能。与此同时,标准化合物L-NAME表现出剂量依赖性抑制活性(图1毫米2 (d)右面板),表明实验条件良好,先前报道(38]。
获得的进一步证据的抑制NF -κB-dependent炎症活动,转录激活和NF -核易位κB通过测量mRNA水平的进气阀打开和检查执行荧光素酶报告基因分析核的NF -水平κB亚基(p50和p65)。如图3(一个)伊诺的水平显著减少了10μATS-E3 g / mL。此外,NF -κB-mediated MyD88引起的荧光素酶活性(图3 (b)但不是麦克米兰(图3 (c)),NF -κB-activating上游酪氨酸激酶(39),被这皂苷剂量依赖性抑制。核易位的NF -水平κB亚基也明显减少了响应ATS-E3治疗(10μg / mL) 15岁、30和60分钟(图3 (d)左和右面板)。关于NF -这些结果强烈支持我们的假设κATS-E3 B作为目标转录因子。也有考虑到几个三萜皂苷抑制NF -κB激活(40,41),有可能是一个结构单元中三萜皂苷有助于抑制NF -κB激活。
(一)
(b)
(c)
(d)
最后,由于NF -的易位κB亚基被ATS-E3抑制,我们下了一个潜在的目标酶参与调节的易位NF -κ有趣的是,我κBα磷酸化,易位的NF -的关键一步κB亚基(42),强烈降低5点30分钟(图4(一)左和右面板),这意味着ATS-E3-targeting酶被激活在早期的时间点。因此,我们下一个评估连续磷酸化水平的上游酶参与κBα磷酸化在5分钟准备全部溶解产物准备从RAW264.7细胞刺激有限合伙人1和3分钟。如图4 (b)(左和右面板),早期的磷酸化IKK和AKT在1和3分钟显然是减少这种化合物,而基因的磷酸化不是抑制,表明ATS-E3的基因是一个潜在的目标。研究这种可能性,我们进行了一项激酶检测纯化基因和AKT1。虽然我们未能观察ATS-E3的强烈抑制活动,我们发现ATS-E3 (10μg / mL)显著抑制AKT1激酶活性高达40%(图4 (c))。相比之下,基因活动并不是减少这种化合物(图4 (c)),这表明它可以直接抑制一种蛋白激酶的酶活性,称为IKK-phosphorylating酶(43]。证据表明,AKT在NF -发挥了积极的作用κB-mediated炎症反应。在目前的研究中,AKT导致IKK磷酸化的过度,我κBα退化和NF -κB易位。同时,一种蛋白激酶抑制LY294002和渥曼青霉素抑制炎症介质的产生(图4 (d))。事实上,我们还证实,这些化合物以及IKK抑制剂湾11 - 7082能够减少生产没有LPS刺激下(图4 (d))。此外,我们最近发现Cys310 AKT扮演了一个重要的促炎作用[44]。事实上,化合物可以绑定的硫醇基半胱氨酸残基清楚地表明消炎物质通过抑制NF -κB通路(44- - - - - -46]。然而,发现ATS-E3阻塞只有40%的一种蛋白激酶活动(图4 (c))表明,还有一个ATS-E3药理学的主要目标。因此,未来的研究应该包括ATS-E3目标蛋白质的识别。综上所述,先前的报告和我们的数据强烈建议积极调节炎症通路,和一种蛋白激酶/ IKK / NF -κB监管循环直接ATS-E3的抗炎活动的目标。
(一)
(b)
(c)
(d)
总之,ATS-E3强烈抑制macrophage-mediated炎症反应如吞噬吸收,ROS生成,没有生产。ATS-E3的抑制作用是通过抑制炎症介导的通路由AKT、IKK和NF -κB,总结,如图5。因此,我们的研究结果有力地表明,小说三萜皂苷成分ATS-E3可能导致茶植物的有益作用通过其抗炎活性。在目前的数据视图,我们也建议ATS-E3可以进一步发展为第一个抗炎准备从茶皂素组件工厂。因此,我们未来的研究将集中在提供额外的药理的证据来证明这种可能性。
利益冲突
作者报告没有利益冲突。独自负责的内容和作者写这篇文章。
作者的贡献
吸引Seok杨、Jaeyoung Ko和Eunji金正日的贡献同样这项工作。
承认
这项工作的支持下进行了“农业科技发展合作研究项目(项目没有。PJ009241),“农村发展管理、韩国。
补充材料
补充图1:1300 H NMR光谱被记录在一个力量皇冠(300 MHz)和力量DPX 400 (400 MHz)。化学变化在ppm (ppm)在前场的相对于四甲基硅烷作为内部标准。
补充图2:谱测量的安捷伦1100 LC / MS光谱仪Phenomenex Luna C18分析柱(5毫米,4.6×100毫米)。