文摘

一个合适的fetomaternal immune-endocrine相声怀孕生育成功的基础。这可能被暴露在环境中的化学物质不平衡,如双酚A (BPA)。与双酚a胎儿胎盘污染来源于孕产妇隔间,本研究调查了子宫内膜在BPA对胎盘的影响。为此,在体外decidualized基质细胞暴露在BPA 1海里,和他们的条件培养基(稀释1:2)是用于从人类胎盘绒毛膜绒毛外植体。并行文化胎盘外植体直接接触到0.5 nM BPA,控制文化受到车辆(EtOH 0.1%)。后24 - 48 h,培养基从BPA-treated和控制文化化验激素浓度的人类绒毛膜促性腺激素(β人类绒毛膜促性腺)和细胞因子巨噬细胞移动抑制因子(MIF)。结果表明,直接接触BPA刺激MIF和释放的β人类绒毛膜促性腺。这些影响是废除/减少胎盘文化中接触到子宫内膜cell-conditioned媒介。GM-MS分析显示,子宫内膜细胞保留双酚a,从而减少这种化学物质对胎盘的可用性。获得的数据突出的重要性在体外模型包括孕产妇组件繁殖环境化学物质对人类的影响胎儿和胎盘。

1。介绍

怀孕期间,两个基因不同的生物体,母亲和胎儿,建立分子相声(1- - - - - -3]。在这个相声,分泌大量的分子生物和双方的行为(4]。一致行动的内分泌、旁分泌和自分泌分子使母体蜕膜免疫特权的网站,允许semiallogenic胚胎/胎儿的生长发育(5,6]。一个正确和及时的母亲和胎儿之间的信号/胎盘是至关重要的胚胎植入和进一步发展7]。激素,如estradiol-17 (E2)和孕酮(P4),在准备扮演关键角色的产妇子宫蜕膜植入胚泡(8,9]。同样,这些激素调节胚胎/胎儿的发展和正确的胎座式的过程10- - - - - -12]。

分泌过多的分子fetomaternal接口,巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是一个已被证明的促炎细胞因子发挥监管作用在人类怀孕。MIF表达的人类胎盘在妊娠和主要在怀孕的早期阶段(13,14]。MIF的任何变化,对增加或减少孕产妇血清,人类怀孕相关的并发症,包括流产、早产,子痫前期(15- - - - - -18]。这些数据揭示MIF在人类怀孕的重要性。

人体绒毛膜促性腺激素的β亚基( 人类绒毛膜促性腺)是专门分泌的滋养层,从妊娠的第一阶段(19- - - - - -21]。它在移植中发挥着关键作用,在怀孕的维护(19,21]。

一起表演,免疫和荷尔蒙刺激导致母体组织蜕膜的形成在每个周期。如果发生受精,胚泡到达子宫上皮和植入的开始。滋养层细胞形成囊胚的上皮覆盖第一次接触子宫上皮细胞,然后将上皮细胞和侵入母体子宫内膜22]。 促性是人类怀孕的信号能够阻止黄体退化,从而允许胚泡着床、胎盘发展。作用于人类子宫内膜,MIF能够减少蜕膜NK细胞的细胞毒性,因此提出一个重要的角色在母体免疫耐受与semiallogenic胎儿(23]。任何不平衡β人类绒毛膜促性腺和MIF分泌可能对妊娠和胎儿健康造成严重后果。

双酚A (BPA)的原型是环境化学物质、组织有序的一种活动和广泛扩散在几个项目,包括聚碳酸酯塑料和罐用于食品和饮料(24]。和其他人类,女性在生育年龄和母亲在怀孕期间每天可以接触到双酚a。污染可能发生这种化学物质通过皮肤吸收利用个人护理产品和洗涤剂,呼吸被污染的空气,饮用或食用受污染的水或食物25,26]。BPA可以绑定内源性类固醇激素的受体,从而能够与激素靶器官(27- - - - - -32]。由于其高亲油性,BPA可以转移所有通过胎盘到达胎儿(33]。动物研究表明,预处理和围产期新生儿接触这种化学物质导致的问题,如低出生体重和/或倾向成人退行性疾病,也就是说,心血管疾病,糖尿病,肥胖,和过敏(34- - - - - -36]。BPA的行为也在人类胎盘在低浓度纳米33]。

与双酚a胎儿胎盘污染来源于孕产妇隔间,本研究旨在探讨孕产妇污染的影响与双酚a对人类胎盘。在尝试类似的复杂分子之间的相互作用的母亲和胎儿在怀孕早期,读策略与子宫内膜基质细胞条件培养基用于暴露胎盘文化从怀孕头三个月。MIF和β人类绒毛膜促性腺endocrine-paracrine分泌物的化验为关键分子胎盘建立和发展。

2。材料和方法

本研究是在实验室之间的合作项目进行生殖免疫学和病理学系,动物繁殖和食品研究所,波兰科学院Olsztyn,波兰,和生命科学部门的实验室,意大利锡耶纳大学。如果不是另有规定,程序在实验室进行。

2.1。隔离和子宫内膜基质细胞的文化

活组织检查(约为0.5厘米3从健康的人类子宫内膜(总计) 标本不同的捐赠者,从早期的增殖周期阶段)从县医院获得Olsztyn(波兰)( 医院的标本)和Campostaggia(意大利锡耶纳)( 标本)后患者的书面知情同意和批准,当地伦理委员会(490/12 / BIOET Olsztyn的医院,2013年VITRO-RIP, Campostaggia医院),依照赫尔辛基宣言指导方针。约会的子宫内膜组织执行按照末次月经的日期和执行的标准组织约会在医院(37]。基质细胞被孤立被Hombach-Klonisch et al。38)做了一些调整。简单地说,组织切成1毫米3块和孵化DMEM-F12介质,无酚红(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),补充1%的抗生素/抗真菌的(Sigma-Aldrich), 0.1% (w / v)从牛血清白蛋白(BSA)(德国曼海姆罗氏诊断GmbH), 2.4国际单位/毫升dispase(美国纽约Gibco,大岛),0.05% (w / v)胶原酶(Sigma-Aldrich),和0.005% DNase我(Sigma-Aldrich) 20分钟,在37°C,温柔的颤抖。酶消化后,间质细胞与上皮细胞分离与尼龙70的过滤器μ米(,正欲猎鹰,富兰克林湖,新泽西,美国)最后40μm (BD猎鹰)的孔隙大小。细胞然后离心液在100 g×10分钟4°C和红细胞存在于细胞颗粒细胞溶解,增加红细胞裂解缓冲(Sigma-Aldrich)。苯酚的细胞终于resuspended red-free DMEM-F12 (Lonza BioWhittaker, Verviers,比利时)补充10%胎牛血清(的边后卫)(Sigma-Aldrich)和1%的抗生素/抗真菌的(Sigma-Aldrich)和播种在6-well板块(BD猎鹰)。中包含的细胞被2 - 3 h后,为了进一步净化文化。达到70 - 80%融合后,细胞被胰蛋白酶/然后从板块发布EDTA (Lonza BioWhittaker)然后,1×10的浓度6细胞/毫升,在25厘米2水瓶(BD猎鹰)。

2.2。描述和Decidualization子宫内膜基质细胞

子宫内膜基质细胞培养在调湿大气的5%股份2在空气中,在完成37°C DMEM-F12介质,无酚红,与10%的边后卫和1%的抗生素/抗真菌的补充,直到70 - 80%融合。每个样品的基质细胞的纯度证实了流式细胞仪和免疫细胞化学如下所述。细胞被启动然后decidualized类固醇激素,像自行车子宫内膜的条件(39,40]。特别是,细胞在25厘米2烧瓶在70 - 80%融合(约1.3×106细胞/瓶)培养没有激素的前三天(38];然后,为了模仿增殖阶段的周期,媒介与E2(10补充8米)(Sigma-Aldrich)和文化培养3天。最后,这些细胞暴露在E2 + P4 (10−8米/ 10−6M,分别地。)(Sigma-Aldrich) 12天模仿分泌阶段(40]。细胞decidualization证实了分析的分泌胰岛素样生长因子结合蛋白1 (IGFBP-1)的酶联免疫吸附试验(ELISA)。细胞在TriReagent收获(Sigma-Aldrich)正常化IGFBP-1浓度与总DNA含量。

2.3。隔离和胎盘绒毛外植体的文化

妊娠早期人类胎盘样品( 标本)后得到选择性终止妊娠孕周8 - 10时从医院的Campostaggia(意大利锡耶纳)。收集后的组织进行了书面知情同意的患者和当地伦理委员会批准(VITRO-RIP 2013),按照赫尔辛基宣言的指导方针。组织被带到实验室和加工后最多2 h内集合。在寒冷的血清样本冲洗DMEM-F12无酚红(Lonza BioWhittaker)和补充1%的青霉素和链霉素(Sigma-Aldrich)和1%的谷酰胺(Sigma-Aldrich),去除过多的血液。绒毛外植体切割如前所述(13]。短暂、小片段的绒毛技巧(15 - 20毫克湿重)被孤立起来,放在Millicell-CM培养皿插入(微孔Corp .)、贝德福德,MA)之前涂上了180μL(未稀释的基底膜基质(协同生物医学产品,贝德福德,MA),然后转移到24-well文化板块。外植体在250年保持在一夜之间μL 20%的血清DMEM-F12湿润O2和5%的公司2气氛在37°C允许附件基底膜基质。第二天,培养基的外室也被新的取代中包含治疗和250μL中等transwells加入了含有治疗。这一部分的研究是在实验室进行的生命科学、锡耶纳大学(意大利)。

2.4。实验程序
2.4.1。条件培养基从在体外Decidualized基质细胞

在体外decidualized基质细胞从单一捐赠者被播种在25厘米2水瓶(BD猎鹰)。细胞用于实验第二通道的文化。当达到80 - 90%的融合,细胞维持在一个中等缺乏荷尔蒙刺激(苯酚red-free DMEM-F12 + 1%抗生素/抗真菌的+ 0.1%牛血清白蛋白,BSA) 24 h。然后,文化(约1.3×106细胞/瓶)暴露在1纳米双酚a (Sigma-Aldrich),此外,孵化24 h。控制文化受到车辆(EtOH 0.1%)、双酚a是溶解在EtOH。BPA的治疗和控制文化进行了复制,在分离25厘米2烧瓶。在实验结束时,双方的培养基,BPA-treated和控制文化,分别收集在pyrogen-free无菌管和立即离心机在4°C 13000×g 10分钟。浮在表面的细分在整除,保持在−80°C,直到使用治疗胎盘外植体(从基质细胞条件培养液)。细胞在冰冷的收获里帕裂解缓冲(三基地40毫米,氯化钠150毫米,EDTA 500海里,特里同x - 100 1%,钠脱氧胆酸盐0.5%,和SDS 0.1%),含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒完成(罗氏),蛋白质提取。总的来说,进行了三个实验,每一个使用子宫内膜组织从一个捐助者。

2.4.2。治疗胎盘绒毛外植体

绒毛外植体受到以下媒体:(我)C:苯酚red-free DMEM-F12,补充0.05% BSA;(2)碳碳:条件培养基从原来的基质细胞暴露于单独的车辆;这种介质稀释1:2用新鲜DMEM-F12(补充0.1% BSA)在使用胎盘外植体;(3)c-BPA:条件培养基从原来的基质细胞暴露于1纳米双酚a;这种介质稀释1:2和使用如上描述;(iv)双酚a:苯酚red-free DMEM-F12,补充0.05% BSA和添加0.5 nM BPA。

总的来说, 实验进行,每一个使用胎盘外植体从一个捐助者。BPA的治疗和控制文化进行复制;单样本外植体分别收集和处理。24小时的治疗,30岁μL中等收集,离心机在4°C 13000×g 10分钟,并存储在−直到MIF和80°Cβhcg测定。文化与同等体积(30补充道μL)各自的接触介质和孵化24小时。最后的实验(48小时),总中收集,离心机,并存储−直到MIF和80°Cβhcg测定。绒毛外植体被基底膜基质和沉浸在冰冷里帕裂解缓冲对蛋白质提取。

2.4.3。测量自由的BPA在体外Decidualized基质细胞培养

为了估计数量的免费BPA在媒体上,250年μL细胞悬液的浓度1×106细胞/毫升在体外decidualized基质细胞被播种在25厘米2水瓶(BD猎鹰)。当达到80 - 90%的融合,细胞保持饥饿(缺乏荷尔蒙刺激,补充0.1% BSA)中为24小时。然后细胞暴露于EtOH 0.1% (C)或双酚a (BPA 1μM;双酚a 1海里)在饥饿中、孵化24小时。在每组样本(C, BPA 1μM, BPA 1海里)介质是免费化验BPA,之前(M)和之后(T)暴露在细胞。温暖的细胞被洗两次磷酸盐缓冲盐水(PBS),添加新的饥饿中,缺乏BPA和孵化24小时。最后的孵化时间,介质(W)和细胞溶解产物(R)离心机在4°C 13000×g 10分钟并存储在−80°C到BPA化验。饥饿的样本介质和丽珀•缓冲区,也没有接触到细胞收集并作为空白样品。免费BPA的数量样品测定的气相色谱法结合质谱(gc - ms)。

2.5。方法
2.5.1。流式细胞术

流仪分析是利用BD FACSAria II流式细胞分析仪进行隔离后的一天,一个新的样品。隔离后,细胞(约4×106细胞/瓶)镀在75厘米2烧瓶完全培养基(DMEM-F12, 10%的边后卫,1%的抗生素/抗真菌的)。后的第二天,细胞被洗两次在温暖的无菌PBS和分离Accutase 5 x(细胞分离解决方案,热电子)。至少1×10的数量6细胞/毫升用于流仪分析。细胞悬液在PBS洗两次,分为immunolabeling试管。为了找到公认的杂质在细胞培养、细胞培养在黑暗中30分钟与异硫氰酸荧光素(FITC)共轭单克隆抗体CD31 (PECAM-1) (F8402数量,Sigma-Aldrich),内皮细胞的标记,和CD326 (EpCAM)(数量342203,BioLegend),上皮细胞的标记。控制试管没有染色。

2.5.2。免疫细胞化学

子宫内膜细胞培养获得的纯度也评估在每个标本,通过使用特定的标志immunofluorescent染色基质细胞(波形蛋白)和一个特殊的标记上皮细胞(细胞角蛋白)如前所述41)做了一些调整。250年μL细胞悬液(1×105细胞/毫升)被播种Thermanox塑料盖玻片,在4板(ThermoScientific Nunc,罗切斯特,纽约,美国)完成DMEM-F12中、调湿大气中5%的孵化有限公司2在空气中,在37°C到融合文化(约5天)。细胞被固定在多聚甲醛。的非特异性结合后,避免了通过孵化兔血清(Sigma-Aldrich)。然后,幻灯片是孵化主要针对波形蛋白抗体对细胞角蛋白(σ-奥尔德里奇)或(Sigma-Aldrich)。Cy3标记抗体(Sigma-Aldrich)作为二级抗体。盖玻片是安装在Vectashield DAPI(向量实验室,Inc .,伯林盖姆,CA)。人类子宫内膜基质细胞反向共焦显微镜下观察(尼康Eclipse Ti-E)。

2.5.3。组织和细胞溶解产物

胎盘外植体的总溶解产物或子宫内膜基质细胞培养中收获里帕裂解缓冲和用冰。总溶解产物离心机在12000 g×15分钟在4°C和存储−80°C到使用。胎盘外植体的溶解产物进行评估总蛋白浓度的布拉德福德蛋白质化验(BioRad),而从子宫内膜基质细胞溶解产物进行评估BPA含量的气相色谱法结合质谱(gc - ms)。

2.5.4。ELISA检测

IGFBP-1。IGFBP-1分析子宫内膜基质细胞的培养基的标记decidualization通过使用商业ELISA测定(研发系统)。这样做是在制造商的指示。短暂,盘子被涂上一层捕获抗体一夜,第二天,避免了非特异性结合孵化与屏蔽解决方案(10毫米PBS, pH值7.4,5%(卷/期)渐变20)在室温下(RT)。标准和样品在重复添加。洗后,检测抗体添加和板块在沿板块提供孵化链霉亲和素辣根过氧化物酶与底物溶液,然后最后孵化20分钟在RT在黑暗中。反应是停止通过添加控制解决方案(2 N、H2所以4)。光密度的确定在450 nm的标(ThermoScientific)。IGFBP-1的浓度是由软件《创世纪》从一个标准曲线外推范围从12.5到2000 pg / mL,用人类重组IGFBP-1(研发系统)作为标准。数据归一化总细胞DNA含量,衡量NanoDrop (ThermoScientific)。表示为pg / IGFBP-1浓度μ克总DNA。

MIF。为了检测的MIF在媒介发布的绒毛外植体,比色夹心ELISA,先前设置在我们的实验室,使用(13]。一夜之间,96孔板被涂在RT与反MIF单克隆抗体(2μg / mL;研发系统)。然后洗盘子和洗的解决方案(10毫米PBS, pH值7.4,0.05%(卷/期)渐变20),300年被添加μL屏蔽解决方案(10毫米PBS, pH值7.4,1% (wt /卷)BSA (wt /卷)蔗糖5%),和孵化为1.5 h RT。标准和样本添加到复制(100μL /)和孵化2 h rt,然后洗盘子,和100年μL的生物素化的山羊反MIF抗体(200 ng / mL;研发系统)被添加到每个。盘子被孵化2 h RT然后洗。链霉亲和素辣根过氧化物酶(酶、旧金山、CA)随后添加到每个好,和一个20分钟在RT孵化。盘子洗,3,3,5,5-tetramethylbenzidine(酶)被添加到每个;反应停止后20分钟的2 N H2所以4。吸光度测量在450 nm使用标(ThermoScientific)。MIF浓度从标准曲线外推从25到2500 pg / mL的人类重组MIF(研发系统)作为标准。测定的灵敏度极限18岁pg / mL。内部,interassay变异系数分别为3.86(0.95)和9.14(0.47)%,分别。MIF浓度表示为pg /毫克的总蛋白质含量从其各自的胎盘外植体,由布拉德福德化验(BioRad)。

β人类绒毛膜促性腺。分泌的浓度β促在媒体上的绒毛外植体由商业评估immunoenzymometric化验后,制造商的指示(Radim SpA、Pomezia、意大利)。标准与重组体人β人类绒毛膜促性腺和样本中添加重复预镀96 -孔板。酶共轭(单克隆抗体辣根peroxidase-labeled anti-hCG稀释Tris-HCl和BSA)然后添加和孵化在rt,洗后30分钟,板与衬底孵化的解决方案。反应被阻塞的试剂和吸光度测量450海里使用ELISA SR 400标(Sclavo,锡耶纳,意大利)。的β标准浓度从标准曲线外推范围从12.5到2000个人/毫升的人类重组β人类绒毛膜促性腺(Radim SpA)作为标准。的极限灵敏度是2个人/毫升和检测的线性范围是0 - 2000个人/毫升。每个样本中获得的数据被表示为个人/毫克的总蛋白质含量从其各自的胎盘外植体,由布拉德福德化验(BioRad)。

2.5.5。气相

BPA的gc - ms测定使用的测试样本。定量分析是通过使用同位素稀释质谱技术(一)。校准阶段需要测定校正因子(放射性标记的响应因子:RF),天然标准: 在哪里 isotopically标记分析物离子峰面积(d16BPA)出现在标准的样本, 是一个天然的离子峰面积分析物(BPA)出现在示例中, 是d16双酚a浓度的标准样品 BPA浓度的样品。

校准过程进行了使用高纯度水,和空白样本包含在数据的计算。响应因子的值(RF)使用标准的解决方案包含已知浓度的测定isotopically标记BPA模拟,以及九个不同的BPA被分析物的浓度。一个已知数量的氘BPA标准被添加到每个样本分析。样品中分析物的浓度是使用指定的RF值,计算区域的价值得到样品中分析物,和isotopically标签标准添加到样本。

用气相色谱-质谱进行定量分析的监测模式(SIM)两种离子的双酚a和两个离子BPA-d16在不同的时间间隔。结果的平均空白值 ng / mL。这一部分的研究是在实验室里进行生殖免疫学和病理学系动物繁殖和食品研究所,Olsztyn,波兰科学院,波兰。

2.6。统计分析

数据分析GraphPad棱镜Version 5.0 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)。所有的数据 hcg和MIF显示为百分比意味着±SD和c的gc - ms分析获得的数据显示为ng / mL±SD,而IGFBP-1分析的数据显示为pg /μg总DNA±SD。所有数据被非参数统计分析克鲁斯卡尔-沃利斯测试。如果认为重要差异 。

3所示。结果

3.1。的有效性所使用的文化

主要从人类子宫内膜基质细胞的纯度是评估使用波形蛋白抗体免疫细胞化学(基质细胞的一个标志)和细胞角蛋白(上皮细胞的一个标志)。如图1,约有100%的细胞被应用与anti-vimentin (A),尽管没有证据表明免疫染色与anti-cytokeratin抗体(B)所示,表图1 (c)总结了三个子宫内膜标本信息用于本研究。流式细胞仪是用来评估污染内皮的百分比(anti-CD31抗体)和上皮细胞(图(anti-EpCAM抗体)2)。所有子宫内膜标本的分析( )显示的平均百分比 %的内皮细胞和 %的上皮细胞(图2)。基质细胞的分化成一个蜕膜表型被检查监控整个文化形态的细胞表现出一个多边形表型与E2 + 10天的启动后P4 (108米/ 106米)(图3(一个)和3 (b))。此外,decidualization基质细胞分析证实了decidualization标记的释放,IGFBP-1,媒体文化。这个标记被选中是因为子宫内膜基质细胞开始分泌IGFBP-1,以及催乳素,只有当它们分化成蜕膜细胞。事实上,IGFBP-1高度怀孕期间子宫内膜分泌的,似乎是参与调节人类迁移的滋养层(42]。

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图1
人类子宫内膜基质细胞的免疫荧光的特性。(一)细胞沾anti-vimentin抗体(红染色)。核与DAPI染色(蓝染色)。(b)细胞与anti-cytokeratin抗体为阴性染色。只有原子核,与DAPI染色(蓝色),是可见的。比例尺= 50μm。(c)表显示子宫内膜标本的起源信息用于这项研究。
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图2
代表流仪块人类子宫内膜细胞,在1号通道隔离后(1天)。(一)标记细胞。等高线图显示了清白的人口的细胞。(b)人口CD31 (EpCAM-1)染色细胞,内皮细胞的标志。(c)人口CD326 (EpCAM)染色细胞,上皮细胞的标志。数据阐述了BD FACSAria II软件。(d)表表达的细胞类型表示为平均百分比±SD 3子宫内膜标本。
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图3
代表人类的照片,倒置显微镜下观察子宫内膜基质细胞(尼康)。(一)子宫内膜基质细胞不暴露在荷尔蒙的刺激。spindle-like基质细胞的形状是可辨认的特征。(b)子宫内膜基质细胞与类固醇激素启动后12天(E2 + P4)。多边形形状,典型的decidualized细胞,是可识别的。比例尺= 200μm。

在文化中,子宫内膜基质细胞开始分泌大量的IGFBP-1已经启动与E2 + 4 - 6天后P4 (10−8米/ 10−6米),达到峰值后12天的激素刺激(分泌IGFBP-1的平均价值 pg /μg总DNA的第12天文化)。

至于绒毛外植体,证实了其可行性和功能在整个文化的分泌 人类绒毛膜促性腺和新创细胞的形成来自于extravillous滋养层培养期间所描述的Genbacev et al ., 199343]。

3.2。子宫内膜对BPA的贡献对胎盘分泌的影响β人类绒毛膜促性腺和MIF

外植体的胎盘绒毛检查双酚a的影响,直接或间接(endometrial-mediated)接触。在这项研究中,0.5 - 1 nM BPA被选中,为代表的数量浓度BPA在人类发现液体(44- - - - - -46]。此外,这样的浓度范围被证明是无毒的胎盘组织(33]。

图4显示 标准浓度的培养基中胎盘外植体对BPA介质条件或不受制于子宫内膜基质细胞。数据报告为平均数±标准差与比例控制。控制胎盘外植体分泌水平的增加 hcg从24到48 h,从而确认在文化滋养层的内分泌机能活动的时间。直接接触0.5 nM BPA显著刺激的释放 人类绒毛膜促性腺在48小时( 对C在24 h)。这也相比显著增加到48 h与从子宫内膜基质细胞条件培养液治疗之前暴露于BPA (c-BPA) ( 双酚a(图48 h与c-BPA 48 h)4)。没有观察到显著差异之间的介质条件不条件由子宫内膜基质细胞在24小时治疗(图4)。图5显示了MIF浓度(百分比平均±标准差与C)培养基的胎盘外植体处理由子宫内膜基质细胞培养基条件不条件。直接接触0.5 nM BPA大大触发MIF分泌在24小时( 与C)。外植体的效果是降低暴露之前从decidualized基质细胞条件培养液处理1 nM BPA (c-BPA)。


图4
的浓度 培养基的促绒毛膜绒毛的外植体接触EtOH 0.1% (C)、0.5 nM双酚a (BPA),或条件培养液(稀释1:2)从原来的decidualized基质细胞暴露于车辆(碳碳)或1 nM BPA (c-BPA)。课程持续了24小时的时间(白色酒吧)和48 h(灰色酒吧)。值归一化对绒毛外植体总蛋白质含量和比例表示为±SD和C的24小时 独立的实验(* BPA 48 h与c-BPA 48 h)。

图5
MIF在外植体的培养基浓度的绒毛膜绒毛暴露EtOH 0.1% (C), 0.5 nM双酚a (BPA),或从decidualized基质细胞条件培养液之前暴露于车辆(碳碳)或1 nM BPA (c-BPA)。课程持续了24小时的时间(白色酒吧)和48 h(灰色酒吧)。值归一化对绒毛外植体总蛋白质含量和比例表示为±SD和C的24小时 独立的实验(* * BPA 24 h和C 24 h)。
3.3。BPA水平Decidualized基质细胞培养

为了澄清的假定的原因不同的效果在胎盘外植体获得直接和间接暴露于BPA,自由BPA在基质细胞的数量或培养基用气相色谱-质谱(图进行了分析6)。


图6
免费的BPA浓度的培养基和细胞溶解产物decidualized基质细胞,并用gc - ms检测。C:曝光媒体包含车辆EtOH (0.1%);双酚a 1μM和BPA 1海里:1含有双酚a的接触媒体μ米或双酚a 1海里;M:媒体之前接触的细胞;T:媒体与细胞培养24小时;W:清洗媒体孵化24小时之前与细胞暴露于车辆(C组)或双酚a (BPA)组;接待员:细胞溶解产物里帕缓冲区,孵化后清洗介质。值表示在ng / mL±SD BPA的自由 独立的实验(* 和米;* * * 对M)。

对于这一分析,我们测量自由BPA在三个不同的样本集:细胞暴露于车辆(C),双酚a 1μ米,双酚a 1 nM(见图6)。在每组样本,媒介接触前化验子宫内膜细胞(M)和细胞接触后24 h (T)暴露的细胞被洗PBS和进一步孵化中没有双酚a为24小时;最后孵化,媒介(W)和细胞溶解产物,获得里帕缓冲(R),进行了分析。

如图6,没有双酚a的样本中检测出只包含车辆(C),同时与BPA接触媒体证明有希望的浓度BPA,平均价值 ng / mL(大约1.47μ双酚a 1米)μM和 ng / mL(大约3.53海里)对双酚a 1纳米(图6)。细胞接触后,免费BPA水平培养基显著降低 ng / mL, 1μ双酚a ( T和M), ng / mL, 1纳米BPA ( T和M)。有趣的是,媒介获得细胞首先洗,然后孵化与媒介缺乏BPA (W) ng / mL文化以前对待BPA 1μ米( W与M)和 ng / mL文化以前孵化与双酚a 1海里。洗细胞(R)还保留大量的BPA,对应 ng / mL,文化以前孵化与双酚a 1μ米( R和M), ng / mL,文化以前孵化与双酚a 1 nM ( R和M)。

4所示。讨论

这个研究表明BPA影响fetomaternal接口。子宫内膜基质细胞被选为孕产妇舱的模型因为人类血性绒毛膜型类型的胎座。这种类型的胎座式意味着事实上,变位后的上皮细胞层,人类的滋养层侵入的蜕膜间亲密接触与基质细胞组成。胎儿的组件是由体外外植体的人类绒毛膜绒毛从怀孕前三个月,一个生理模型反映胎盘母体子宫的建立和发展。在这项研究中,文化的胎盘外植体暴露在0.5 nM BPA或从子宫内膜基质细胞条件培养液之前暴露于1 nM BPA(中稀释1:2卷/卷的新媒介)。子宫内膜间质cell-conditioned介质被用来模拟maternal-mediated与双酚a污染。BPA浓度的范围内选择符合流行病学研究表明,双酚a是人类体液中发现的-30海里(0.444- - - - - -46]。我们的研究显示两个主要发现。(1)子宫内膜基质细胞能够“欺骗”双酚a,从而使其减少胎盘外植体可用。(2)子宫内膜基质细胞可以成为BPA的来源如果他们的周边环境缺乏这种化学物质。

发现都是在下面详细讨论。

(1)在我们的研究中,激素 促性和细胞因子MIF,两个分子之间的相互作用中扮演关键性的角色胎儿和母体组织,被选为端点的BPA活动在人类胎盘。结果表明,直接接触双酚a刺激释放这两个标记, 人类绒毛膜促性腺和MIF。另一方面,接触条件培养基从原来的子宫内膜基质细胞暴露于BPA并没有造成任何重大影响胎盘分泌的 人类绒毛膜促性腺和MIF。这可能表明子宫内膜细胞的保护作用对双酚a对人类胎盘。阐明子宫内膜基质细胞的贡献减少BPA影响胎盘,我们评估的BPA在文化媒体收集从子宫内膜细胞培养基。gc - ms分析表明,在细胞接触后24 h,培养基中的BPA含量减少了对给定的剂量。这可能表明,减少反应的绒毛外植体在接触到子宫内膜cell-conditioned介质是由于较低的可用性的BPA。此外,数据表明,双酚a是由子宫内膜基质细胞吸收或代谢。这样的假设是由动物研究显示,大鼠子宫内膜能够吸收和代谢BPA,从而保护胎儿(47]。BPA发生在肝脏的代谢转换谷胱甘肽转移酶和细胞色素P450酶(48,49]。这些酶存在于人类子宫内膜,从而可能导致BPA新陈代谢(50- - - - - -52]。

(2)子宫内膜基质细胞在暴露于BPA可以成为这种化学物质的来源。当细胞,第一次接触到双酚a,在零环境中培养,发现BPA的培养基。同意BPA的亲脂性的性质(53),结果表明扩散向内或向外的细胞,浓度梯度。在此基础上,假设人类子宫内膜BPA在日常生活中积累并且可能释放BPA怀孕期间胎儿的隔间。针对收集到的数据,重要的是要强调,BPA是通过胎盘转移(33]。运输通过胎儿膜已经被双酚a的存在还演示了在胎儿组织和脐带血48]。

策略并不排除使用游离分子潜在的BPA和培养基中诱导基质子宫内膜细胞在胎盘也可以起到保护的作用。需要进一步的研究来阐明这个问题。

胎盘外植体的使用相同的模型,我们之前显示1 nM para-nonylphenol ( np),一种类似雌激素的化学,分享它的许多属性与双酚a,也有类似的效果的观察,导致的感应 hcg和upregulation面板的细胞因子,显著的gm - csf和il - 1054,55]。以前的和现在的数据显示,雌激素的化学物质,也就是说, np和BPA,不平衡endocrine-paracrine分泌fetomaternal接口。双酚a浓度,即1子宫内膜基质细胞和0.5 nM胎盘,在人体组织和体液中的平均浓度。关于怀孕,水平检测孕产妇和胎儿液体范围从1到36海里[18,46]。

此外,据我们所知,这第一次研究显示母婴克服相互影响的作用等外源性物质的影响,双酚a对人类胎盘。事实上,我们表明,直接接触BPA胎盘分泌的MIF和触发 人类绒毛膜促性腺。这些影响被废除的存在从子宫内膜细胞条件培养液以前对待BPA。 促促进MIF在人类子宫内膜分泌和施加积极的影响,也就是说,通过刺激血管生成分子如VEGF (56,57]。它可以这样认为 人类绒毛膜促性腺调节MIF在人类胎盘分泌。这可以解释观察到的类似的趋势这两个标记。在生理条件下的分泌 人类绒毛膜促性腺刺激雌激素,而它是由孕酮抑制(58]。 尿促促进分化和入侵的滋养层和具有免疫调节特性21]。的过度释放βhcg对暴露在BPA提出担忧影响,这种化学物质可以施加在fetomaternal接口。事实上,水平的提高 人类绒毛膜促性腺在妊娠病理已报告,如子痫前期(59,60]。同样,MIF在怀孕期间母体血清浓度至关重要的繁殖成功率和胎儿健康。尤其是在怀孕早期MIF水平较低与复发性流产有关,而高水平在怀孕后期与子痫前期,孕产妇和胎儿死亡率和发病率的主要原因[全球60,61年]。通过改变这两个重要的分子的分泌fetomaternal接口,双酚a可能会导致妊娠的发病症状,因此胎儿和产妇的健康是有害的。

5。结论

通过使用在体外模型模拟人类妊娠孕产妇和胎儿的隔间,我们证明BPA浓度非常低(0.5 - 1海里),环境化学代表危险和围产期的生活,改变胎盘分泌的激素 hcg和细胞因子MIF的关键分子immune-endocrine相声fetomaternal接口。子宫内膜基质细胞似乎在胎盘,发挥保护作用时未发现BPA影响胎盘文化受到BPA-treated子宫内膜细胞条件培养基。尽管涉及的分子机制仍不清楚,获得的数据明确显示,产妇子宫内膜可以积累或释放BPA,取决于周围的环境。考虑到污染与双酚a发生在日常生活中,长期的潜在影响子宫内膜的积累这种化学物质可能在怀孕对胎儿/胎盘组织一个主要问题。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究支持了国家科学中心的格兰特Preludium没有。2013/09 / N / NZ5/03062,额外的法定基金从波兰科学院和基金会蒙特悠久的锡耶纳(意大利锡耶纳)。作者真诚地承认在体外设施的动物繁殖和食品研究所,波兰科学院,流式细胞仪分析,物理化学和医学比亚韦斯托克大学的gc - ms分析。