文摘

客观的。调查(IL-17A的表达水平及临床意义⁺和/或IL-17F⁺)Th17细胞在慢性牙周炎患者IL-23监管(CP)和健康对照组(HC)。材料和方法。整个外围收集血液样本来自30个CP患者和健康对照组25。流式细胞仪是用于测试(IL-17A⁺和/或IL-17F⁺)Th17表达水平。重组体人IL-23 (rhIL-23)是用于检测Th17细胞分化和扩张。之间的相关系数分析Th17表达水平和临床参数,采用SPSS软件进行了分析。结果。流式细胞术结果显示IL-17A⁺IL-17F⁻和IL-17A⁻IL-17F⁺Th17都增加了CP组相比,HC组(P< 0.01),同时,在重组人类IL-23 (rhIL-23)刺激,IL-17A的数量⁺IL-17F⁻Th17细胞显著增加CP和HC组(P< 0.01)。有趣的是,IL-17A⁻IL-17F⁺Th17细胞只会增加在CP组rhIL-23刺激。此外,相关系数分析显示IL-17A之间显著相关⁺IL-17F⁻Th17细胞和附件丢失或探测深度(P< 0.05)。结论。本研究表明,IL-17A⁺IL-17F⁻和IL-17A⁻IL-17F⁺Th17细胞可能参与牙周炎的发病机理。这些Th17细胞疾病发病机理的作用需要进一步研究。

1。介绍

牙周炎是最受欢迎的口腔慢性炎性疾病,特点是在牙齿牙周组织的破坏。在慢性牙周炎患者,免疫细胞产生的细胞因子可以调节免疫反应等不同牙周细菌放线杆菌actinomycetemcomitans或porphyromanas gingivalis,并进一步发挥保护或毁灭性的作用在疾病进展1,2]。虽然免疫机制在牙周炎发病机制仍不清楚,由CD4炎症⁺T淋巴细胞已经被视为一个重要特性的发病机理3,4]。

Th17,这部小说CD4人口⁺T细胞亚群,已经发现最近以其独特的生产能力interleukin-17 (IL-17,也叫做IL-17A) [5]。Th17细胞的主要作用及其有效的细胞因子IL-17已被描述在不同的模型炎症介导的破坏和自身免疫性疾病,如克罗恩氏病或类风湿性关节炎(6]。此外,先前的报道还显示,Th17细胞发病机理中可能扮演小说重要的角色子集细胞介导的组织损伤所引起的免疫反应对微生物感染(7]。然而,其他调查显示,Th17细胞可能产生IL-17A发挥保护作用的中性粒细胞招募被破坏地区牙周炎病变(8]。尽管Th17细胞最近在牙周炎发病机理的研究吸引了更多的关注,Th17细胞的特定角色在牙周炎现在仍然有争议9,10]。

IL-17F最近吸引了更多的关注由于其巨大的相似性IL-17A和可以作为为分泌或与IL-17A形成(11]。基因编码IL-17A和IL-17F在相同的染色体区域和局部coexpressed Th17细胞(12]。类似于IL-17A, IL-17F还可以利用IL-17RA和IL-17RC受体复杂的信号传感器诱导促炎细胞因子的表达在人类的许多细胞类型(13]。IL-23是一种新发现的细胞因子,Th17细胞的分化和增殖的重要作用[14,15]。此外,IL-23还发现参与人类疾病包括牙周疾病。例如,先前的研究表明,IL-23 mRNA和蛋白显著升高在牙周损伤控制网站(16,17]。然而,我们仍然不知道是否增加细胞因子IL-23在牙周炎影响Th17扩张和分化。

牙周炎发病机理在我们之前的研究,我们发现,血清IL-17A水平升高在牙周炎患者比健康对照组(18]。然而,我们的知识的程度,还有少报道关注(IL-17A之间的相关性⁺和/或IL-17F⁺)Th17细胞和牙周炎。所以,我们不知道(IL-17A⁺和/或IL-17F⁺)Th17细胞可能参与该病发病机理。因此,目前临床研究的目的是检测(IL-17A的表达水平⁺和/或IL-17F⁺在牙周炎患者)Th17细胞。此外,我们也会调查,在重组IL-23 (rhIL-23)刺激,是否更多(IL-17A⁺和/或IL-17F⁺)Th17细胞会产生疾病发病机理。和有什么(IL-17A的重要表达水平之间的相关性⁺和/或IL-17F⁺)Th17细胞和牙周临床参数?

2。对象和方法

2.1。研究样本

本研究机构审查委员会批准中国西部四川大学口腔学院(协议号S2011108),在这项研究中,参与者们知情同意。小心在6网站/牙齿牙周检查(近中颊的、midbuccal distobuccal;mesiolingual、midlingual distolingual)记录的参数包括临床附着丧失(AL),探测深度(PD), Silness-Loe菌斑指数(PI), Loe-Silness牙龈指数(GI)的分数。临床附着丧失(AL)测量的距离牙周袋深度cementoenamel结。探测深度(PD)的测量是由测量距离牙龈边缘与校准牙周袋的底部牙周探针。所有CP患者牙周病学从我们部门登记,与临床诊断和确诊为慢性牙周炎疾病(病态的依恋损失和探测深度超过3毫米)牙周病医师。人口特征和临床参数两组被列在表中1。经过仔细检查,整个血液样本的外周血单核细胞(PBMC)提取。

2.2。隔离和CD4的识别⁺T淋巴细胞

提取外周血单核细胞(PBMC)是由淋巴细胞分离设备(σHistopaque 10771年,美国)。从人类外周血分离PBMC细胞与反CD4标记⁺磁性粒子(猫。557767号,BD生物科学,圣地亚哥,美国CA)。人类CD4⁺T淋巴细胞是磁分离PBMC BD IMagnet(猫。数量552311,BD生物科学)根据指令协议。CD4细胞的纯度⁺T细胞下一步测试前应超过95%。为了演示浓缩的效率和选择步骤,与APC鼠标反CD4细胞被染色(猫。555349号,BD生物科学)和FITC鼠标反CD3(猫。555332号,BD生物科学)。同形像控制染色了Simultest IgG2a / IgG1(猫。340394号,BD生物科学)。流式细胞术在贝克曼库尔特执行FC500流式细胞仪系统。

2.3。文化和CD4的刺激⁺T淋巴细胞

CD4⁺T细胞培养在子集RPMI 1640媒体包含10%的边后卫(美国Gibco), 50 U /毫升青霉素、50μ1×10 g / mL链霉素⁶细胞/毫升,在37°C, 5%的公司₂条件。CD4⁺T细胞分离PBMC富含2μg / mL anti-CD3(猫。数量555336,BD生物科学)和2μg / mL anti-CD28(猫。数量555725,BD生物科学)单克隆抗体和50 ng / mL重组人类- 2(猫。554603号,BD生物科学)。CD4⁺T细胞被刺激如上所述,随后进行CD4细胞⁺磁选提高纯度> 95%。人类重组IL-23 (rhIL-23)添加到CD4的上层清液⁺T细胞与最后一个20 ng / mL刺激CD4浓度⁺分化和扩张为24小时。每个样本分为两组根据接收rhIL-23刺激。

2.4。流式细胞术检测IL-17A⁺和/或IL-17F⁺Th17细胞

与rhIL-23刺激后的24小时内,细胞培养的50 ng / mL佛波醇12-myristate 13-acetate (P1585,σ圣路易斯,密苏里州,美国)和500 ng / mL ionomycin(美国σI0634)和蛋白质运输抑制剂BD Golgistop 0.7μL /毫升(猫。数量554714,BD生物科学)防止细胞因子分泌,让细胞内细胞因子积累。然后,CD4⁺T细胞是37°C的培养条件下,5%的公司_2,为4小时孵化。细胞被固定和permeabilized BD Cytofix / Cytoperm洗固定解决方案(猫。数量554715,BD生物科学)允许进入荧光抗体与目标细胞因子。使用BD Cytofix / Cytoperm(猫。数量554715,BD生物科学)来执行细胞固定和缓冲洗。细胞被沾染了PE鼠标反IL-17A(猫。560436号,BD生物科学)和Alexa萤石488鼠标反IL-17F(猫。561331号,BD生物科学)。同形像控制沾Simultest IgG2a / IgG1(猫。340394号,BD生物科学)。 Flow cytometry was performed on a Beckman Coulter FC500 flow cytometry system.

2.5。统计分析

所有数据被社会科学统计软件包分析14.0版本软件(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。采用卡方检验比较不同性别在表1。学生的t以及被用来比较两个样本的意味着两组。与斯皮尔曼相关系数的相关系数进行了分析被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。表达水平的IL-17A⁺IL-17F⁻和/或IL-17A⁻IL-17F⁺Th17细胞CP和HC组

分离CD4⁺验证了反CD3、CD4 T细胞流式细胞术抗体检测CD4细胞纯度。结果表明,CD4细胞的纯度⁺T从PBMC可以达到超过95%的百分之一(图1)。流式细胞术的样本染色和IL-17A IL-17F抗体是显示在图2并进一步数据分析如图3。流式细胞仪分析显示IL-17A含量严重超标⁺IL-17F⁻Th17细胞(图3(一个),)和IL-17A⁻IL-17F⁺Th17细胞在CP组相比,HC组(图3(一个),)。然而,它没有表现出统计上的显著差异与IL-17A CP组和HC组之间⁺IL-17F⁺双正Th17细胞(图3(一个),)。

3.2。表达水平的IL-17A⁺IL-17F⁻和/或IL-17A⁻IL-17F⁺Th17细胞在CP和HC组rhIL-23刺激

CD4⁺T细胞是分开CP患者和HC组外周血CD4⁺磁选设备提高纯度和体外rhIL-23刺激下培养24小时。流式细胞术分析是用来测试在几个变化百分比Th17细胞(图4)。它显示IL-17A水平显著升高⁺IL-17F⁻Th17细胞(图5(一个),)在CP组和HC组rhIL-23刺激。然而,只有IL-17A⁻IL-17F⁺Th17细胞数量显著增加在CP组rhIL-23模拟(图5 (b),),而不是在HC组(图5 (c),)。考虑IL-17A⁺IL-17F⁺Th17细胞数量变化rhIL-23刺激后,没有发现统计学意义在CP组和HC组rhIL-23刺激(图5 (c),)。

IL-17A⁺IL-17F⁻和IL-17A⁻IL-17F⁺Th17细胞数量绘制作为附件损失的函数CP患者(图6)。它显示明显,CP患者证明IL-17A增加⁺IL-17F⁻和IL-17A⁻IL-17F⁺Th17细胞与健康个体的水平相比。

3.3。相关系数的IL-17A⁺IL-17F⁻和/或IL-17A⁻IL-17F⁺Th17细胞表达水平与临床参数

相关系数分析显示IL-17A积极显著的相关性⁺IL-17F⁻Th17细胞损失和探测深度(表与依恋2,)。它还显示IL-17A之间显著相关⁻IL-17F⁺Th17细胞和CP组(表中附件丢失2,)。然而,IL-17A之间并没有显著相关性⁻IL-17F⁺Th17细胞数量和探测深度的CP患者(表2,)。此外,它还显示无显著的相关性两个Th17细胞和菌斑指数或牙龈指数(表2,)。

4所示。讨论

近年来,Th17细胞吸引了越来越多研究人员的关注和被确认在外周血和地方牙周炎患者的病变(19,20.]。虽然我们之前的研究都集中在相关Th17细胞因子的表达水平在牙周炎患者中,我们仍然不知道IL-17A的表达水平⁺IL-17F⁻和/或IL-17A⁻IL-17F⁺Th17细胞CP患者与健康对照组相比。因此,这是第一个研究报告IL-17A水平升高⁺IL-17F⁻和IL-17A⁻IL-17F⁺Th17细胞在慢性牙周炎。目前的结果奠定了基础理解IL-17A的潜在作用⁻IL-17F⁺Th17牙周炎的发病机制。

以前的体外测试支持的假设Th1细胞与牙周稳定的病变,而Th2细胞疾病进展(21]。例如,先前的报告显示,一个破坏性的角色不同的Th细胞在牙周炎是指Th2子集,也提出了牙周损伤(22]。然而,除了Th1、Th2细胞,最近的一项调查也表明,Th17子集可能osteoclastogenic效应(23]。Th17细胞通过细胞因子信号的产品有别于得罪Th1、Th2子集(24,25]。报告显示,Th17参与牙周骨破坏通过IL-17生产(26),可能会被抑制分子是1(发育内皮轨迹1)(27),表明新兴在牙周炎发病机理中的作用。

体外试验表明,人类重组IL-23可以显著提高IL-17A的表达水平⁺IL-17F⁻和IL-17A⁻IL-17F⁺Th17细胞在CP组和HC组。然而,我们的知识程度,精确的角色IL-23在当地牙周损伤仍然是模糊的。在我们之前的研究中,我们发现IL-23表达水平的增加患病的牙周损伤,建议其参与牙周破坏的发病机制(17,28]。先前的报道表明,Th17细胞表达IL-17 IL-23-dependent方式(14]。此外,在我们之前的研究中,我们确实发现显著升高IL-23表达水平在当地CP患者病变(18]。然而,尽管在CP血清IL-23并不显著升高,我们仍然发现CP患者的血清IL-17水平增加。这可能归因于其他Th17促进细胞因子il - 1和il - 6 (14]。

之前报道,牙周疾病发病机理可能不只是伴随着Th1 / Th2平衡的结果,但这些概要文件的免疫反应也可能深刻地受到其他像Th17子集,牙周炎中发挥不可或缺的作用。连同我们的先前的研究结论,目前的结果重新肯定,Th17及其细胞因子的表达模式可能与牙周炎的临床参数,可能参与了疾病进展。如上所示,慢性牙周炎表现出慢性炎症参与了有害微生物感染和随之而来的免疫炎症反应。因此,在本研究中,我们描述了三个不同的Th17细胞CP和HC组。显然,IL-17A水平的增加⁺IL-17F⁻和IL-17A⁻IL-17F⁺Th17细胞在CP组与附件相关损失和探测深度,表明可能有这些Th17细胞在牙周炎的潜在机制。

IL-17F最近吸引了更多的关注由于其巨大的相似性IL-17A,和基因编码IL-17A IL-17F在相同的染色体区域和局部coexpressed Th17细胞(11,12]。类似于IL-17A, IL-17F还可以利用IL-17RA和IL-17RC受体复杂的信号传感器诱导促炎细胞因子的表达在人类的许多细胞类型(13]。在我们的研究中,流式细胞术结果显示有IL-17A含量严重超标⁺IL-17F⁻和IL-17A⁻IL-17F⁺Th17细胞CP组相比,HC组。因此,IL-17A⁻IL-17F⁺Th17细胞也可能在牙周疾病像IL-17A扮演重要的角色⁺IL-17F⁻Th17细胞作为Th17细胞在牙周炎与附件相关损失。当rhIL-23刺激下,更多IL-17A⁺IL-17F⁻Th17细胞会产生CP组相比,HC组,也只有在CP组IL-17A的变化⁻IL-17F⁺Th17显示比HC组显著增加。因此,目前的研究表明,IL-17A⁺IL-17F⁻和IL-17A⁻IL-17F⁺Th17细胞被完全参与疾病发病机理的CP组。

综上所述,这个临床研究表明IL-17A⁺和/或IL-17F⁺积极Th17可能参与牙周炎发病机理。Th17细胞之间进一步的流行病学研究和牙周疾病应该调查,应进一步研究和可能的病理关系。与此同时,在进一步的研究中,我们应该更加注意相关Th17细胞因子的作用IL-17A和IL-17F测试这两种细胞因子如何影响牙周韧带成纤维细胞,通过信号通路和细胞因子IL-17A IL-17F可能影响促炎症介质释放。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81371150和81371150),中国博士后科学基金资助项目(2014 m550767),项目由北京博士后研究基金会(2014 zz002)。