文摘
一氧化氮捐赠者和吸入一氧化氮(间接宾语)可能会降低缺血/再灌注损伤报道在动物和人体模型。我们调查了再灌注损伤的衰减,是否被他人,接受膝关节置换术的患者可以复制当病人脊髓麻醉。45个患者被随机分为三组()。组1和3是接收伊诺80 ppm或安慰剂(氮、N2)在整个操作,组2只收到伊诺开始和结束时的操作。血液样本采集手术前,手术结束时,术后2小时。肌肉活检来自股四头肌肌肉缺血前后。没有增加等离子体水平的可溶性粘附分子:ICAM, VCAM, P-selectin, E-selectin, HMGB1的或任何团体。有低数量的CD68 +巨噬细胞和内皮细胞表达ICAM VCAM,和P-selectin肌肉免疫组织化学分析,之前和之后的缺血。没有内皮细胞激活和炎症反应的迹象在本地既不系统也不可能检测到。炎症反应的缺失问题缺血/再灌注模型,但也可能是相关EudraCTnr麻醉方法的选择。
1。介绍
肢体手术使用止血带提供不流血的外科领域一直在利用一些人类研究模型的缺血/再灌注(I / R) [1- - - - - -4]。不同的麻醉方法,包括总体和局部麻醉(4),已经被使用来影响氧化应激和炎症反应在这些模型中所看到的,和评价的炎症反应已经完成通过测量血液中炎性变量(1- - - - - -4和肌肉活检2]。
缺血和再灌注(I / R)损伤有重要作用的发病机制的临床条件如中风、心肌梗死和器官移植5- - - - - -7]。再灌注,在缺血后组织提供必要的氧气和其它代谢基质,细胞坏死的结果也在加速过程和可能导致长时间缺血(一样的后果5,8]。再灌注期间形成的活性氧(ROS)刺激细胞因子和趋化因子的生产通过核因子B (NF -B)激活。同时,ROS可能导致增加之间的失衡不同白细胞与血管内皮细胞粘附分子的表达,减少大量的antiadhesive一氧化氮(NO) (8- - - - - -10]。
微血管屏障破坏水肿和减少灌注发生由于中性粒细胞粘附,血栓形成,血管外的隔间和中性粒细胞的移民,这一过程与粘附分子的表达增加(8,11]。NO-donors(例如,硝普酸、diethylamine-NO S-nitrosoglutathione)已经证明降低表达粘附分子(ICAM;细胞间粘附分子VCAM;血管粘附分子,P-selectin),而抑制NO-synthesis增强表达在人类内皮细胞(9,12,13]。因此,ROS和之间的平衡似乎是一个重要的因素对于白细胞和血小板粘附引起I / R。粘附的主要网站(滚动)是postcapillary小静脉的白细胞与内皮细胞相互作用发生时,所有依赖于粘附分子(14]。
吸入NO(间接宾语)减毒炎性反应在接受膝盖手术的患者不流血的技术使用止血带在全身麻醉(15]。没有外生管理也已被证明能够发挥抗炎作用在其他I / R设置,两个动物(16- - - - - -18和人类19]。
我们旨在调查是否膝盖手术局部麻醉在止血带可以作为模型来研究I / R对本地和系统性炎症激活。此外,我们旨在研究伊诺的影响在这个上下文。因此,我们进行了一个随机对照研究的意图来评估潜在的炎症调节伊诺在这个模型的影响。
2。材料和方法
2.1。病人和研究设计
《京都议定书》是人类研究伦理委员会批准的卡罗林斯卡医学院,斯德哥尔摩,瑞典的医疗产品。从每个病人得到书面知情同意。
患者(膝关节表面置换术)计划在脊髓麻醉的一个特定的整形外科医生(啊)卡罗林斯卡大学医院,连续Huddinge,斯德哥尔摩,瑞典,包括在研究(表1)。研究设计是呈现在图1。病人被随机分为三组(每组)和外科医生,麻醉,实验室工作人员对病人也不清楚。随机化,使用密封的信封,患者来到手术室时发生。组1收到伊诺80 ppm, 3组接受安慰剂(N2),在整个操作,而第二组,部分伊诺(皮诺),收到伊诺80 ppm从一开始直到止血带缺血期间激活(300毫米汞柱)休息,直到血液循环恢复(释放止血带)。
18或20计,静脉行插入到肘的窝或前臂的血液抽样(BD Venflon)。脊髓麻醉是由麻醉师是谁没有参与这项研究。一系列bupivacaine 0.5% 12.5 - -17.5毫克和0.04%吗啡0.1 - -0.2毫克取决于个别病人。之后,一个氧气面罩,嘴巴和鼻子,5升/分钟的氧气(Eco氧气面罩,Intersurgical有限公司,英国)与没有或安慰剂,混合应用。高铁血红蛋白被每小时的血液样本。手术和肌肉活检是同样的整形外科医生(啊)。肌肉活检在止血带后5分钟内激活和释放。
在手术过程中病人不断与异丙酚镇静(0.5 - -4.0毫克/公斤体重/小时)。
2.2。实验室调查
高铁血红蛋白与ABL800 Flex血液气体测量仪器(辐射计医疗、Brønshøj、丹麦)。血液为等离子体分析在EDTA收集管和离心液在4000转10分钟+ 4°C。等离子体是储存在−80°C进行后续分析。等离子体ICAM水平(细胞间粘附分子),VCAM(血管粘附分子),E-selectin,按照制造商的指示和P-selectin测量使用多路复用酶联免疫试剂盒(研发系统,阿宾顿,英国),设计用于Luminex分析仪。HMGB1蛋白1(高机动组框)分析了使用ELISA (Shino-Test公司(日本)。
2.3。吸入一氧化氮和安慰剂(氮、N2)
没有(最终混合气体的浓度80 ppm没有激发气体,INOmax,伊卡里亚岛公司,汉普顿,新泽西,美国)或安慰剂(氮、N2伊卡里亚岛Inc .)是通过INOvent交付系统管理(美国麦迪逊Datex-Ohmeda Inc .)。二氧化氮(不2)是不断地测量在吸气(INOvent)推荐的制造商。
2.4。肌肉活检
肌肉活检,测量约毫米,来自骶股内侧肌前后止血带。第二个活检是来自同一地区第一个。肌肉活检立即冻结在异戊烷(C5H12液态氮和储存在−80°C进行后续分析。从每组七个病人活检进行了分析。这些被选中的病人的组织病理学和缺血后活组织检查是好的。
2.5。免疫组织化学
关于ICAM肌肉活检标本进行分析,VCAM, P-selectin和CD68 /巨噬细胞表达使用免疫组织化学技术。连续7µm横向低温恒温器部分是安装在玻璃幻灯片和空气干燥30分钟前固定在寒冷(+ 4°C)丙酮为3.5分钟(30秒50%丙酮和3分钟100%)。幻灯片被冲洗在磷酸缓冲盐(PBS) 10分钟左右,然后用1%的H2O2+ 2%南3在室温(RT) 60分钟在黑暗中消除内源性过氧化物酶活性。幻灯片被冲洗分钟之后在PBS和孵化和1%的马血清(向量实验室Inc .,伯林盖姆、钙、美国)在PBS 15分钟,以避免非特异性结合。主要抗体(anti-CD54 / ICAM-1、鼠标IgG1 Serotec,牛津大学,英国;anti-CD106 / VCAM-1、鼠标IgG1 BD Pharmingen,圣地亚哥,美国;anti-CD62P / P-selectin,鼠标IgG1,圣克鲁斯生物技术公司,海德堡,德国;anti-CD68 /巨噬细胞、鼠标IgG1 Dako / S,一夜之间,斯特鲁普、丹麦)被应用的部分在一个潮湿RT室。作为一个负控制我们使用了一个无关紧要的小鼠抗体(isotype-matched无关紧要、鼠标IgG1 Dako / S,斯特鲁普,丹麦)作为主要抗体。
在PBS洗涤后分钟二次抗体(生物素化的、马anti-mouse免疫球蛋白,向量实验室Inc .,伯林盖姆,CA,美国)在PBS稀释,1%正常马血清在RT应用于部分30分钟洗在PBS紧随其后分钟。avidin-biotin复杂的部分被孵化(avidin-biotin-horseradish过氧化物酶复杂、Vectastain ABC-HP装备,向量实验室Inc .,伯林盖姆,美国CA) 45分钟rt,洗后在PBS是使用3分钟过氧化物酶反应,3′-diaminobenzidine(民建联基质包过氧化物酶,向量实验室Inc .,伯林盖姆,CA,美国)7分钟紧随其后在PBS分钟洗。部分被轻复染色与梅耶尔的苏木精和安装使用缓冲甘油。
2.6。评价染色
组织部分进行了分析使用Reichert-Jung Polyvar 2(徕卡微系统公司位于德国)。Semiquantification(得分0、1 + 2 + 3 +)是由两个独立的调查员,失明的学习小组。细胞的数量积极ICAM染色,VCAM P-selectin和CD68 /巨噬细胞估计从整个组织部分。
2.7。统计数据
统计分析评估治疗的效果和I / R的影响随着时间的推移进行两因素重复测量方差分析(方差分析)与事后比较(矫正)时适用,而符号检验是用于非参数数据(肌肉活检)。5.5 Statistica Windows系统被用于分析。15个人将样本组,90%的力量,使注意到的差异15%的可溶性血浆P-selectin(α= 5%的显著性水平值)。
3所示。结果
等离子体水平的HMGB1, P-selectin, VCAM E-selectin所有未在任何时间点组间没有差异。此外,在三组没有显著变化。然而,可溶性ICAM显示一个小,但意义重大,减少两个三组(图2 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
之间没有相关性可以证明等离子体水平的可溶性粘附分子和HMGB1和缺血时间(E-selectin,ICAM,VCAM,HMGB1)。作为一个例证缺乏相关性为可溶性P-selectin如图3。
重复的肌肉活检发现分散CD68 +巨噬细胞,但是没有炎症细胞的集群。没有差异的表达CD68 +巨噬细胞在缺血后的切片。粘附分子的表达一直发现内皮细胞;ICAM均匀分散在肌肉细胞VCAM和P-selectin主要被发现在大血管(动脉和小静脉)。没有观察到的积极的毛细血管或细胞数量差异之前和之后的三组缺血和组内没有变化有关的表达粘附分子在缺血后与之前相比。
高铁血红蛋白显著增加随着时间的推移,伊诺治疗组相比安慰剂治疗,因此,作为接触伊诺的标志(20.)(图4)。
4所示。讨论
在这项研究中我们没有发现任何支持的末梢循环内皮细胞激活以可溶性粘附分子或炎症反应水平衡量HMGB1缺血后2小时内接受膝盖手术的患者使用脊髓麻醉。观察小降低可溶性ICAM两三个学习小组。此外,没有迹象表明内皮细胞激活或增加数量的巨噬细胞归巢到肌肉缺血期后大腿肌肉。
令我们吃惊的是,没有迹象表明内皮细胞激活和炎症反应可能会观察到在等离子体和在人类肌肉活检的临床研究与再灌注后缺血事件。影响结果,既不被认为也可以预期,关于随机伊诺暴露的测量参数。
在最近的一项研究中伊诺已经证明提供的改善血液流动和半影神经元生存在中风或其他缺血性疾病(21]。
在目前的研究结果相比,Mathru等人发现,在麻醉病人进行膝盖手术,显著增加炎症(增强表达的可溶性P-selectin CD11b / CD18中性粒细胞,等离子体氢过氧化脂质水平,激活核因子-B,髓过氧化物酶活动肌肉活检以及共轭二烯烃含量);同时,伊诺显著减毒这种炎症反应15]。然而,也有一些差异Mathru等人的工作和目前的研究。首先,在本研究中患者脊髓麻醉在临床常规,和谐与Mathru等人曾与硫喷妥钠、异氟烷麻醉。我们研究的患者因此意识尽管他们适度镇静。麻醉方法的选择可能的重要性,因为不同的麻醉药物对炎症已报告有影响在不同的设置。例如,在一个绵羊的内毒素模型,异氟烷麻醉相比,意识导致显著受损肾功能结合增强中性粒细胞活性和积累在肾脏22]。有趣的是,在麻醉大鼠,异氟烷保护肝组织相比,戊巴比妥钠在I / R模型(23),而异氟烷不减弱肝脏损伤但氯胺酮在内毒素模型(24]。此外,麻醉药物异丙酚,在I / R设置,提出具有抗氧化功能,无论是在大鼠(25和人类的2,4,26,27]。然而,缺乏有利影响心肌I / R损伤(老鼠)也报告了使用异丙酚(28]。此外,接受冠状动脉搭桥手术的患者有远程缺血预处理,异丙酚麻醉,异氟烷相比,减少心肌损伤(29日]。同时,局部麻醉剂已被证明具有多形核白细胞抑制迁移等各种影响酶释放,和超氧化物阴离子生成。嗜中性粒细胞功能受损可能导致一个抗炎和免疫抑制作用30.]。使用硬膜外麻醉结合全身麻醉手术被建议作为一种安全可靠的方法在减少术后并发症率和心血管衰竭和主要感染并发症的发生率[31日]。公园等人最近发现,当比较全膝关节置换术患者的动脉乳酸水平有七氟醚或脊髓麻醉,七氟醚麻醉时更高的乳酸增加,因此建议降低缺血性代谢物的生产在脊髓麻醉组(32]。改善微循环器官炎症已经表示在一个实验中使用硬膜外麻醉大鼠模型(33]。积极影响组织灌注的轴索的块可调节炎症反应在缺血/再灌注。
因此,可能会有一些不一致的影响不同的麻醉方法在各种炎症的设置,因为我们使用异丙酚镇静除了脊髓麻醉可以推测,这种化合物可能有减毒缺血组织的炎症反应。其次,我们的病人几乎是两倍老病人相比Mathru等人研究[15]。在人类中,年龄和血浆浓度之间的正相关和可溶性ICAM VCAM已经观察到(34]。因此,它似乎是不可能的,更高的年龄在目前的研究可以解释在炎症反应的差异。已报告增加可溶性粘附分子在老化(老鼠);另外,当处理有限合伙人年老的动物显示出更明显的表达这些标记(35]。
总止血带时间在本研究60 - 140分钟是一致的大约两个小时Mathru et al。15]。
病人在当前的研究中都有相同类型的手术执行的一个外科医生:膝关节置换术。这个设计建立了以优化研究结果的信度和效度。
并不总是有增加粘附分子表达的I / R损伤。在主要的人类I / R设置,增加肝移植,没有这些参数被认为(19]。相反在其他物种,它已被证明是不同的。犬模型的肝脏I / R的表达ICAM, VCAM P-selectin, E-selectin增加热缺血60分钟后(36]。此外,肿瘤坏死因子- P-selectin合成增加刺激α或有限合伙人在小鼠在人类内皮细胞(但不是37]。HMGB-1末被认为是中介的脓毒症动物模型(38,39),与发生在败血症患者的结果(幸存者/ non-survivors) (38]。然而,在创伤患者峰值被认为早在医院导纳(2 - 6小时后40]。然而,它已经表明,HMGB-1是至关重要的在调节设置I / R损伤;例如,在小鼠肝脏中HMGB1蛋白表达是调节后一小时再灌注和30分钟后的心41,42]。分别与脑和心肌缺血,在病人的研究中,高浓度的HMGB1被认为在24小时内(43,44]。HMGB1的值在本研究预期的正常范围(45,46]。因此,物种差异、时间与I / R事件,病人疾病,心血管疾病的危险因素(47)可能会影响这些参数变量。
降低可溶性ICAM观察随时间在安慰剂组和组接收伊诺在手术,与早期的研究找到相应Huda et al .,在降低可溶性ICAM止血带后被病人接受膝盖手术。尤其是这被认为与增加ICAM mRNA在肌肉活检1]。在我们的研究中ICAM染色肌肉活检不可溶性ICAM下降证实了这一点。因此,我们并不认为这些微小的变化为临床相关。可溶性粘附分子的形式检测在生物体液和它们的浓度可能反映了增加表达在细胞层面上由于炎症反应(47,48]。然而,测量mRNA的质疑和证明与相应的蛋白质,而可怜的相关资料(49]。
在这项研究中最大剂量的伊诺是管理为了评估假设抗炎效果,在整个手术期或打破止血带时激活。这种设计是为了调查如果伊诺流通管理当时腿可以调节炎症反应,并且假定伊诺的政府可能会创建一个存储库没有的50,51]。本研究炎症的表达式是使用两种标准方法评估:ELISA和免疫组织化学技术。
虽然没有伊诺的有益影响政府在目前的研究中可以观察到,我们另一方面没有伤害无论是本地还是系统的痕迹。然而,这项研究没有设计关于伊诺安全声明。
5。结论
这个I / R设置在患者接受膝关节置换术止血带时间范围在脊髓麻醉60到140分钟,没有增加炎症反应可以观察到系统或局部肌肉组织。因此,没有公认的声明伊诺可能制定的影响。进一步研究可以解决不同的I / R模型的使用和其他类型的捐助者以及麻醉方法。
利益冲突
克拉斯·g·Frostell披露金融兴趣一氧化氮的临床使用。其余作者声明没有利益冲突有关的出版。
确认
作者非常感谢阿尔夫Sollevi杰出的学术支持和Gunilla赫尔曼的技术援助。一氧化氮(INOmax)和INOvent交付系统提供的精灵Sjoquist,伊卡里亚岛公司,汉普顿,新泽西,美国。ELISA试剂盒提供了CF研究&咨询AB。