文摘
谷胱甘肽S-transferase(销售税)从各种节肢动物可以引起过敏反应。在目前的研究中,每一个5,销售税,克隆从美国蟑螂(CR)和表达baculovirus-infected昆虫细胞(iPer 5)大肠杆菌表达式(bp 5)系统。二级结构预测的8.69%和45.93α螺旋β床单iPer 5和42.54和8.49%α螺旋和β分别表在英国石油公司(bp) 5。发现4的16(25%)从美国CR过敏患者血清对bp 9和iPer 9所评估ELISA和免疫印迹分析,确认每一个5不是美国的主要过敏原CR。感应调节CD63的表达和CCR3被动致敏人类嗜碱粒细胞(从美国CR过敏患者血清)约4.5——3.2倍表明iPer 5和bp 5功能活跃。重组/ 5 (rp 5)应该是一个有用的工具为研究和理解每一个5 CR过敏的作用。
1。介绍
CR过敏一直被认为是自1964年以来重要的ige I型超敏反应(1]。它与哮喘和公认的发展急诊室承认哮喘病人的危险因素,尤其是在内城的孩子生活在低收入房屋与蟑螂出没2]。在中国,完全25.7%的过敏患者皮肤针刺试验(SPT)积极向美国CR (Periplaneta美国,每一个德国CR()和18.7% SPT积极Blattella蠊,Bla g)3]。
美国CR、德国CR和烟雾缭绕的布朗CR (Periplaneta fuliginosa)是主要的室内CR物种造成过敏在全球人口(2]。22个免疫球蛋白E (IgE)绑定组件包括23的蛋白质,28岁,35岁,38岁,40岁,49岁,72年、78年和97年美国CR (kDa被确定为主要的过敏原4每1[],但只有5),每一个2 (6),每一个3 (7每4 (),8),每一个79每9],[10每10 [],11)为特征。例如,每一个1是一个isoallergen 5亚型报道到目前为止,也就是说,每一个1.0101每一个1.0105。每一个1是一个主要的美国CR过敏原,结合血清的IgE 90 - 100%的CR过敏科目(4]。每一个2是一个不活跃的天冬氨酸的消化道蛋白酶在美国发现CR和粪便5]。每一个5属于消费税,但消费税的变应原性同系物在美国CR尚未报道。自德国CR的销售税(Bla g 5)是一个主要的蟑螂过敏原,导致特定的IgE表达在30 - 71%的CR过敏(12- - - - - -14),我们预计,每5可能是美国CR和调查的主要过敏原的潜在过敏性本研究。
两个销售税同系物(每5)基因在基因库(加入:AY792949和AEV23867),它提供了生产重组的可能性/ 5 (rp 5)在大量研究它在过敏反应中的作用。很多(但不是所有的过敏原从cDNA表达显示相当大的IgE绑定反应似乎与自然同行。大多数这些重组过敏原产生大肠杆菌,但不幸的是,数量和/或反应有时是减少纯化过敏原时,受到免疫和生化检测15]。为了克服这些问题,真核表达系统,如酵母和杆状病毒在昆虫细胞已经被使用16]。本研究的目的是生成rp 5用真核(baculovirus-infected昆虫细胞)和原核(大肠杆菌)表达系统和描述它的生化和免疫学特性。
2。材料和方法
2.1。道德声明
研究伦理委员会批准的协议是南京医科大学第一附属医院。书面知情同意使用血液样本之前从所有参与者获得研究条目根据《赫尔辛基宣言》。
2.2。病人和样品
总共16个过敏性鼻炎患者积极SPT(过敏原被ALK-Abello供应公司、丹麦)和阳性血清IgE测试美国CR提取(通过使用Immuno-CAP测定(法玛西亚诊断AB,乌普萨拉,瑞典))和6健康对照组(HC)招募了研究中。血清(4毫升)从外周静脉血液收集每个病人和HC免疫印迹分析。
2.3。克隆的互补编码每5基因的全长
总RNA分离成年女性CR饲养我们研究所用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。总RNA量化通过测量吸光度比值在260/280 nm。互补脱氧核糖核酸是由逆转录使用商业RNA-PCR装备根据制造商的指令(豆类生物技术有限公司、大连、中国)。对于每一个反应,1μ克总RNA是相对地转录使用oligo-d (T)的互补编码每一个基于5被使用引物PCR扩增每5基因的核苷酸序列(AY792949 AEV23867;转发:5′-ATGACCATCGACTTCTACTA-3′;反向:5′-TCACTTCTTGGCGAGGTTAT-3′)。PCR条件是95°C / 5分钟(一个周期),95°C / 1分钟,52°C / 1分钟和72°C / 1分钟(30周期)和72°C / 5分钟(一个周期)。纯化PCR产品被克隆到apMD18-T向量(豆类生物技术有限公司、大连、中国)之前被转换成大肠杆菌应变DH5α。插入在ABIprism 377测序DNA测序仪(美国应用生物系统公司,福斯特,CA)。DNA序列数据被显示翻译工具翻译成氨基酸序列在软件包(短信http://www.bioinformatics.org/SMS/)。每5预测的糖基化图案使用NetNGlyc 1.0服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)。
2.4。表达和纯化Baculovirus-Infected昆虫细胞的每一个5
每5基因subcloned进pFastBac1向量(WI Novagen,麦迪逊,美国)使用EcoR我和萨尔,我网站,导致构造转换成大肠杆菌应变DH10Bac生成bacmid重组。选择积极的殖民地和PCR鉴定紧随其后。重组bacmid转染到Sf-9细胞是通过使用Cellfectin(美国卡尔斯巴德英杰公司公司)和孵化在sf - 900 ii液体介质(美国卡尔斯巴德英杰公司公司)5天27°C到细胞肿胀。将上层清液收集为P1病毒股票。P2放大后感染病毒。总共500毫升P2 Sf-9细胞被感染的病毒和收获72 h。细胞细胞溶解对50毫米和300毫米Tris-HCl甘油氯化钠和5%。上层清液加载在Ni-NTA列(Genscript,南京,中国),用包含50 mM Tris-HCl运行缓冲,300毫米氯化钠,和5%甘油(pH值8.0)和筛选了包含50 mM Tris-HCl洗脱缓冲,氯化钠300毫米,250毫米咪唑,5%甘油(pH值8.0)。筛选了分数了,确定为每5 (iPer 5)。净化iPer 5透析在carbonate-bicarbonate缓冲区(0.05米,pH值9.6)进行进一步的调查。iPer 5的浓度是由使用Coomassie +分析工具与BSA作为标准(美国热科学的皮尔斯,罗克福德,IL)。
2.5。每一个5的表达和纯化大肠杆菌
每5基因subcloned进pCold II向量(豆类生物技术有限公司、大连、中国)使用濒死经历我和Xba我网站和DNA测序验证了。的重组pCold II-Per 5质粒转化为大肠杆菌折纸宿主菌株。一群选择的转变大肠杆菌折纸在一夜LB-ampicillin琼脂板被接种到5毫升LB-ampicillin肉汤和孵化37°C过夜。IPTG优化,一夜之间文化的比例添加到新鲜磅媒体1:100。一旦细胞密度达到光学密度(OD600年),这些细胞被孵化,0.1,0.5,1毫米IPTG,分别在15°C过夜。分析了靶蛋白sds - page的表达式。扩大表达式,40毫升新鲜的文化被接种到2 L LB-ampicillin肉汤和孵化37°C到OD600年达到0.6。IPTG浓度添加到最终的0.5毫米和文化孕育了一夜。细菌细胞在4000×g离心收获而在4°C 20分钟,细胞溶解在一个由声波降解法裂解缓冲在20 kHz, 2分钟启动,3分钟pulse-off。细胞碎片在12000×g被离心20分钟的4°C。上层清液加载在镍列(Genscript、南京、中国)如上所述,筛选了分数获得和确定为每5使纯化的bp(英国石油(bp) 5)。5在carbonate-bicarbonate透析缓冲区(0.05米,pH值9.6)进行进一步的调查。bp 5的浓度是由使用Coomassie +分析工具与BSA作为标准。
2.6。CD分析rp 5中表达大肠杆菌和昆虫细胞
远紫外CD光谱bp 5和收集iPer 5 Jasco j - 810分光偏振计(日本东京日本光谱有限公司)使用1毫米路径长度石英试管在蛋白质浓度为0.1毫克/毫升。光谱测量从240年到190海里,0.5纳米分辨率的扫描速度50 nm /分钟,平均的三个扫描。所有测量都在10毫米Na2HPO4,pH值7.0。最后的光谱被减去相应的缓冲光谱基线校正。结果表示为椭圆率均值残渣在给定的波长。bp的二级结构含量5和iPer 5计算通过使用二级结构评估程序K2D2 [17]。
2.7。人类血清的免疫反应性与rp 5
一个96孔板涂有纯化bp 5和iPer 5 10μg / mL carbonate-bicarbonate缓冲区(0.05 M, pH值9.6)一夜之间在4°C, 100μL /。人类血清样本(1:20在PBS-Tween稀释2% BSA)被添加到板在室温下2小时。IgE绑定后,盘子被孵化与辣根peroxidase-labeled山羊反IgE(1: 2500稀释)(KPL, Inc .,医学博士,美国),和颜色开发tetramethylbenzidine过氧化物酶底物(美国热科学的皮尔斯,罗克福德,IL)。微型板块的板块是读读者在405 nm的吸光度。截止的ELISA计算的均值-控制+ 2 SDs。
竞争ELISA试验,96孔板涂上美国蟑螂提取(10μg / mL) carbonate-bicarbonate缓冲区(0.05 M, pH值9.6)一夜之间在4°C。1:20-diluted混合血清单独或preincubated与不同数量的粗提取液,iPer 5和英国石油(bp) 5 2 h添加到盘子。发展和颜色板前一节阅读过程是一样的。粗提物的蟑螂准备根据前面描述的方法(18与一些修改)。简单地说,30 g的蟑螂在液氮粉碎。200毫升的样本脱脂乙醚和乙酸乙酯(1:1,按体积)和提取与开销缓慢搅拌carbonate-bicarbonate缓冲区(0.05米,pH值9.6),包含6毫米2-mercaptoethanol变换和蛋白酶抑制剂的鸡尾酒(Shenggong、上海、中国)一夜之间在4°C。提取当时离心机在10000 g×30分钟在4°C,和上层清液过滤是0.22μm-pore-size过滤器在使用前(美国贝德福德微孔)。
2.8。免疫印迹分析IgE反应
免疫印迹检测血清进行了具体的IgE与英国石油(bp) 5和iPer 5如前所述19,20.]。英国石油(bp) 5和iPer 5 (5μg)被添加到一个sds - page(凝胶浓度为15%)在还原条件下,然后转移到硝化纤维膜。硝化纤维膜是孵化与美国CR过敏症患者的血清(1:5在PBS-Tween 1% BSA, 10%正常山羊血清)为90分钟。与PBS后清洗,膜与peroxidase-labeled反IgE单克隆抗体的孵化。积极的蛋白质乐队被孵化可视化tetramethylbenzidine过氧化物酶底物的膜。血清从2 nonatopic受试者作为消极的控制。
2.9。嗜碱细胞激活测试
CD63的表达和CCR3嗜碱细胞表面上被认为是嗜碱细胞激活的指标21,22]。短暂,外周血单核的细胞(PBMC)从20毫升血液捐献的4个健康志愿者隔开Ficoll-Paque密度梯度和处理10毫升LS(解决方案包含1.3氯化钠,氯化钾0.005米,和0.01乳酸,在pH值3.9)为2分钟8°C。三羟甲基氨基甲烷(pH值10.9)液中和后12%,特异性的IgE嗜碱粒细胞被剥去和细胞被动致敏血清的美国CR患者过敏或HC (1在10稀释2 h在37°C)如前所述23]。细胞被挑战和不同浓度的bp 5 iPer 5为15分钟37°C。一只山羊反IgE抗体(英国Kidlington Serotec)作为一个积极的控制。反CCR3-PE抗体(圣地亚哥eBioscience Inc .)、钙、美国)和反CD63-FITC抗体(英杰公司公司,打击士气、钙、美国)被添加到细胞为15分钟37°C在黑暗中。流式细胞仪分析表面标记进行在488 nm FACSAria流式细胞分析仪(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)和FACSDiva分析的软件。嗜碱粒细胞淋巴细胞地区封闭的SSC或FSC模式,和识别为单个的细胞染色积极CCR3-PE抗体。Upregulation CD63的表达是由增加荧光FL-1通道。收购后终止300年嗜碱细胞目标事件。反应量化CD63表达嗜碱粒细胞的百分比更高FL-1地区,已包含4%的嗜碱粒细胞调整。
2.10。统计数据
数据表示为均值±SEM表明数量的独立进行重复实验。统计学意义之间的手段分析了单向方差分析或学生的以及利用SPSS 13.0版本。作为具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。克隆的互补编码完整每5序列的长度
互补编码每5被使用引物PCR扩增基于每5基因的核苷酸序列。这是一个645个基点基因和编码215个氨基酸的蛋白质(图1)。每一个5的互补序列的身份存入基因库(加入。AY563004)在蛋白质水平为100% (215/215)。每5显示81、15和13%的序列相似性德国CR过敏原BGGSTD1 Der p 8, Bla g 5(图2)。一个主题(198 nhsg201)是预测每一个5的糖基化的主题。
3.2。每一个5的表达和纯化大肠杆菌
每5基因subcloned进pCold II向量转换为大肠杆菌折纸宿主菌株。最优诱导条件每0.5毫米IPTG(图53(一个)),选为最终浓度条件在整个研究。每一个5蛋白被镍柱纯化。超过6毫克bp 5是获得2 L细胞培养基。纯化的纯度每5被sds - page鉴定。它显示单一乐队的表观分子量25 kDa(图3 (b))。
(一)
(b)
3.3。表达和纯化Baculovirus-Infected昆虫细胞的每一个5
每一个5编码基因subcloned pFastBac1向量和转化大肠杆菌应变DH10Bac生成bacmid重组。当时重组bacmid转染到Sf-9细胞生成杆状病毒。每一个5 Sf-9细胞蛋白表达和纯化Ni列。约16毫克iPer 5得到的2 L细胞培养基。纯化的纯度每5由sds - page鉴定,显示主要乐队的表观分子量25 kDa(图4)。
3.4。CD分析rp 5在昆虫细胞中表达大肠杆菌
的远紫外CD光谱iPer 5和bp 5显示类似的曲线与两个最小值220和209.5 nm,最大在192海里,这表示与主要特点的蛋白质α螺旋结构(图5)。计算使用程序K2D2导致的二级结构预测的8.69%和45.93α螺旋和β床单iPer 5和42.54和8.49%α螺旋和β分别表在英国石油公司(bp) 5。
3.5。免疫反应性,IgE
为了确定每一个5的变应原性,我们检查了每一个5的绑定IgE直接在美国CR过敏的血清ELISA技术。病人血清包括患者5、9、10、14显示积极的IgE反应bp 5和iPer 5。结果表明,4个(25%)患者的血清对bp 5和iPer 5(图6(一))。bp的IgE反应5和iPer 5在每5阳性患者的血清增加了5.0和7.9倍,分别相比,HC的血清。此外,竞争ELISA表明bp 5和iPer 5抑制蟑螂提取的IgE反应约35.5%和25.4,分别为(图6 (b))。IgE绑定活动的每一个5代表组3例和两个HC评估免疫印迹,见图6 (c)。IgE绑定乐队出现清晰与bp iPer 5比5。iPer 5和bp 5没有对HC的血清反应。
(一)
(b)
(c)
3.6。嗜碱细胞活化诱导rpe 5
iPer 5和bp 5在1.0μg / mL诱导大约4.5——3.2倍CD63的表达和CCR3 CD63、CCR3双阳性细胞孵化时被动致敏嗜碱粒细胞(通过从美国CR过敏血清)。iPer 5和bp 5没有影响嗜碱粒细胞敏感的血清HC(图7)。
(一)
(b)
4所示。讨论
雾化蛋白质来源于唾液、排泄物、分泌物、皮肤,残骸和尸体蟑螂诱发ige过敏(24]。为了更好地理解每一个5介导CR过敏和承诺提高CR的诊断和治疗过敏,我们准备好的生物活性和高度纯美国每5 CR过敏原相对大量的研究。我们已经识别出每一个5小说美国CR过敏原,25%的受试者与美国公认的CR过敏。
从德国和美国CR过敏原几件物品已经被确认和他们的IgE大被描述。这些包括Bla g 1和每一个1(进食和消化);Bla g 2和每一个2(不活跃的天门冬氨酸蛋白酶);Bla 3 g和每一个3 (arylphorin-like存储蛋白质);Bla 4 g / 4(男性费洛蒙运输lipocalin);和Bla g每7(原肌球蛋白)[7和25]。在CR过敏原,3德国CR的消费税从男性成年人发现glutathione-agarose亲和色谱法包括一个n端氨基酸序列是相同的Bla g 5 (26]。两个IgE-reactive消费税从25 IgE-reactive斑点通过蛋白质组学分析,发现其中一个被发现Bla g 5 (27]。最近,三角洲类销售税(BgGSTD1), 15%氨基酸序列的身份Bla g 5,从德国CR(纯化28]。然而,过敏性和销售税的IgE大同系物在美国CR尚未报道。三角洲类的成员消费税,每5显示了81%的序列相似性BGGSTD1,但只有13%的相似性Bla g 5σ类销售税从德国CR。在目前的研究中,只有25%的IgE反应时观察rp 5 cockroach-sensitive患者血清与rp 5孵化,这表明每一个5不可能美国CR的主要过敏原。每5的IgE反应率低于Bla g 5 (30 - 71%)12- - - - - -14),但高于BGGSTD1 (17.9%) (28]。之前就有报道称,美国CR提取不能抑制IgE抗体绑定Bla g 5使用RIA测定,表明没有明显IgE消费税从这两个物种之间的大12]。然而,黄等人发现销售税(s)在美国CR(是)过敏,(是)pan-allergens CR和螨虫29日]。发现每一个5与特定的IgE的美国CR过敏反应在目前的研究表明,美国CR销售税是过敏。
我们准备好的rp 5通过使用两个不同的表达系统在目前的研究中,发现2 L大肠杆菌和Sf-9细胞培养基能够产生8和16毫克的高度纯rp 5,分别,这是足以让每一个5功能的研究。的大肠杆菌系统是一个完善的系统提供了许多优点:容易处理的细菌细胞和各种各样的向量的选择使用不同的启动子。缺点,过表达蛋白质错误折叠和可能需要化学重折叠过程获得的蛋白质在原生,充分活跃,生物形式。在目前的研究中,我们选择pCold II向量大肠杆菌折纸宿主菌株生产bp 5以可溶性形式没有任何调整的过程。真核杆状病毒表达系统的特点是一个广泛的转译后的数组处理,典型的高等真核细胞。重组蛋白的生产在这个系统提供的优势是分泌蛋白通常是糖化和disulphide-bonded正确导致生物活性构象。因为baculovirus-infected昆虫细胞表达系统的优势,我们使用它来表达iPer 5和设法获得相当数量的iPer 5本研究。许多昆虫过敏原如Api m 1 (30.],Api m 2 [31日从蜜蜂毒液,索尔我332从蚁毒液,痛单位m 5 (33从脸白的大黄蜂(Dolichovespula有污点的1)、Cul年代(34从北美蚊()库蠓属sonorensis),Der f 1 (35车辆从屋尘螨,t [1136从尘螨)(Blomia tropicalis2)、地蜡d [15从尘螨)(Lepidoglyphus析构函数),Aed 1和2 (Aed37从蚊子)(埃及伊蚊)已经成功地使用杆状病毒昆虫细胞表达系统中表达。据报道,他们拥有类似的结构和生物活性的自然形式(38]。
对于免疫反应性,rp 5中产生两个系统显示IgE-binding活动向美国CR过敏患者血清。iPer 5似乎已经绑定活动比bp 5,暗示,rp的IgE-binding活动5可能会联想到它的糖基化网站和三级构象。一个主题(198 nhsg201)是预测每一个5的糖基化的主题,但我们不确定的数量α姑娘们,因为大多数的除碳水化合物抗原表位是已知的导致假阳性反应α加[39]。的远紫外CD光谱重组iPer 5和bp 5显示类似的二级结构,主要包括α螺旋结构。但iPer 5似乎更多α螺旋结构比bp 5。IgE-binding抗原表位被IgE抗体是线性或分子的构象和位于表面的抗体(40]。构象表位由氨基酸中关闭空间折叠分子,尽管非连续的氨基酸序列。他们依赖于蛋白质的三维结构。球状吸入过敏原,构象表位在变应原性中发挥非常重要的作用[41,42]。因此,看起来额外构象IgE-binding抗原表位可能存在于iPer 5,由于更多α螺旋结构的分子结构。
嗜碱细胞激活测试此处我们采用更先进的技术,测定过敏性给定的化合物。我们确认,每一个5是一个活跃的过敏原的CR能够激活CR-sensitized嗜碱粒细胞。IgE-binding类似活动,iPer 5似乎更强有力的嗜碱粒细胞的活化与bp 5相比,表明rp的basophil-activating活动5可能会联想到其糖基化网站和三级构象。显然,进一步的工作是需要确认我们的预期。
重组过敏原的可用性增加了我们理解的ige过敏和承诺改善这些疾病的诊断和治疗(43]。在我们的例子中,rp 5应该是一个有用的工具功能和临床研究。这些观察结果也证实baculovirus-infected昆虫细胞表达系统是更适合更活跃的生产/ 5过敏原大肠杆菌表达系统。总之,我们克隆了,准备两个rp 5过敏原通过使用真核和原核表达系统。我们确认有销售税过敏原(每5)在美国CR,尽管它并不是一个主要的过敏原。rp 5应该是一个有用的工具为研究和理解每一个5 CR过敏的作用。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Ji-Fu魏和杨Haiwei导致本文同样作为第一作者。
确认
这个项目是由主要的赠款中国国家基础研究计划(973计划)(没有。2013 cb530501),中国国家自然科学基金(31340073,31340073,31340073,30972822,81001329,81030054),江苏省省级人才的关键项目(RC201170),优先级的学术程序开发江苏高等教育机构(PAPD),国家“十二五”科技支撑计划项目(2014 bai07b02),教育部创新团队项目的辽宁省(LT2013017),辽宁省高等教育攀登学者计划,中国(没有。LJ2013222),辽宁省转化医学研究中心过敏(没有。LK2013041)。