文摘
血管平滑肌细胞的增殖(VSMCs)引发的炎症刺激和氧化应激对动脉粥样化形成重要的贡献。饮用绿茶与心血管保护协会已经有据可查的流行病学观察,然而,底层的机制尚不清楚。本研究旨在阐明最活跃的影响绿茶儿茶素衍生物,(−)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG),在人类主动脉平滑肌细胞(HASMCs),特别关注的角色强大的抗炎和抗氧化亚铁血红素的酶oxygenase-1 (HO-1)。我们发现剂量和时间的EGCG预处理诱导HO-1 HASMCs蛋白质含量。EGCG抑制白介素- 1 (IL)全身HASMC扩散和氧化应激剂量依赖性的方式。HO-1诱导物的CoPPIX降低il - 1全身的细胞增殖,而HO-1酶抑制剂ZnPPIX显著逆转EGCG-caused增长抑制il - 1对待HASMCs。在分子水平上,EGCG治疗显著激活核转录因子erythroid-2-related因子(Nrf2)活动。这些结果表明,EGCG可能作为补充和替代医学在治疗这些疾病通过诱导HO-1表达式,随后减少VSMC增殖。
1。介绍
动脉粥样硬化,主要的病理条件大多数中风症状,已经基本的强烈关注,临床和流行病学研究。这些研究有直接影响atherothrombotic脑梗死的预防1- - - - - -3]。动脉粥样硬化一般是多因素的,通常依赖于氧化应激相关的风险因素如高胆固醇血症、糖尿病、吸烟、高血压和肥胖。动脉粥样硬化的并发症仍是工业化国家的发病率和死亡率的主要原因(4- - - - - -6]。
平滑肌细胞向内膜迁移,紧随其后的是他们的扩散,是动脉粥样硬化和再狭窄的中心主题。各种研究表明,这些事件之前,伴随着氧化应激和炎症7- - - - - -9]。interleukin-1细胞因子(il - 1β)家庭发挥关键作用,调节炎症反应和广泛研究,以确定il - 1执行β修改了炎症反应(10,11]。il - 1β引发大幅提高由血管平滑肌细胞炎症因子的表达(VSMCs),和这些因素促进白细胞招募并渗透到动脉壁和促进VSMC增殖12,13]。最近的研究表明增加il - 1的水平β在人类动脉粥样硬化病变(14]。
绿茶的消费吸引了注意力,因为它对健康有益。饮用绿茶与心血管保护协会一直在流行病学观察记录(15]。绿茶中的多酚儿茶素包括(−)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG)(图1),(−)-epicatechin-3-gallate(心电图),(−)儿茶素(EGC)和表儿茶素(EC)。这些酚类化合物似乎干扰分子过程的开始,发展,和动脉粥样硬化斑块破裂16]。EGCG是最丰富、最活跃的儿茶素导数据报道表现出抗炎和antiatherogenic属性相关实验研究其抗氧化活性(17]。
血红素oxygenase-1 (HO-1)是热休克蛋白家族的一员。它的表达式是由不同应力诱导刺激包括缺氧、重金属、紫外线辐射,活性氧(ROS) (18- - - - - -20.]。HO-1可以促进血红素与并发释放一氧化碳和胆红素铁。HO-1的生理功能包括抗氧化作用,抗炎,抗和antiapoptosis效果21]。最近的研究表明,植物的化学物质可以作为诱导物HO-1响应的蛋白质,它能够最大化的内在的抗氧化潜力的化合物(22]。
在这项研究中,我们分析了EGCG的力量作为诱导物HO-1表达在人类主动脉平滑肌细胞(HASMCs)和探索这是否有助于保护作用的多酚化合物对平滑肌细胞增殖和氧化应激。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
HASMCs(美国或级联生物制剂)种植和通道如前所述[23,24]。细胞在段落使用3 - 8。HASMC文化的纯度验证了用单克隆抗体免疫染色针对smooth-muscle-specificα-actin(研发系统、MN、美国)。与试剂之前治疗或刺激,细胞血清饥饿24 h。
2.2。免疫印迹分析
总细胞溶解产物准备在裂解缓冲(20 mM Tris-HCl, 150毫米氯化钠,EDTA 1毫米,1毫米EGTA,特里同1%,2.5毫米焦磷酸钠,甘油磷酸酯1毫米,1毫米Na3签证官4,1μg / mL亮抑酶肽,1毫米PMSF pH值7.5)。Bio-Rad蛋白质测定的蛋白质浓度测定试剂(美国CA Bio-Rad)和样本存储在−70°C (25]。
免疫印迹分析是用来确定HASMCs HO-1细胞水平的变化。蛋白质是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,然后用5%牛奶膜被封锁。探讨了PVDF膜的山羊anti-HO-1抗体(研发系统、MN、美国)1:1000,然后用辣根过氧化物酶孵化——(合)共轭二次抗体和蛋白与一种增强化学发光检测可视化工具包(美国新泽西州Amersham生物科学)。鼠标反β肌动蛋白(Labvision / NeoMarkers、钙、美国)抗体被用作加载控制。蛋白质表达水平将量化的光学密度,使用ImageQuant软件(26]。
2.3。BrdU合并分析细胞增殖
HASMCs被播种在96孔板1×10的密度4细胞/。细胞与不同浓度的EGCG孵化24小时,然后用50 ng / mL的il - 1刺激β8 h。DNA合成测量使用5-bromo-20-deoxyuridine (BrdU)细胞增殖工具包(Calbiochem,达姆施塔特,德国)。简单地说,与il - 1 4 h后孵化β,BrdU标记的解决方案(BrdU浓度:10μ米)添加到细胞和孵化为另一个4 h。去除培养基后,这些细胞被固定和核酸酶添加到部分消化细胞DNA。Anti-BrdU抗体然后添加之前添加鼠标IgG-peroxidase共轭。信号在黑暗中与tetramethylbenzidine开发解决方案。测量吸光度光谱光度测量的板读者使用了双波长450 nm / 595海里(27]。
2.4。流式细胞仪细胞周期分析
分析DNA含量和细胞通过有丝分裂周期的运动是由流式细胞术24小时后细胞的刺激。HASMCs收获和固定在70%乙醇;然后用冰冷的细胞被洗PBS和孵化与核糖核酸酶(σ,密苏里州,美国)和propidium碘(σ,密苏里州,美国)。细胞周期相分析是由使用FACScan流式细胞仪(美国新泽西州正欲),和细胞的百分比在细胞周期的不同阶段进行了分析使用ModFitLT软件(美国新泽西州BD) [28]。
2.5。检测活性氧的生产
EGCG在HASMCs ROS生产的影响是由荧光测定使用DCFH-DA作为调查。这种方法是基于H的氧化2O2的nonfluorescent DCFH-DA荧光2′,7′-dichlorofluorescin (DCF)。支流HASMCs (104细胞/)48-well板将用不同浓度的EGCG预处理。哈佛商学院的细胞被洗,然后包含10个哈佛商学院μM DCFH-DA添加,孵化持续了45分钟在37°C。相对荧光的荧光强度(单位)为485 nm使用荧光激发和530海里排放标(29日]。
2.6。测定谷胱甘肽(GSH)和硫代巴比土酸活性物质(TBARS)水平
细胞内谷胱甘肽水平测量使用比色测定(Bioxytech谷胱甘肽- 400;OxisResearch,波特兰,或)。与PBS,细胞被洗,偏磷酸(5%)被加入到细胞,然后刮掉。混合物在3000 g离心5分钟在4°C,和上层清液为400 nm和试剂的化学反应后R1 (4-chloro-1-methyl-7-trifluromethyl-quinolinium methylsulfate)和试剂R2(30%氢氧化钠)。一个已知浓度的谷胱甘肽被用来生成一个标准曲线(30.]。
脂质过氧化是量化通过测量TBARS分光光度测定(贝克曼库尔特,DU 640分光光度计,德国)根据一项研究。脂质过氧化物水平,表示为nanomoles的丙二醛(MDA)每毫克的蛋白质,从吸光度计算在532 nm使用tetraethoxypropane (TEP)作为外部标准(30.]。
2.7。核提取制备和电泳迁移率改变分析(EMSA)
核蛋白质提取物的准备(如前所述)(19]。总之,细胞被刮掉板在一个冰冷的消息灵通的缓冲区。离心后10分钟4°C 300克、缓冲0.1%以上的细胞随着特里同x - 100和离心机在12000 g 10分钟4°C。核丸resuspended在缓冲区(10毫米玫瑰,pH值7.9,1.5毫米MgCl2德勤0.42生理盐水1毫米,0.2毫米EDTA, 1.0毫米PMSF, 25%的甘油,0.5毫米PMSF 2μg / mL抑肽酶,2μg / mL抑肽素,和2μg / mL亮抑酶肽),在4°C孵化30分钟,离心机在15000 g 30分钟在4°C。
探针核因子E2-related因子2 (Nrf2)凝胶转变化验是一个合成双链寡核苷酸(5′aga TTT TGC TGA GTC ACC AGT CCC-3′)包含共识Nrf2结合位点具有抗氧化反应的元素(是)31日]。EMSA,双链DNA end-labeled dig-dUTP使用终端转移酶(罗氏公司、德国)。dna结合反应进行了5μ克核蛋白质和0.8 ng digoxin-labeled寡核苷酸在室温下15分钟。核extract-oligonucleotide混合物分离的DNA探针通过本地6%聚丙烯酰胺凝胶电泳在0.5×此种(Tris-Borate-EDTA缓冲区,pH值8.0)。的digoxin-labeled寡核苷酸与共轭anti-digoxin抗体检测碱性磷酸酶(32]。
2.8。统计分析
值将被表示为意味着±标准差(SD)。使用学生的统计评估了t以及或单向方差分析Dunnett紧随其后的测试。一个值< 0.05被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。EGCG在HASMCs HO-1表达增加
测试的影响EGCG在HASMCs HO-1表达式,EGCG(37.5, 12.5, 25日和50μ米)在培养基添加HASMCs 24 h,和免疫印迹进行HO-1蛋白表达。如图2(一个),EGCG剂量依赖性增加HO-1 HASMCs蛋白表达。此外,EGCG时间(6、12、18、24 h)在HASMCs HO-1蛋白表达增加。
(一)
(b)
3.2。抑制作用EGCG对HASMCs扩散和氧化应激诱导il - 1β
调查是否EGCG抑制HASMCs扩散引起的炎性细胞因子il - 1β,与il - 1 HASMCs细胞被孵化β(50 ng / mL)与EGCG (10 - 50μ米)24 h, BrdU合并分析。EGCG降低il - 1扩散有剂量依赖性的影响β对待HASMCs。意义被发现在30、40和50μM浓度(图3(一个))。
(一)
(b)
流仪结果被用来确定EGCG-induced细胞生长抑制被捕是由于在一个特定的细胞周期。如表所示1、流量仪HASMCs DNA含量的分析表明,EGCG治疗导致的百分比显著增加细胞G0/ G1阶段,大大降低了人口相对于il - 1β处理细胞。
直接评估EGCG对活性氧的影响生产,我们评估ROS水平il - 1β对待HASMCs。如图3 (b)、治疗与il - 1β(30分钟50 ng / mL)导致更高的荧光相比,控制细胞的增加。然而,与EGCG预处理HASMCs 30分钟(10 - 50μ米)存在剂量依赖的相关性和显著地抑制il - 1β全身的ROS生成。
此外,表2表明,EGCG治疗导致谷胱甘肽含量显著增加,明显降低TBARS内容相对于il - 1β处理细胞。
3.3。EGCG变弱il - 1β通过HO-1全身扩散
我们在il - 1化验HO-1表达的影响β全身的细胞增殖。如图4,我们发现HO-1诱导物CoPPIX降低il - 1β全身的细胞增殖,而HO-1酶抑制剂,ZnPPIX,显著逆转EGCG-caused增长抑制il - 1β对待HASMCs。
3.4。EGCG激活Nrf2 HASMCs
激活Nrf2 Nrf2积累增加的细胞核。有人建议的规定Nrf2 HO-1转录激活依赖于亚细胞分布而不是诱导的转录因子新创合成(31日,33]。因此,我们决定核激活Nrf2控制和EGCG-treated细胞。EMSA图如图所示5EGCG治疗显著激活Nrf2转录活动专门通过绑定在目标基因的启动子。
4所示。讨论
目前的研究表明,第一次,绿茶EGCG减毒il - 1β通过HO-1-related全身HASMCs扩散机制。EGCG治疗诱导细胞周期进展的被捕和ROS增加生产结果在VSMCs谷胱甘肽缺乏及脂质过氧化作用。我们的数据也表明,Nrf-2 HO-1表达介导的可能发挥关键作用的抗增殖作用EGCG VSMCs。
大脑动脉粥样硬化导致临床疾病通过腔的缩小(缺血性中风),心,和周边血管。氧化应激导致脑血管疾病的进展。它可以产生重要的进程导致脑动脉瘤形成包括直接内皮损伤以及平滑肌细胞表型转换增殖和炎性表型(34]。流行病学研究表明,经常食用绿茶与降低冠心病的风险(35,36]。在体外调查表明,绿茶多酚类化合物能抑制粥样硬化过程的几个关键事件,如增殖和迁移的VSMCs redox-sensitive机制。EGCG-mediated HO-1感应已被证明发生在内皮细胞(31日,37- - - - - -39),上皮细胞(40),神经元(41)、肾(42,43),和肺细胞(44- - - - - -46]。在目前的研究中,儿茶素的抗氧化特性的进一步报道来防止心血管疾病通过抑制炎症细胞因子诱导VSMC增殖通过HO-1归纳。因此,我们的研究结果阐明与炎症的关系,ROS,监管atheroprotective HO-1的基因,以及这些活动的规定通过EGCG可以导致血管疾病的预防。
动脉粥样化形成期间,慢性炎症和氧化应激在VSMC激活起到至关重要的作用。消除氧化应激,内源性抗氧化酶包括诱发HO-1感应。的有利影响HO-1 upregulation已报告在一系列的动物模型(47]。感应HO-1感应是由各种机制,包括封锁免疫反应和增加产量的碳氧化物(48]。HO-1保护VSMCs免受氧化损伤和VSMC增殖(49,50]。在目前的研究中,EGCG的剂量和时间诱导HO-1 HASMCs表达式。与我们的结果一致,EGCG也增加HO-1表达式和显示抗炎能力在不同的细胞,如内皮细胞(31日,37,39)和单核细胞的细胞(51]。这些发现表明,EGCG HO-1等的强烈诱导物诱导可能独立于各种细胞类型。
细胞周期是一个主要的收敛点VSMC增殖。这个过程是由多个细胞周期蛋白(蛋白激酶和监管控制52]。蛋白激酶的负调控因子和细胞周期蛋白,因此逮捕了在G细胞周期0/ G1阶段(48]。在目前的研究中,EGCG抑制DNA合成,并逮捕了在G细胞周期0/ G1阶段。因此,蛋白质含量的蛋白质激酶的负调控因子,它需要进一步调查。然而,基于这些发现,它是合理的推测,EGCG对VSMC增殖的抑制效应介导的诱导细胞周期阻滞。
氧化应激是指prooxidants压倒抗氧化能力的不平衡的氧化还原状态,从而导致增加活性氧的生产。ROS都牵连到几乎每一个阶段的动脉粥样硬化的发病机制7,8,53]。ROS,特别是超氧化物阴离子和过氧化氢,在心血管细胞是重要的信号分子。ROS参与增长,细胞凋亡,VSMCs和迁移;这些事件在血管疾病中扮演着重要角色,这表明活性氧的来源和他们修改的信号通路可能是重要的治疗目标(54]。众多研究表明,活性氧的影响细胞在血管重建过程将在几个细胞内的信号级联。ROS强有力地激活增殖蛋白激酶在细胞生长和分化成员重要,促炎基因的诱导表达,扮演一个角色在与高血压相关的血管炎症和动脉粥样硬化(54]。目前的研究提供了直接的证据,EGCG可以维持细胞内抗氧化剂的浓度在生物系统中找到。EGCG含量维持谷胱甘肽在炎症cytokine-stressed HASMCs导致TBARS下降。
信号转导网络的进步表明redox-sensitive转录因子的电池,这样Nrf2,上游激酶发挥重要的监管作用HO-1基因诱导(55]。的转录因子Nrf2中扮演着重要的角色在第二阶段解毒和抗氧化酶的表达和其他压力诱导基因的激活。这些基因可能扮演着至关重要的角色在细胞功能障碍的预防自由基的生产(56]。在目前的研究中,Nrf2被发现明显诱导EGCG HASMCs暴露。Nrf2进入细胞核的易位治疗EGCG还发现与增加其转录活动。我们的数据表明,EGCG可能诱发许多有关Nrf2基因通过其强大的感应。
5。结论
总之,我们的研究结果表明,(1)EGCG的剂量和时间诱发HO-1 HASMCs表达式;(2)EGCG剂量依赖性抑制il - 1β全身HASMC增殖和细胞周期阻滞;(3)EGCG剂量依赖性降低il - 1β在HASMC全身的氧化应激;和(4)Nrf-2介导HO-1表达可能发挥关键作用的抗增殖作用EGCG VSMCs。因此,EGCG可能可能实现的定义药理预处理剂对预防脑血管和心血管疾病。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这部分工作是支持高雄医科大学(KMUH102-2M18)和科技部,台湾(大多数103 - 2314 - b - 037 - 051和102 NSC - 2314 - b - 037 - 067)。