文摘

心肌炎是一种炎症性疾病由病毒感染引起的。不同的亚种的白细胞进入心脏组织,导致严重的心脏炎症与肌细胞损失和重建。在这里,我们研究可能的病毒复制的细胞来源使用的三个隔间的心:成纤维细胞,心肌细胞和巨噬细胞。我们C57BL / 6 j小鼠感染柯萨奇病毒B3 (CVB3)和检测到的基因表达增加消炎和抗病毒细胞因子在心脏。随后,我们被感染的心脏成纤维细胞、心肌细胞和巨噬细胞CVB3。由于病毒感染,TNF-α的表达,il - 6, MCP-1,干扰素β在心脏成纤维细胞相比显著增加心肌细胞或巨噬细胞。我们发现除了心肌细胞心脏成纤维细胞被CVB3并显示更高的感染病毒的复制(增加132倍)相比,心肌细胞(14)增加6 - 24小时后感染。在更高的病毒浓度,巨噬细胞能够减少病毒拷贝数。在低病毒浓度持久性病毒感染的决心。因此,我们建议心脏成纤维细胞中扮演重要角色的病理CVB3-induced心肌炎,病毒复制的另一个重要贡献者加重心肌炎。

1。介绍

心肌炎是一种炎症性疾病的心脏肌肉往往导致心脏功能障碍和死亡,特别是年轻患者(1,2]。诊断心肌炎的黄金标准是基于从endomyocardial活检组织病理学中存在明显的炎性细胞浸润(1,3- - - - - -5]。

急性心肌炎的最常见原因之一是一个心脏感染病毒、柯萨奇病毒B家族的尤其是肠道病毒(1,6,7]。这仍然心肌炎仍然占据扩张型心肌病的一个主要原因。Virus-mediated细胞溶菌作用导致心肌细胞的破坏,尤其是心肌细胞。然后摧毁了心肌细胞纤维化所取代,最终可能导致扩张性心肌病。

CVB3-induced病毒性心肌炎是一种行之有效的模型来阐明病毒性心肌炎小鼠(8- - - - - -14]。在这个模型中,与CVB3小鼠腹腔内感染,几天内可以观察到严重的炎症和病毒复制的心脏组织。一般来说,先天免疫系统的细胞识别和吞噬病原体,它们proteolytically加工,然后作为多肽作为抗原的适应性免疫系统的细胞(15,16]。但众所周知,这些细胞也可以感染病毒表明他们可能运输病毒颗粒的器官和感染居民细胞(17]。基因表达的增加,以及抗炎抗病毒细胞因子可以观察到感染心脏组织(11- - - - - -13,18,19]。但是这些细胞因子可以表达由于炎性细胞的浸润或由于激活居民心肌细胞由病毒感染引起的18- - - - - -20.]。

心肌细胞是有据可查的感染在许多出版物10,13,21,22]。在这里,我们比较CVB3感染其他心脏细胞类型的能力除了心肌细胞,我们调查这些细胞的病毒复制。

在这项研究中,我们调查相结合的实验诱导病毒性心肌炎小鼠心肌细胞的细胞培养实验感染CVB3。因此,我们使用从CVB3-infected老鼠心脏组织评价炎症免疫反应和比较这些结果与炎症免疫反应的细胞培养系统。大多数研究集中在病毒复制心肌细胞,不考虑病毒复制的心脏成纤维细胞(10,21]。我们的研究表明,心脏成纤维细胞启动心脏炎症增加促炎细胞因子的表达和进一步加剧病毒性心肌炎心肌细胞相比更高的病毒复制。有趣的是,巨噬细胞的先天免疫系统不显示感染效率高,没有观察到完整的病毒清除。

2。材料和方法

2.1。研究设计

雄性C57BL / 6 j小鼠(B6)被使用在一个6到8周的时代。动物腹腔内感染5×10⁵空斑形成单位(pfu)柯萨奇病毒B3 (CVB3) (Nancy应变)在PBS稀释。作为对照组,虚假与PBS进行感染。五个动物是虚假的对待PBS,而九动物被感染CVB3。七天后CVB3-infected B6小鼠血液流动特征和未感染健康相比,控制老鼠(PBS)治疗。这次调查符合指南发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生研究院(NIH出版物编号为85 - 23,1996年修订)。

2.2。血流动力学测量

对于血流动力学测量microconductance打开胸腔导管(1.2 f)系统使用动物如前所述[23]。动物麻醉(0.8 - -1.2克/千克聚氨酯和0.05毫克/公斤丁丙诺啡i.p)插管和人工通风。1.2 f-microconductance压力导管(加拿大安大略省SciSense)放置在左心室通过右颈动脉连续登记的压力-容积循环。全局函数量化了心率(bpm)、心输出量(μL / min),中风卷(μL)、中风工作(μL×毫米汞柱)、射血分数(%)。收缩功能评估的最大压力(毫米汞柱),左心室收缩性(毫米汞柱/ s)、收缩末期容积(在μL),舒张功能是通过测量舒张末期压力(毫米汞柱),左心室松弛(毫米汞柱/ s),左心室弛豫时间(τ)女士,压力停止时间(PHT)女士,和舒张末期容积(在μL)。

牺牲动物的心被移除,并立即在液态氮冷冻和储存在−80°C为以后生物分子分析。验证的炎症的心被嵌入在Tissue-Tek,切片,苏木精和伊红染色。

2.3。RNA隔绝组织部分

冷冻组织切片切碎的试剂盒,进一步破坏在10分钟的剧烈震动。提取RNA,氯仿是补充说,混合和离心机。包含RNA的水相收集和异丙醇是补充道。降水,RNA的解决方案是离心机高速15分钟在4°C。RNA小球然后进一步纯化使用RNeasy迷你包(试剂盒)根据制造商的协议。RNA浓度决定通过测量吸光度在260 nm使用Nanodrop和储存在−80°C进行进一步的实验。

2.4。细胞培养

鼠心脏成纤维细胞的产物得到心脏的左心室组织12个月大的雄性C57BL / 6 j小鼠。因此,心房和右心室被使用一个好的手术剪刀购买好的科学工具(置)。然后,左心室是切成小块,它被用于心脏成纤维细胞的产物。杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM)含20%胎牛血清,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素(PAA)。亚文化是准备使用胰蛋白酶/ EDTA为3分钟37°C。成纤维细胞的细胞具有积极的免疫荧光染色法对胶原蛋白我和负染法肌细胞标记肌间线蛋白和血管内皮标记CD31如前所述[24]。

HL-1心肌细胞系,建立从一个1鼠标心房心肌细胞肿瘤血统(w . c . Claycomb博士提供的请路易斯安那州立大学医学中心,什里夫波特,路易斯安那州),培养在明胶/纤连蛋白预镀烧瓶与Claycomb介质(σ)含10%胎牛血清(PAA), 100年μ去甲肾上腺素(σ),0.3毫米抗坏血酸(σ),2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素(PAA) (25]。亚文化是如上所述。

RAW264.7细胞(RAW-cells)保持在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)含10%胎牛血清,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素(PAA)。亚文化群是由刮。

所有细胞培养实验进行了37°C在湿润的气氛中有5%的公司₂和95%的空气。

2.5。病毒感染的小鼠细胞

细胞被播种在24-well盘子和成长为融合。饥饿,细胞被洗一次,在含0.5%胎牛血清的DMEM培养,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素(PAA)一夜之间。然后,一个被用来计数细胞数量计算感染复数(MOI)。随后,饥饿中完全删除和0.5莫伊的柯萨奇病毒B3 (CVB3) (Nancy应变)稀释在DMEM没有任何补充剂被添加到感染细胞。60分钟后,病毒被删除,与PBS细胞被洗两次。之后,细胞被孵化在饥饿中额外的5 - 23小时。控制细胞治疗同样没有病毒的。细胞被细胞溶解在RLT缓冲区(RNeasy工具包,试剂盒)包含β巯基乙醇制造商推荐的协议。总RNA分离使用RNeasy迷你包(试剂盒)根据制造商的协议。

2.6。逆转录和相对基因表达分析

一个μ克总RNA从心脏组织分离或250 ng总RNA分离小鼠细胞反向转录使用高容量设备(技术)。反转录,样本孵化2小时37°C后跟一个钝化步骤5分钟在85°C。最后,cDNA稀释在水的最终浓度10 ng /μ为组织样本和1.25 ng / LμL细胞培养标本。

进行相对量化的mRNA水平7900 TaqMan系统(应用生物系统公司)。评估目标基因的mRNA表达、实时PCR进行使用5μL混合基因表达主人的(技术)和0.5μ基因表达分析的L TNF-α(Mm00443258_m1)、il - 6 (Mm00446190_m1) MCP-1 (Mm99999056_m1)、干扰素-γ(Mm00801778_m1)、干扰素-β1 (Mm00439546_s1)、汽车(Mm00438361_m1)、TGF -β(Mm00441724_m1)或il - 10 (Mm00439616_m1)购买的从生活的技术。每个基因表达分析包括正向和反向引物以及FAM-labeled调查。模板1μL (cDNA用于最后的10μL检测mRNA表达每个在重复执行。此外,基因表达的CDKN1b (Mm00438167_g1)决心和数据标准化CDKN1b作为内生控制使用公式。CDKN1b的表达不受病毒感染的影响。

CVB3 RNA检测使用了底漆CVB3_sense (5′-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3′),反向引物CVB3_antisense (5′- ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3′)在最后15 ng /的浓度μL, FAM-labeled CVB3-MGB-probe (5′-TGCAGCGGAACCG-3′)的最终浓度0.25 pmol /μl .确定CVB3复制数字系列稀释的质粒,包含放大CVB3序列,用于标准曲线进行绝对的基因表达分析。

2.7。定量rt - pcr病毒复制

确定复制(+)或(−)RNA链CVB3我们使用CVB3_antisense或CVB3_sense逆转录引物,分别。因此,高容量工具包(技术)被用来抄写125 ng从感染的细胞总RNA。而不是随机引物我们使用30 ng /μL的CVB3 strand-specific底漆在最后一卷10μl .逆转录后37°C 2小时,紧随其后的是一个失活的步骤在85°C 5分钟,CVB3-specific cDNA进一步稀释1.25 ng /最终浓度μl .如上所述,1μL的互补dna被用来确定strand-specific CVB3的拷贝数。为了避免假阳性结果由于逆转录在基因表达分析RT酶的失活是证明。因此,总RNA与RT孵化酶没有任何底漆在RT反应钝化步骤在85°C。这种控制被用于基因表达分析CVB3描述可以确定,没有放大的样本。

2.8。免疫印迹分析

细胞裂解缓冲(细胞信号)的细胞溶解含1%蛋白酶和磷酸酶抑制剂(σ)。细胞匀浆混合样品缓冲和分离12%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide电泳凝胶和转移到一个硝基印迹膜(BioRad实验室)。使用特定的抗体进行免疫印迹汽车(sc - 15405,圣克鲁斯)和alpha-actinin(3134年,细胞信号)。二次抗体山羊anti-rabbit免疫球蛋白(向量labartories)和免疫反应性的乐队使用可视化由于共轭合使用超级信号衬底(热费希尔科学)化学发光成像系统(融合、Peqlab)。

2.9。统计分析

连续变量为正态分布使用Kolmogorov-Smirnov测试进行测试。因为不是所有的数据正态分布可以被证明是我们使用Mann-Whitney测试比较两组。

多个组的比较采用方差分析之后,图基的期末测验。由于所有数据都非正态的分布,数据查对数正态分布数据方差分析之前应用。差异被认为是显著的价值。所有计算都是使用图表执行垫棱镜5。

3所示。结果

3.1。LV功能下降后CVB3感染

老鼠(B6)腹腔内感染5×10⁵pfu CVB3和血液流动在感染后7天。如表所示1显著降低LV函数确定病毒感染小鼠作为心肌炎的证据,尽管保留EF。

全球CVB3的心脏功能降低受感染动物与健康对照组相比。血流动力学特征揭示了体积明显降低心率和中风导致受损的心输出量。此外,受感染动物的收缩和舒张功能降低未感染控制老鼠相比,表明心肌细胞可能被CVB3的负面影响。

3.2。在心脏组织细胞因子表达CVB3感染

在心脏组织中细胞因子的基因表达进行了分析腹腔内CVB3感染后7天。因此,总RNA是孤立的,反向转录,用于基因表达分析。

此外,大约500 000拷贝数的CVB3发现每10 ng反向转录总RNA分离出感染了B6小鼠的心脏组织(图1 (b))。

我们进一步分析了细胞因子的基因表达TNF-α,il - 6, MCP-1,干扰素γ干扰素-β,il - 10在心脏组织。如数据所示1 (c)- - - - - -1 (e)促炎细胞因子的表达,TNF-α(7倍),il - 6(9倍)和MCP-1(15倍)感染小鼠健康对照组相比显著增加。作为建议,7天后CVB3感染抗病毒细胞因子干扰素-β和干扰素-γ在心脏组织中表达,但没有发现在健康对照组(数据吗1 (f)和1 (g))。此外,抗炎细胞因子il - 10基因表达也显著增加(12)在受感染小鼠的组织(图1 (h))。

3.3。CVB3导致严重的细胞渗透到心脏组织

Cryosections心脏组织的检查评估炎症细胞的侵入心脏组织用苏木精和eosin-staining受感染的老鼠。如图1(一),心脏组织受感染的老鼠表现出大量的入侵炎症细胞在感染后7天。不同的细胞除了居民心肌细胞如成纤维细胞和心肌细胞存在于心脏组织。促炎的检测基因表达增加,抗病毒,抗炎细胞因子在炎症心脏组织,如图1可以从居民来源于进入炎症或心脏细胞。

3.4。细胞因子表达在不同的小鼠CVB3感染后细胞类型

检查病毒感染细胞特定的反应,我们被感染的小鼠心脏成纤维细胞,小鼠心肌细胞(HL-1细胞),小鼠巨噬细胞(原始细胞)与0.5 CVB3的莫伊。感染后1小时,细胞被清洗和孵化为进一步5或23小时关于实验设计和时间。

在图2基因表达是绘制x-fold房子保持基因CDKN1b比较绝对的mRNA表达不同小鼠细胞之间的细胞因子分析。的促炎细胞因子TNF-α、il - 6和MCP-1心脏成纤维细胞表达的。CVB3感染引起的基因表达增加(TNF-α三倍,三倍,il - 6和MCP-1 5倍),因为它已经检测到病毒感染心脏组织。这三个促炎细胞因子的基因表达在心肌细胞很难检测到。只有软弱的il - 6基因表达测定。此外,在巨噬细胞只有TNF-α高度表示心脏成纤维细胞相比,但基因表达是不改变CVB3感染。然而,心脏组织的存在和积累巨噬细胞在炎症导致TNF-α基因表达在早些时候组织样本如图所示图1。

此外,干扰素抗病毒细胞因子-γ无法检测到的细胞类型的调查。因此,这里没有一个负责调查细胞病毒诱导干扰素-γ在心脏组织中表达。相比之下,干扰素抗病毒细胞因子-β只有在心脏成纤维细胞检测,显著增加CVB3感染后24小时(5倍)已经受感染小鼠的心脏组织中所示。抗炎细胞因子的基因表达il - 10在这些小鼠细胞类型检查。有趣的是,在这里没有检测到表达研究细胞。

3.5。病毒在不同负载和病毒复制小鼠细胞类型

确定细胞感染的病毒负荷0.5莫伊CVB3,总RNA反向转录使用随机引物和复制数据使用TaqMan分析评估。如图3(一个)小鼠心脏成纤维细胞显示30多000 CVB3副本每1.25 ng转录RNA在感染后6小时。显著降低病毒负荷大约10 000 CVB3副本以小鼠心肌细胞。因此,确定明确的感染。相反,在小鼠巨噬细胞检测到病毒负荷低于100 CVB3副本6小时后感染。这个结果导致心脏成纤维细胞的建议是更有效地比心肌细胞的感染。

此外,我们确定的基因表达的细胞受体CVB3, Coxsackievirus-adenovirus受体(汽车)。如图3 (c)心脏成纤维细胞显示,类似汽车确定心肌细胞的表达。这个基因表达增加近2倍在心脏成纤维细胞,但不改变心肌细胞24小时后感染。相比之下,没有汽车基因表达检测小鼠巨噬细胞,经免疫印迹分析(图3 (d))。

探讨在不同的小鼠细胞类型病毒复制,CVB3拷贝数在感染后24小时被发现拷贝数归一化感染后6小时。我们策划CVB3的比例复制数字24小时/ 6小时。这样做是为了减少可能的影响因不同的病毒感染效率如图3(一个)。这一比率显示了病毒复制量6 - 24小时。如图3 (b)在心脏成纤维细胞CVB3拷贝数增加了近200倍相比,24小时后确定拷贝数6小时后感染。24小时后心肌细胞CVB3副本数量相比65倍增加CVB3复制号码后6小时。

在巨噬细胞几乎相同数量的CVB3副本24后6小时后确定。因此,心脏成纤维细胞以及心肌细胞复制CVB3与巨噬细胞相比,没有变化可以观察到。根据这个结果,病毒复制和病毒清除决心在巨噬细胞。

此外,孤立的从巨噬细胞总RNA的量不不同样品之间有或没有病毒,这表明没有细胞溶菌作用由于病毒的细胞溶解的周期发生在感染后在24小时内(图5 (d))。因此,它可以表明巨噬细胞不被CVB3在24小时内。有趣的是,数量减少的孤立的总RNA检测随着莫伊CVB3的心脏成纤维细胞后24小时。此外,减少大量的总RNA中也检测到HL-1感染细胞。这些结果表明,在文化的心脏成纤维细胞以及心肌细胞发生细胞溶菌作用由于溶细胞的病毒感染后24小时内的循环。

3.6。复制的病毒基因组和中间链病毒复制

因为目前还不清楚如果真的被CVB3感染巨噬细胞,额外的实验研究。发现CVB3副本也可以对应于不完全删除病毒粒子,而不是病毒RNA在细胞由于可靠的病毒感染。中间链,这是必要的对于病毒复制,只能检测到感染细胞,不能对应残留病毒颗粒。

因此,从感染的细胞总RNA分离是用于识别的拷贝数(+)链代表CVB3 RNA病毒基因组的数量和(−)链在感染细胞作为模板合成生产(+)为新的病毒粒子链。因此,(−)链是病毒复制的中间。早些时候在图所示3,巨噬细胞几乎没有感染CVB3的进一步加强,没有汽车的基因表达,称为CVB3受体,决心在巨噬细胞。

因此,CVB3_antisense底漆被用作CVB3 (+) strand-specific底漆抄写这个特定的RNA链互补脱氧核糖核酸(+)。因此,CVB3_sense底漆被用作特定引物抄写CVB3(−)链cDNA (−)。为了避免假阳性结果前必须灭活酶逆转录酶基因表达分析(26]。失活后两种类型的cDNA用于TaqMan分析来评估特定的副本数量分别为每一个链。如数据所示4(一)和4 (b)在心脏成纤维细胞(黑条)以及心肌细胞(红酒吧)两股的拷贝数显著增加感染后24小时相比,复制数字6小时后感染。相反,在巨噬细胞复制数字不显著不同感染后6小时至24小时。

自巨噬细胞显示少于100册,目前还不清楚如果这些发现CVB3对应副本,而不完全删除病毒颗粒比那些已经被感染的巨噬细胞的病毒颗粒。感染的证据将是一个检测到的表达CVB3的中间(−)链。如图4 (b)CVB3的复制被检测的证明(−)链CVB3的三种细胞类型。因此,巨噬细胞被感染CVB3即使没有车可检测的基因表达。

比较每个CVB3的复制RNA链在不同的细胞类型,在数字4 (c)和4 (d)我们策划CVB3的比例复制数字24小时/ 6小时。这样做是为了减少可能的影响因不同的病毒感染效率如图4(一)。然后,病毒复制6 - 24小时可以明确识别。在心脏成纤维细胞(+)和(−)股CVB3大幅度增加6 - 24小时((+)链> 100倍,(−)链> 300倍)。这是明显不同于心肌细胞和巨噬细胞的检测比例。在心肌细胞的复制中间CVB3(−)链仅略有增加(4倍),但足以清楚地复制CVB3(+)链(14)6 - 24小时。在巨噬细胞,只有一个非常弱的复制检测(+)链(1.7倍)和(−)链(1.8倍)。

3.7。巨噬细胞不能完全清除病毒

因为巨噬细胞属于先天免疫系统病毒消除预计。所有先前的实验进行了0.5 CVB3的莫伊。在图5,巨噬细胞也感染5莫伊CVB3再一次孤立的总RNA与CVB3反向转录(+)和(−)链特定的引物。这些结果的互补进一步用于TaqMan分析确定链具体的数字拷贝。

感染后5莫伊CVB3,巨噬细胞表现出更高的副本数量在感染后6小时(+)和(−)链相比,巨噬细胞感染0.5莫伊CVB3如图5(一个)。CVB3感染后24小时5莫伊副本编号为(+)和(−)链明显下降((+)链−3.6倍,(−)链−4.5倍)近CVB3的拷贝数检测24小时后感染0.5莫伊,而无显著变化测定巨噬细胞感染0.5莫伊CVB3 6小时至24小时后感染。

以确定病毒复制在巨噬细胞或病毒间隙发生CVB3感染,CVB3拷贝数的比例绘制在图24小时/ 6小时5 (b)。显然显示(+)和(−)股巨噬细胞能够消除CVB3莫伊5点,但没有明确的病毒复制或消除是0.5莫伊CVB3的记录。

此外,促炎细胞因子的基因表达TNF-α增加巨噬细胞感染5(3)莫伊CVB3 6小时后感染,与巨噬细胞感染0.5莫伊,没有变更测量。趋化因子MCP-1也发现类似的结果。感染后的基因表达不变0.5莫伊CVB3但增加感染5莫伊(28-fold)。然而,TGF - profibrotic和抗炎细胞因子的表达β增加了5莫伊CVB3(4.7倍),但CVB3感染0.5莫伊后保持不变。

4所示。讨论

在这项研究中,我们阐明细胞类型特异性免疫反应CVB3使用小鼠心脏成纤维细胞、心肌细胞和巨噬细胞。此外,我们文档不同的病毒感染,病毒复制,或者消除这些细胞类型之间。心脏成纤维细胞由CVB3感染效率高,导致心肌细胞相比更高的病毒复制。有趣的是,巨噬细胞被感染通过CVB3效率很低但显示病毒降解只有当感染病毒浓度很高。但是,没有完整的病毒通过观察巨噬细胞间隙。

4.1。炎症在病毒性心肌炎

首先,我们分析了从B6小鼠心脏组织,腹膜感染CVB3,或控制动物,PBS治疗。感染后7天,从受感染动物心脏组织清楚地暴露了炎性细胞浸润,这符合心肌炎的一般定义1,3,6]。此外,受感染动物的心脏组织显然展品CVB3的拷贝数。

病毒性心肌炎可分为3个阶段。第一个急性期是当确定易受病毒感染,病毒诱导细胞毒性的直接后果没有炎症细胞可以看到第一个在感染后3天内(3,18]。亚急性阶段,下一阶段是由活跃复制的病毒发生在心肌(学报》第4 - 14天)和浸润细胞的第一波(18]。最后,在慢性阶段病毒性心肌炎病毒复制停止,但病毒基因组存在心肌。此外,重塑发生心肌损伤后由于病毒感染和炎症在阶段1和2 (3,18]。CVB3感染我们的数据,7天后,与病毒性心肌炎的亚急性阶段相一致。

炎症细胞已经渗透到心脏组织和各种细胞因子,包括促炎细胞因子和抗病毒、表达。在这项研究中,我们显示增加促炎细胞因子的表达水平(TNF-α、il - 6和MCP-1)以及抗病毒细胞因子(IFN -β和干扰素-γ)和抗炎细胞因子(il - 10)由于病毒性心肌炎的心脏组织。这些细胞因子调节发挥重要作用增加炎症由于病毒感染。在转基因小鼠overexpressing il - 6在心脏组织,协会与高架基底炎症了27]。有趣的是,抗炎治疗与可溶性肿瘤坏死因子受体或中和抗体对趋化因子可以降低心脏炎症和防止心脏损伤实验模型(11,28)而不是随机临床试验(29日]。另一方面,使用干扰素抗病毒治疗β或IFN-α改善患者的心脏功能持续性病毒感染(30.,31日)这是符合发现干扰素-β中和抗体病毒复制增加心肌细胞(10]。

促炎或抗病毒细胞因子存在的心脏组织,目前尚不清楚细胞类型主要是负责一个特定的细胞因子海拔。在这里,我们被感染的三个不同的细胞在体外0.5莫伊CVB3和分析特定的细胞因子表达的细胞类型。因此,我们使用小鼠原发性心脏成纤维细胞,小鼠心肌细胞细胞系HL-1,小鼠巨噬细胞细胞系生。成纤维细胞被发现在整个心脏心肌细胞周围组织,他们心中最大量的细胞类型。巨噬细胞构成先天免疫系统的重要组成部分。因此,他们在前线防御真菌、细菌和病毒(15]。有趣的是,巨噬细胞存在于健康的心脏组织,尽管他们不是频繁的心肌细胞和成纤维细胞。但在疾病数量增加(16]。

促炎细胞因子的表达(TNF-α、il - 6和MCP-1)增加心脏成纤维细胞由于CVB3感染。在心肌细胞il - 6的表达非常疲软,没有检测到表达TNF-α和MCP-1确定。有趣的是,il - 6的表达减少心肌细胞病毒感染后6小时。巨噬细胞表达TNF-α和MCP-1,而MCP-1表情略增加由于CVB3感染和TNF-α表达式保持不变。如果巨噬细胞感染高10倍数量的CVB3莫伊(5)促炎细胞因子的基因表达TNF-α和MCP-1然后调节后6小时。此外,趋化因子MCP-1表达高出近100倍在心脏成纤维细胞巨噬细胞但病毒导致的表达增加MCP-1在两种细胞类型。

干扰素的抗病毒细胞因子-γ和抗炎细胞因子il - 10主要与t细胞有关。没有表达干扰素-γ和il - 10在这里调查发现细胞类型(32),而干扰素-β心脏成纤维细胞表达。干扰素的表达βtoll样受体有关,这是已知的病毒RNA等识别核酸。这种机制也属于先天免疫系统。最近表明,高干扰素-β在心肌细胞表达水平降低病毒复制10]。

4.2。CVB3感染后病毒感染和复制

柯萨基病毒和腺病毒受体(CAR)被确认为CVB3的细胞受体(33- - - - - -35]。小鼠心脏成纤维细胞、心肌细胞和巨噬细胞的基因表达检测汽车。心脏成纤维细胞显示汽车的高表达与心肌细胞相似,这是进一步增加在病毒感染后24小时。在心肌细胞,汽车表达式保持在同一水平。此外,据报道,CVB3感染心肌细胞内的汽车差别显示对这些段落(321]。对小鼠巨噬细胞基因表达的车不可能是但非常低感染取决于CVB3仍可检测。巨噬细胞进一步检测中没有发现汽车蛋白质。这表明汽车不表达或表达低于检测水平,这将符合确定低感染。另一个原因也可能是,CVB3粒子进入细胞后附加到另一个受体,这也是报告为CVB3受体,衰变加速因子(DAF) / CD55 [36]。在另一项研究在人类心脏细胞CVB3的内化报道CD55和车挡单克隆抗体的存在。此外,他们发现使用免疫沉淀反应,CVB3至少五个额外的细胞受体结合,不同于汽车和CD55,表面上的人类心脏细胞(37]。这表明CVB3似乎使用多个受体在心肌细胞内化。

进入细胞后,病毒通常开始复制(38,39]。一般来说,病毒复制包含两个步骤。首先,互补的负链RNA病毒粒子的合成,然后作为模板合成大量的后代正链RNA (40,41]。自从CVB3的基因组由(+)链RNA组成,一个(−)链RNA合成作为病毒复制的一个中间。小鼠心脏成纤维细胞以及心肌细胞揭示CVB3的严重感染巨噬细胞相比,发现了不到100张。目前还不清楚这些发现CVB3副本对应于不完全删除病毒颗粒或细胞内的病毒粒子由于可靠的病毒感染。这里的证据,巨噬细胞被病毒感染,是由中间(−)链的检测CVB3 [40]。

此外,心脏成纤维细胞显示出巨大的病毒复制的后代(+)链以及中间(−)链。在成纤维细胞链都是高度放大后6小时至24小时CVB3感染见图6。(+)链132倍增加6 - 24小时(83×10³ 11×10⁶副本)。相反,在心肌细胞少CVB3复制数字检测和中间产物的量(−)链之间几乎没有增加6小时和24小时后感染。但这显然足以产生一个增加数量的后代(+)链RNA导致的14倍增加(+)链(7.5×10³ 107×10³副本)。

由于巨噬细胞是先天免疫系统的一部分,他们通常首先识别和吞噬入侵的病原体(15]。此外,他们负责为t细胞抗原表达。树突细胞的类似的功能也报道。他们确认了,吞噬病原体,最后展示他们的部分抗原(17]。在这里,我们使用了巨噬细胞细胞株RAW264.7。感染与CVB3证明对于这个特定的细胞类型,从正面以及负面RNA链CVB3的决心。有趣的是,而温齐尔等人最近在树突状细胞(记录这17]。在那里,CD11c⁺树突细胞来源于C57BL / 6能够完全消除CVB3的负链RNA后8天内感染。在我们的细胞培养实验中,巨噬细胞感染5莫伊减少(+)以及(−)链但没有改变在24小时内以巨噬细胞感染0.5莫伊。这可能是一种解释病毒持久性的心脏组织,由于巨噬细胞只能减少,但并不完全清楚,CVB3的受感染的组织。

总之,心脏成纤维细胞以及心肌细胞是CVB3感染的靶细胞。心脏细胞复制中间(−)链和后代(+)链RNA而没有可靠的增加巨噬细胞中检测出病毒RNA。在更高的病毒浓度,巨噬细胞消除CVB3但没有完整的病毒清除可能观察表明持续的病毒感染。心脏成纤维细胞加剧CVB3-induced病毒性心肌炎心肌细胞相比,加剧了病毒复制。另一方面,他们开始心脏炎症基因表达的上调TNF-α等促炎细胞因子il - 6, MCP-1以及抗病毒干扰素-β并没有观察到心肌细胞感染CVB3。未来的研究必须阐明这些体外的变化是否使用不同的细胞类型是重要的体内研究小鼠模型以及人类心肌炎患者。

总之,我们建议心脏成纤维细胞发挥重要作用的病理CVB3-induced心肌炎。这些结果将引发进一步的研究目标心脏成纤维细胞为病毒复制的另一个重要贡献者可加剧心肌炎。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究支持的德国的研究和教育(DZHK,德国心血管研究中心),在“Forschungsforderungsfond der Medizinischen Fakultat”,尤克里里琴,汉堡,NWF-14/07,德意志Forschungsgemeinschaft(脱硫、SFB-TR-19 TP A2)。作者感谢Mareile施罗德和Frauke Gotzhein优秀技术支持。