文摘
结核病是第二个最常见的原因死于传染性疾病和导致许多国家高社会经济损失。正确的诊断是根除结核病的第一步。发展快速,简单,准确诊断结核病测试和描述的患病率结核分枝杆菌(MTB)基因型和免疫的结核病患者,共37个结核病患者和30名健康控制(HC)从马尼拉被录取。Loop-mediated等温扩增结核分枝杆菌(灯)可靠地检测出感染。马尼拉基因型被spoligotyping方法在结核病患者。骨桥蛋白(OPN)、干扰素-全身蛋白质10 kDa (IP-10)和中性粒细胞计数被发现反映急性期结核分枝杆菌的感染。敏感性和特异性分别为94.6%和93.3%,分别为OPN和IP-10,他们分别为83.8%和78.6%,分别为中性粒细胞。OPN的结合,IP-10,中性粒细胞计数,il - 6,引发,TNF -galectin-9 MCP-1,血小板,白细胞计数正确识别所有的HC和96.3%的结核病患者。灯的方法可以作为一种快速、支持方法除了耗时文化的方法。OPN、IP-10和中性粒细胞计数是有用的在感染结核分枝杆菌检测和可能效用监测疾病的进程。
1。介绍
结核分枝杆菌(MTB)的病原体结核(TB)、第六届菲律宾的死亡和疾病的主要原因。尽管全球趋势降低发病率、患病率和死亡率与MTB感染有关,大约230000例被发现仅在菲律宾2012年(1]。老人,城市贫民,吸烟者和个人免疫系统,如HIV病毒携带者,营养不良,和糖尿病,属于高危人群(2]。除了结核分枝杆菌相关的健康负担,这种疾病的后果是另一个严重的社会经济损失。
发展快速,简单,准确的检测结核病诊断是许多调查人员的主要焦点。在资源缺乏的国家,结核病诊断通常是基于临床症状,影像学特征和显微观察酸杆菌(AFB)快。需要长时间培养的细菌培养方法获得可接受的敏感性,延误早期启动抗结核治疗。近年来,核酸扩增(NAA)测试显示潜在的最优诊断结核病诊断结核分枝杆菌的方法。Loop-mediated等温扩增(灯)是一个中子活化分析方法,使微量的细菌DNA的检测在一小时内等温条件下(3]。
骨桥蛋白(OPN)是一种多功能磷酸化糖蛋白合成的各种免疫和多发地细胞(4,5]。结核分枝杆菌OPN水平上升曾被观察到在感染和其它传染性病原体(4,6,7对T),两极分化的免疫反应h1响应可以通过增强il - 12和干扰素-γ分泌(4,8]。
Galectin-9 (gal-9)β-galactoside-binding matricellular蛋白诱发细胞激活,chemoattraction和细胞死亡。Gal-9,绑定到其受体t细胞免疫球蛋白和粘蛋白domain-containing molecule-3 (Tim-3),刺激杀菌活动鼠标结核病模型(9,10]。Gal-9和Tim-3表达CD4 +和CD8 + t细胞可能升高在结核病感染人类,而健康的人(11];然而,他们在等离子体浓度直到现在还没有被报道。
干扰素-γ诱导蛋白10 kDa (IP-10)是一种最深入研究生物标志物在结核病感染,是一种很有前途的替代标记替换当前干扰素-γ释放assay-based方法(12]。IP-10参与多种生物功能,诱导趋化作用,细胞凋亡,抑制细胞生长,和招聘激活t细胞,巨噬细胞、NK细胞的感染(12]。
相对较少的注意力都集中在感染结核分枝杆菌中中性粒细胞的作用,而宿主巨噬细胞和其他免疫反应组件。中性粒细胞引起强烈吞噬活动(13)和neutrophil-driven,干扰素(IFN)诱导转录签名在整个人类血液,它最近被证明是与疾病严重程度相关,表明中性粒细胞的直接贡献发病机理(14]。其他的研究也表明,中性粒细胞有助于早期对MTB[的防御反应15,16),但在疾病的后期,观察到相反的趋势(17,18]。
在目前的研究中,我们评估感染结核分枝杆菌灯检测的可靠性和使用spoligotyping识别结核分枝杆菌的最普遍的基因型在马尼拉。我们还分析了一个广泛的生物标志物,这既反映感染结核分枝杆菌细胞和体液免疫反应。我们的结果证实了效用的灯和spoligotyping结核病诊断和基因分型的方法,表明OPN IP-10,中性粒细胞计数反映疾病的急性期,有前途的生物标志物监测疾病的过程。
2。材料和方法
2.1。参与者
37阴性患者的研究人群包括随机选择从圣拉萨罗医院的门诊部(SLH、马尼拉、菲律宾)染色有积极的空军基地,肺结核的临床症状,胸片特征和之前没有结核病治疗的历史。结核病的控制健康的志愿者缺乏迹象;然而,他们的历史潜伏结核感染(LTBI)或其他肺部疾病是未知的。伦理委员会批准的这项研究是SLH和东北大学医院,从每个参与者获得书面知情同意。
2.2。样品收集
血液收集5毫升EDTA管和等离子体被离心分离和存储在分析。使用NALC-NaOH口水被传统的净化过程。离心后,上清液被丢弃和DNA被释放在95°C细胞颗粒通过加热5分钟,重复三次。
2.3。临床数据和生物测量
全血细胞计数(CBC),包括微分项白血细胞和血浆水平的免疫球蛋白和IgA,对每个样本进行。等离子体水平的29细胞因子和趋化因子测量使用Milliplex映射(微孔,德国)。Bio-Plex管理器软件(版本6.0)是用于珠采集和分析。OPN蛋白水平测定使用的人类骨桥蛋白Quantikine酶联免疫试剂盒(美国研发系统)和gal-9水平的酶联免疫试剂盒(GalPharma、日本)。抗结核的醣脂类(TBGL) IgA免疫球蛋白和抗体滴度得到使用限定词TBGL抗体酶联免疫试剂盒(Kyowa助理医生,日本)。
2.4。灯的方法
灯的反应是在反应混合物(25执行μL)包含6个引物(3),1.4毫米deoxynucleoside三磷酸腺苷,0.8 M甜菜碱,20毫米三/盐酸(pH值8.8),10毫米氯化钾,10毫米(NH)4)2所以4,8毫米MgSO48 UBstDNA聚合酶(新英格兰生物学实验室),5μL的细菌DNA。的混合是在64°C的环境60分钟Loopamp实时浊度计(la - 200, Teramecs)。反应被认为是积极的浊度大于0.1时在60分钟(650海里)。
2.5。Spoligotyping方法
Spoligotypes结核分枝杆菌临床分离株测定如前所述[19]。短暂,区域放大了一对引物,博士和PCR产物杂交一组43 spacer-specific寡核苷酸探针,共价绑定到膜。spoligo-international类型决定通过比较spoligotypes对国际spoligotyping数据库(20.]。
2.6。统计分析
的Mann-Whitney以及被用来比较两组之间的差异,和斯皮尔曼等级相关分析生物标记和其他参数之间的关系。统计分析使用GraphPad棱镜程序(美国GraphPad软件版本6)和SPSS程序(SPSS Inc .版本22日,美国)。判别函数分析和接收机算子特征(ROC)曲线分析被用来评估生物标志物的预测能力。曲线下的面积(AUC)值计算,和截止值估计基于灵敏度之间的最佳比例,特异性和似然比。P值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。研究参与者的特征
共有37个结核病患者和30名健康对照组(HC)参加本研究。基本的人体测量和临床特点的研究参与者如表所示1。胸肺部x光显示双边病理学在68.8%的情况下,且只有一个肺的影响在31.2%的情况下。肺腔和积液被发现在47%和6.3%的结核病患者,分别。实验室研究显示低红细胞计数、血红蛋白水平、血细胞比容,相对淋巴细胞计数的结核病组相比,HC组。绝对数量的白细胞(WBC)和相对数量的中性粒细胞,单核细胞,血小板和血浆免疫球蛋白和IgA结核病患者(表中更高1)。每种类型的白细胞的绝对和相对价值有紧密的关联(数据没有显示)。
3.2。灯和基因分型
我们在所有37 MTB感染确诊病人的样品灯的方法。所有的DNA样本受到spoligotyping识别的最普遍的基因型。我们发现所有的病人感染了结核分枝杆菌马尼拉类型。
3.3。比较之间的等离子体生物标志物浓度结核病和HC的个人
使用多路复用免疫测定,我们评估了29可溶性血浆浓度生物标志物在HC,以及结核病患者antituberculous治疗开始之前。生物标志物的水平和他们的对比组如表所示2。的浓度显著升高- - - - - -1,肿瘤坏死因子- - - - - - ,- - - - - -6 eotaxin- - - - - -8、IP- - - - - -10,MCP- - - - - -1观察结核组。伊尔- - - - - -1β,- - - - - -2 IL-3 IL-15 IL-17A,- - - - - -4,- - - - - -5,- - - - - -13日,米兰理工大学管理学院- - - - - -1肿瘤坏死因子-β,伊尔- - - - - -10没有考虑统计分析,因为他们的平均水平低于最低可检测水平在两组。我们还测量了等离子体水平的两个matricellular蛋白质,OPN和gal-9,发现统计上更高水平的蛋白质在结核病患者相比,HC的个人。更高浓度的TBGL免疫球蛋白和IgA是结核病患者中发现的。在HC,抗结核抗体与年龄相关,anti-TBGL免疫球蛋白(,),和IgA (,);然而,这种关系中没有观察到结核病组(数据未显示)。Anti-TBGL免疫球蛋白与Anti-TBGL IgA (,结核病组)但不是HC组(数据没有显示)。Anti-TBGL抗体海拔不是一般海拔相关抗体的血浆(数据未显示)。
3.4。OPN的相关性,IP-10,中性粒细胞计数,Gal-9 HC和结核病组
我们进行了相关性分析的三个最有预测力的结核病与其他测量参数标记。知识产权- - - - - -与食欲不振、10表达水平呈正相关- - - - - -1,- - - - - -6,- - - - - -8、OPN和加- - - - - -9表达与反呈负相关- - - - - -TBGL IgG抗体效价(表3)。此外,OPN和引发(表表达水平相关3)。结核病患者嗜中性白细胞计数增加,干扰素-γ和血红蛋白含量下降,红细胞比容,等离子体免疫球蛋白浓度,和淋巴细胞减少症(表3)。最后,我们研究了gal-9生物标记和其他实验室的关系参数。高gal-9水平与肿瘤坏死因子-高、il - 6、IL-5 IL-3, EGF,引发,IP-10表达和低水平的gm - csf(表3)。
3.5。歧视潜在的生物标记物
生物标志物差异化分析了HC和结核病的ROC分析和截止值确定基于灵敏度之间的最佳比例,特异性和似然比(表4)。最高的歧视性财产IP- - - - - -10和OPN,其次是中性粒细胞、血小板,TNF- - - - - - ,MCP- - - - - -1、白细胞计数加- - - - - -9、引发。接下来,我们进行分析,这是一个多元种族歧视的方法描述中最歧视性变量组。OPN被确认为有歧视性的能力最高,其次是IP-10,中性粒细胞,il - 6、TNF引发- - - - - - ,MCP- - - - - -1、血小板gal-9和白细胞。使用这些标记的组合,所有健康的个人和有96.3%的结核病患者正确分类。
4所示。讨论
尽管它的低敏感性,空军基地染色通常用于试图区分分枝杆菌感染和其他肺部细菌感染。细菌培养方法,QuantiFERON结核病测试和PCR改善结核病检测的敏感性和敏感性,但耗时,需要训练有素的实验室工作人员。最近,我们开发了一个灯的结核分枝杆菌检测方法精度在一小时3]。感染结核分枝杆菌在这里,我们确认我们所有的样品灯;细菌培养并没有执行,因为之前的研究表明,MTB-LAMP敏感性文化积极的样品达到100%,特异性文化负样本(94.2%3]。此外,来自泰国的研究小组发现,在临床未知样本测试,灯方法的敏感性为98.92%,特异性为100%相比标准的文化分析(21]。样品也研究了spoligotyping确定最普遍流行株在马尼拉。我们发现我们所有的结核病患者结核分枝杆菌感染了一种马尼拉的和一个穿制服的结核分枝杆菌基因型的这一发现是相当令人惊讶。的到来,中国、日本和西班牙组可能影响该地区结核分枝杆菌收购各种基因型;然而,信息几乎没有关于结核分枝杆菌流行基因型循环在菲律宾。
matricellular蛋白质的角色支持结核病感染并没有很好的研究。我们发现两个matricellular蛋白质的高血浆水平,OPN,,第一次gal-9在首次治疗结核病患者。Matricellular蛋白分泌到细胞外基质环境但不要在这个位置发挥主结构的作用和调节异常多样的细胞功能,包括细胞粘附、形状、迁移、分化、增殖和炎症反应22]。有人提议matricellular蛋白质进入炎症组织,成为固定在那个网站为吞噬作用生成信号和炎症细胞的趋化性23]。OPN是高度表达结核性肉芽肿和支持肉芽肿形成通过其功能作为一个化学引诱物细胞因子(24]。OPN和gal-9可能激活循环免疫细胞产生的,但一个更合理的解释是,他们释放到循环从组织网站。我们的未发表的数据显示胸膜液/等离子体比率升高gal-9和OPN在结核病病人,和Inomata等人表明OPN水平增加比例与肺损伤的程度(25]。我们评估患者之间的差异并没有肉芽肿形成,保理在病变的程度和其他临床参数;然而,我们没有观察到任何统计相关性,可能是因为辐射发现与大多数病人并没有暗示了肉芽肿。我们发现OPN和gal-9与引发和IP-10我们假设OPN和gal-9激活像IP-10趋化因子和细胞因子的表达,TNF -、il - 6和引发巨噬细胞,帮助招募结核分枝杆菌的感染的免疫细胞。这个设想是由观察从白et al .,他发现matricellular蛋白质CCN1增强TNF的表达,il - 1β、白介素、干扰素-γ,MIP-1,IP-10小鼠巨噬细胞通过其受体β2和syndecan-422]。IP-10产生炎症和血液水平的网站报道与炎症过程的程度(26,27]。相比之下干扰素-循环水平较低的γ血液中,高水平的IP-10 antigen-stimulated细胞使这个趋化因子所产生的一种很有前途的候选人生物标志物结核分枝杆菌的感染,甚至在感染艾滋病毒的人(28,29日]。我们发现高患者血浆IP-10报告食欲不振,但这样的趋势与其他生物标记没有被观察到。Juffermans等人也有类似的观察,IP-10但不引发,MIP-1b或MCP-1与食欲不振和发烧30.]。
中性粒细胞,最有预测力的活动性结核病感染的标记,有最大的影响在结核病患者白细胞升高。中性粒细胞通常认为对传染性病原体有很强的活动。嗜中性粒细胞计数观察结核病患者高,预后差(31日]。中性粒细胞是由各种细胞因子和趋化因子,吸引了包括引发,并迅速积累在分枝杆菌感染的网站(32- - - - - -34]。我们还观察到引发海拔在结核病患者,这可能是由于hyperproduction刺激巨噬细胞,上皮细胞在肺,甚至由中性粒细胞自己,虽然没有与观察中性粒细胞相关性。先前的研究表明,低淋巴细胞计数提示疾病的扩展新结节形成,但切换到淋巴球增多表明倾向于治疗(35]。因此,仔细评估血液的变化可能有诊断价值。
人们普遍认为细胞介导免疫保护MTB有着至关重要的作用。然而,MTB是兼性胞内病原体的感染周期的细胞内和细胞外的阶段。最近的研究表明,应用单克隆和多克隆抗体的免疫和粘膜疫苗接种试验证明令人信服地必要的细胞免疫和体液免疫之间的相互依存和协同作用36]。警告当前血清学测试的效用在结核病的免疫诊断和强烈建议他们不得用于肺和肺外结核病的诊断,但我们相信anti-TBGL抗体滴度的检测可以作为保证信号结核分枝杆菌的感染。
在我们的研究中,结核病患者代表一小群人接受考试由于疑似结核病。在所有的病人,只有马尼拉基因型鉴定;因此,这将是研究结核病患者的免疫状况感兴趣的结核分枝杆菌感染其他基因型。未来,更大样本量的研究应该是灯的应用方法和拟议中的结核病生物标志物研究。
总之,灯是一个简单和低成本的方法直接检测结核分枝杆菌的患者的痰。此外,灯连同spoligotyping方法作为敏感,准确的结核病诊断和监测工具普遍血统在某些地区的结核病。增加IP-10 OPN,最好和中性粒细胞水平反映结核病感染的急性期,和测量他们的波动可能提供一个合理的依据确定结核病严重程度和预后。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
贝亚特治广和苏珊Leano写道,预制生物标志物的测量和数据分析,同样导致了工作。Chie及其评估灯和spoligotyping结果;Haorile Chagan-Yasutan Luminex执行分析;Toshiro Niki gal-9测量;南斯拉夫牌汽车Ashino Yasuhiko铃木,伊丽莎白Telan, Toshio服部年宏导致了研究计划和开展工作。Toshio服部年宏是担保人。
确认
这项工作是支持的科研费用从卫生部健康和福利计划,劳动力,和福利,日本(TH),可持续发展科学技术研究合作的日本科学技术振兴机构、日本(y),和协作研究中心的资助在北海道大学控制人畜共患病。作者感谢Kyowa助理医生、日本提供限定词TBGL抗体酶联免疫试剂盒。