文摘

每年成千上万的人患有严重的疟疾。先天免疫反应起着决定的作用在宿主防御疟疾。瞬时受体电位辣椒1 (TRPV1)调节macrophage-mediated反应在脓毒症,但其作用其他致病性疾病从来没有解决。我们调查的影响capsazepine, TRPV1拮抗剂,疟疾。C57BL / 6小鼠获得10项提名⁵血红细胞感染鼠体内安卡腹腔内。未感染的老鼠被用作控制。Capsazepine或车辆有腹腔内6天。老鼠扑杀后7天感染和血和脾细胞表型和激活。Capsazepine循环但不是脾F4/80下降⁺Ly6G⁺细胞数量以及两F4/80激活⁺和F4/80⁺Ly6G⁺细胞被感染的动物。此外,capsazepine循环但不是脾GR1一起增加⁺人口和自然杀伤(NK),不干扰自然杀伤(NKT) T细胞数量和血NK和NKT激活。然而,capsazepine减少CD69表达脾NKT但不是NK细胞。感染增加的脂质过氧化反应和肿瘤坏死因子的释放α和干扰素γ,尽管capsazepine-treated组表现出更低的脂质过氧化反应和肿瘤坏死因子α。并不影响parasitaemia Capsazepine治疗。总的来说,TRPV1对抗疟疾素来调节先天免疫反应。

1。介绍

疟疾是一种传染性疾病引起的细胞内属的原生动物疟原虫,从一个人传播到另一个通过受感染蚊子的叮咬。它影响了数以百万计的人每年,在不发达国家儿童死亡率的主要原因(1]。重症疟疾等脑型疟疾经常是致命的感染和结果取决于宿主的免疫反应,与先天免疫发挥着决定性作用(2,3]。可用抗疟治疗目标疟原虫。然而,消除寄生虫并不停止疾病的临床后果幸存患者重症疟疾可以开发一系列神经赤字(4,5]。在这种背景下,一个有效的免疫反应对病人恢复至关重要。先天反应是主要免疫组成部分已感染的病人疟原虫第一次被发展必不可少的一个有效的获得性免疫反应(6]。

最近,一个瞬态保护作用受体辣椒1 (TRPV1)上发现的非选择性阳离子通道神经和nonneuronal细胞,建议在bacteria-induced脓毒症(7- - - - - -10]。事实上,在缺乏TRPV1激活的情况下,巨噬细胞吞噬能力等功能,释放炎症介质(一氧化氮(NO)、活性氧(ROS),和细胞因子)受损(9]。同时,TRPV1生存与巨噬细胞9]。证据表明之间的反馈TRPV1激活和ROS生产可能存在;除了调节氧化应激通过下调ROS生成,这种受体可以直接激活过氧化氢(H₂O₂)[11),由超氧化物阴离子释放(12- - - - - -14]。氧化应激产生直接影响macrophage-erythrocyte-endothelium交互和失衡的途径可能会引发过度的损害和受损宿主的免疫反应对疟疾(15,16]。

在疟疾,TRPV1的角色第一次调查。我们使用TRPV1拮抗剂,capsazepine评估是否TRPV1能调节先天免疫反应在动物感染了疟疾鼠体内安卡。

2。材料和方法

2.1。动物

近亲交配的雄性C57BL / 6小鼠(8周)。老鼠从动物的设施部门的寄生虫学,生物医学科学研究所,圣保罗大学。老鼠在气候上控制环境和提供食物和水随意。所有程序都是大学的伦理委员会批准的巴西圣保罗和依法实施动物福利协会(SBCAL)。

2.2。疟疾感应

疟疾是由一个单一的腹腔内(i.p)注入10⁵红细胞(红血球)感染鼠体内安卡(克隆1.49 l)所描述的伊莱亚斯et al。17]。Parasitaemia评估日常血涂片染色染色,显微镜,从天感染后5 - 7天,是感染的红细胞表面的表达为%。老鼠晚期犀牛的克他命(75毫克/公斤;Dopalen、精益、巴西)和甲苯噻嗪(1毫克/公斤;i.p。Sigma-Aldrich、巴西),通过心脏穿刺抽血后7天感染(premortality终点;(18,19])。收集他们的血液和脾脏进行进一步分析。血浆分离和储存在−70°C的进一步定量血浆醛和细胞因子。细胞群表型和激活被流式细胞术进行评估。未感染的老鼠被用作控制。

2.3。药物治疗

为了评估TRPV1在疟疾的角色,动物收到TRPV1拮抗剂,capsazepine (Sigma-Aldrich、巴西;,(控制)组和感染感染组),腹腔内感染后24小时,6天(2 x天,50μg /动物;(9])。车辆(10% DMSO在盐水,120μL /动物;,(控制)组和感染,感染组)被用来控制。

2.4。流式细胞术分析

血液和脾脏样本感染和未感染的老鼠和单细胞悬浮体准备。外周血细胞被孤立Percoll梯度(Sigma-Aldrich、巴西)。脾脏是均质和经过70年尼龙网μ创建一个单细胞悬液。细胞和锥虫蓝染色(Sigma-Aldrich、巴西)和评估可行性血球计。细胞(10⁶)洗,resuspended流式细胞术缓冲区(2%胎牛血清(表达载体、巴西)磷酸缓冲saline-PBS (Sigma-Aldrich、巴西)),并直接沾共轭单克隆抗体(BD生物科学或eBiosciences、巴西):anti-F4/80 FITC, anti-IAb PE、anti-Ly6G PerCP, anti-GR1 Pe-Cy7, anti-CD3 PE和APC, anti-NK1.1 FITC,和anti-CD69 PECy5。事件被收购BD FACSCanto (BD Biosciences-Immunocytometry系统)和分析使用FlowJo软件(树明星Inc .)。为了分析单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞数量,表达CD3细胞⁺,CD4⁺,CD8⁺,CD19⁺是封闭的和表型F4/80 GR1一起,Ly6G谱系标记进行评估。结果表示为代表双色dot-plots以及细胞的数量(×10⁶),除了IAb,表示为荧光。

2.5。血浆细胞因子水平

血浆TNF水平α,干扰素γil - 10、il - 4、il - 6 - 2,和IL-17评估使用仪珠阵列(CBA)鼠标Th1 / Th2 Th17细胞因子工具包(BD生物科学、巴西)根据制造商的指示。分析在Facscalibur血细胞计数器流式细胞分析仪(BD Biosciences-Immunocytometry系统)。结果计算CBA FCAP阵列软件(BD生物科学、巴西)pg / mL,表示为成倍增加相对于未受感染的控制。

2.6。血浆醛

总血浆醛(主要是丙二醛)含量被量化为一个索引的脂质过氧化反应和氧化应激,如前所述[20.,21]。简单地说,100年μL与100年样本被孵化μL PBS和400μ硫代巴比土酸的L (0.67%;Sigma-Aldrich、巴西),45分钟的90°C。样本然后离心机在1000 xg 10分钟。三百年μ上层清液的L与300年孵化μL(丁醇(Sigma-Aldrich、巴西)和30μL的氯化钠饱和溶液(Sigma-Aldrich、巴西)。样本混合在一个漩涡,离心机在1000 xg 2分钟,然后添加到96孔板(200μ信用证)。吸光度是阅读在535和572海里和吸光度之间的差异被用来计算醛的浓度,用发色团的摩尔消光系数(1.56×10⁵米⁻¹/厘米⁻¹)。结果表示为成倍增加相对于未受感染的控制。

2.7。数据分析

结果表现为平均值±标准偏差(SD)。抑制的百分比报告为均值±SD在每个实验中获得的禁忌与控制样本。数据是由方差分析的统计比较其次是Bonferroni和未配对以及在适当的时候。的值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。Capsazepine并不影响Parasitaemia

图1显示parasitaemia水平感染后第七天,小鼠的车辆或capsazepine对待。在两组Parasitaemia逐步增加。重复治疗对parasitaemia capsazepine没有影响。实验进行premortality端点。因此,没有脑型疟疾的迹象,如减少刺激响应性,共济失调,呼吸窘迫或虚脱,麻痹和抽搐观察capsazepine——或vehicle-infected老鼠。然而,两组动物显示立毛和/或异常姿势,由于感染。

3.2。Capsazepine改变循环单核细胞而不是人口数量和激活脾脏巨噬细胞

作为代表人物2(一个)- - - - - -2 (e),三个不同的外周血白细胞的数量在所有组中发现的未感染和感染动物:F4/80⁺,F4/80⁺Ly6G⁺和Ly6G⁺细胞。疟疾对Ly6G感应没有影响⁺细胞群之间没有统计学意义的任何评估小组。均值±Ly6G SD值⁺数量如下:vehicle-uninfected组capsazepine未感染组vehicle-infected集团,capsazepine感染组。另一方面,p .鼠安卡感染增加F4/80⁺Ly6G⁺细胞数量在车辆-(增加3.9倍)和capsazepine(增加1.9倍)治疗组相比,感染控制,同时F4/80上没有效果观察⁺细胞群(数据2 (b)和2 (c))。此外,疟疾引起的激活增加F4/80⁺(增加5.1倍)和F4/80⁺Ly6G⁺(增加6.6倍)循环细胞未受感染的动物相比,用IAb的表达在这些细胞(数字2 (d)和2 (e))。重复管理capsazepine导致受感染动物减少F4/80⁺Ly6G⁺人口膨胀,%,但没有影响F4/80⁺手机号码(数字2 (b)和2 (c))。此外,p .鼠ANKA-induced激活F4/80⁺和F4/80⁺Ly6G⁺细胞被capsazepine停止。图中所描绘的一样2 (d)和2 (e),capsazepine治疗减少了%,%,F4/80 IAb的表达⁺和F4/80⁺Ly6G⁺细胞,分别vehicle-treated相比,感染控制。感染了F4/80流通的数量⁺Ly6G⁺细胞,发现在GR1一起下降⁺细胞群(%)。然而,感染小鼠接受capsazepine展出更多的这些细胞与他们相比未感染-(增加1.8倍)与感染对照组(增加2.4倍)。均值±GR1一起SD值⁺数量如下:vehicle-uninfected组capsazepine未感染组vehicle-infected集团,capsazepine感染组 。Capsazepine治疗未受感染的动物没有影响两F4/80扩张或激活⁺和F4/80⁺Ly6G⁺细胞(数据2(一个)- - - - - -2 (e)),无论是GR1一起⁺细胞。

同样,F4/80⁺,F4/80⁺Ly6G⁺和Ly6G⁺细胞中发现脾脏样本获得的感染和未感染的老鼠是否接受capsazepine(数字3(一个)- - - - - -3 (e))。作为循环Ly6G观察⁺细胞,对脾Ly6G疟疾感应没有影响⁺细胞。脾Ly6G平均数±标准差值⁺数量如下:vehicle-uninfected组capsazepine未感染组vehicle-infected集团,capsazepine感染组。然而,p .鼠安卡注入了F4/80的数量⁺和F4/80⁺Ly6G⁺细胞在两种汽车(2.0,增长了5.8倍,职责。)和capsazepine -(1.5 - 4.9倍增加,resp)。治疗组相比,各自控制无毒性(数字3 (b)和3 (c))。同时,p .鼠安卡感染增强F4/80⁺和F4/80⁺Ly6G⁺细胞在两种汽车(5.5,增长了2.0倍,职责。)和capsazepine -(2.3 - 1.8倍增加,resp)。治疗组相比,各自控制无毒性(数字3 (d)和3 (e))。Capsazepine没有对脾脏F4/80的数量或激活的影响⁺和F4/80⁺Ly6G⁺细胞(数据3(一个)- - - - - -3 (e))。脾脏GR1一起⁺细胞群未加无论治疗和平均数±标准差值如下:vehicle-uninfected组capsazepine未感染组vehicle-infected集团,capsazepine感染组。此外,对F4/80 capsazepine没有影响⁺和F4/80⁺Ly6G⁺细胞(数据3(一个)- - - - - -3 (e))当管理未受感染的老鼠。

3.3。Capsazepine调节血液和脾脏NK和NKT人口数量和激活

我们也评估capsazepine对循环的影响和脾脏NK (CD3⁻NK1.1⁺)和NKT (CD3⁺NK1.1⁺)细胞。外周血NK和NKT细胞被发现在所有组和感染动物无毒性(数字4(一)- - - - - -4 (e))。疟疾对NK或感应没有影响NKT细胞数量相比,感染控制老鼠(数字4 (b)和4 (d))。另一方面,NK,但不激活NKT通过CD69的表达,既增加了车辆-(增加11.1倍)和capsazepine(增加11.5倍)治疗组相比,各自的未感染的控制(图4 (c))。然而,capsazepine治疗显著提高NK细胞群(图4 (b))相比,其感染对照组(增加1.8倍)或vehicle-treated受感染动物(增加1.5倍)。capsazepine也能够增强NKT-infected细胞的激活(增长了2.7倍;图4 (e))。重要的是,NK细胞占大多数的循环和NK1.1激活⁺细胞在感染动物(图4)。

同样,脾NK和NKT细胞被发现在所有未感染组和受感染动物(数字5(一个)- - - - - -5 (e))。疟疾感应引起脾NKT但不是NK细胞群扩张相比,感染控制老鼠(数字5 (b)和5 (d))。这是观察到的车辆-(增加5.6倍)和capsazepine(增加4.1倍)治疗小鼠(图5 (d))。数据5 (c)和5 (e)证明CD69表达增强脾NK和NKT细胞获得感染的小鼠与汽车(5.3,增长了6.9倍,resp。)或capsazepine(5.6 - 3.1倍增加,职责)。然而,NKT激活%低capsazepine-treated老鼠相比vehicle-infected控制(图5 (e))。Capsazepine治疗感染小鼠脾脏NK和NKT细胞没有影响数字或NK激活(图5)。同样,capsazepine没有改变脾NK和NKT概要(手机号和激活)样本中获得未受感染的老鼠(图5)。

3.4。Capsazepine减少脂质过氧化和血浆肿瘤坏死因子α水平p .鼠ANKA-Infected老鼠

p .鼠安卡感染增加了脂质过氧化反应在两个车辆capsazepine-treated老鼠,是证明了等离子体醛(图的水平6(一))。然而,这种增加不明显capsazepine-treated组(%减少)。疟疾也引发肿瘤坏死因子的释放α和干扰素γ在这两种感染组(数字6 (b)和6 (c))。肿瘤坏死因子α产量显著降低capsazepine治疗(%;图6 (b))。另一方面,capsazepine并不影响干扰素治疗γ释放引发疟疾(图6 (c))。车辆和capsazepine-treated未受感染的老鼠表现出类似水平的血浆醛,TNFα,干扰素γ(数据没有显示)。生产il - 4、il - 6 - 2, il - 10, IL-17没有检测到任何的评估小组。

4所示。讨论

自发现以来,证据积累,TRPV1有可能发挥关键作用在各种病理,尤其是那些与失衡的免疫和炎症反应有关,如哮喘(22- - - - - -24和类风湿性关节炎25- - - - - -27]。最近的报告表明,TRPV1表达在免疫细胞如巨噬细胞和外周血单核细胞在炎症条件下(9,28- - - - - -30.]。最近,TRPV1提出调节一系列macrophage-mediated反应细菌感染(9]。事实上,TRPV1删除或对立与贫穷有关实验的结果败血症TRPV1封锁增加病原体和负荷也促进了从当地的一个过渡到一个系统性炎症反应的细菌(7,9,10,31日- - - - - -34]。此外,TRPV1基因敲除小鼠(TRPV1 KO)挑战与肠道细菌或有限合伙人提供生产的炎症介质,包括不,ROS、肿瘤坏死因子等细胞因子α、il - 10、il - 6 (7- - - - - -9]。到目前为止,还没有报道TRPV1扮演任何角色的其他病原体的免疫反应。

在这里,我们首次展示TRPV1 capsazepine对立,非选择性拮抗剂,调节疟疾的先天免疫反应。报告表明,capsazepine礼物物种,TRPV1 modality-specific活动还能抑制乙酰胆碱受体,电压门控钙通道,和hyperpolarization-activated循环nucleotide-gated频道,除了TRPV1 [35- - - - - -38]。然而,重要的是要强调,capsazepine管理在这项研究中,当被费尔南德斯和合作者9)表明,重复使用这种药物进行治疗在活的有机体内产生类似的概要的TRPV1 KO小鼠针对细菌感染(9]。在此,我们通过注射诱导疟疾p .鼠安卡在一个感性品系的小鼠发展大脑像症状,表现为60 - 100%的死亡率在注射后的第二周(审查[19])。我们的研究进行了一个premortality端点,感染后7天。在这个时间点,parasitaemia已经达到11%,与之前的研究结果相一致(17,22]。

证据表明,先天免疫反应中扮演一个重要的角色在感染的早期阶段,激活单核细胞和中性粒细胞释放非特异性炎症介质如ROS和细胞因子(2,39)和发挥他们的角色在吞噬细胞和抗原呈递细胞接触传播感染红细胞表面(40]。的确,由外围血液和组织吞噬细胞吞噬作用被感染的红细胞表面建议的主要机制疟原虫删除(41]。由于这种交互,吞噬细胞可能损伤内皮细胞,从而导致崩溃的循环和脑型疟疾的情况下,损害大脑微脉管系统(4,42]。在感染期间,单核细胞分化成巨噬细胞在脾脏和大脑,大脑变得可用微脉管系统(4]。激活巨噬细胞有助于病原体间隙和激活的淋巴细胞,为了刺激的产生获得性免疫反应能力提高寄生虫清除和战斗继发感染(2,43]。

正如前面提到的,可以找到TRPV1的免疫细胞。然后期望TRPV1通道拮抗作用表示这些细胞会影响他们的表型。我们的结果表明,在感染后7天内,有活化的单核细胞和脾脏巨噬细胞(F4/80⁺)。有趣的是,我们发现一群F4/80传播⁺Ly6G⁺细胞变得明显扩大,激活后(如用IAb表达式)感染。这是第一个报告,我们的知识贡献的疟疾。然而,最近提出一个模型引起的感染牛痘病毒F4/80 C57BL / 6小鼠接种⁺Ly6G⁺细胞确实是单核细胞产生活性氧的能力和干扰素γ同时Ly6G⁻单核细胞产生没有和肿瘤坏死因子α(44]。此外,研究表明,F4/80相同⁺Ly6G⁺细胞取代Ly6G⁻单核细胞的感染过程。这里,我们将展示F4/80的存在⁺Ly6G⁺细胞在脾脏,他们表现出类似的概要文件(在数量和激活模式)Ly6G⁻在这个组织细胞。随着人口F4/80⁺Ly6G⁺细胞上升,GR1一起⁺感染细胞(myeloid-derived抑制细胞)下降。这是预期增加了成熟的单核细胞和中性粒细胞通常发生由于感染(45,46]。然而,在感染后7天,这些变化在F4/80的平衡和/或激活⁺,F4/80⁺Ly6G⁺,GR1一起⁺在脾细胞无法注意到的水平。然而,它是可能的,这些变化可能发生在这个器官在不同的时间点不通过这个研究来解决。

重复治疗capsazepine两F4/80抑制激活引起的⁺和F4/80⁺Ly6G⁺细胞的数量以及减少F4/80传播⁺Ly6G⁺细胞被感染的老鼠。有趣的是,GR1一起⁺细胞数量明显增加了同一组动物,暗示,如capsazepine F4/80关闭⁺- - - F4/80⁺Ly6G⁺介导的反应,通过去活化或减少他们的可用性在循环,这些细胞逐渐取代GR1一起⁺为了恢复细胞免疫反应可能依赖F4/80⁺- - - F4/80⁺Ly6G⁺单核细胞。事实上,GR1一起⁺细胞是建议招募为了补偿“损失”进行极化后的单核细胞疟原虫或细菌感染47,48]。这些细胞也称为监管单核细胞/巨噬细胞和有一个强有力的抑制T细胞增殖能力和Th1反应(49]。另一方面,这些细胞的确切作用的关键疾病仍然是辩论中(审查[47])。

评估这一转变对单核细胞轮廓的影响对炎性介质释放,我们测量了水平的血浆醛(脂质过氧化指标二次氧化应激)和肿瘤坏死因子等细胞因子α和干扰素γ。事实上,高系统性炎症介质如TNF水平α,干扰素γ和醛与重症疟疾在人类50]。事实上,脂质过氧化作用是产生在疟疾的单核细胞/巨噬细胞之间的相互作用和受感染的红细胞,以及内皮(51,52]。此外,细胞因子也发布在应对疟疾,触发抑制红细胞生成和激活各种循环和脾脏细胞(2,53,54]。我们发现,同时减少脂质peroxidation-derived醛和TNF水平α被发现在动物capsazepine术治疗疟疾,干扰素吗γ生产仍然类似于观察样本来自vehicle-infected老鼠。减少氧化应激是预期capsazepine曾建议抑制氧化应激在培养RAW264单核细胞/巨噬细胞在TRPV1独立的方式,虽然从细胞获取此数据并没有与任何病原体挑战产品(55]。后,TRPV1删除显示减少ROS生产由巨噬细胞在脓毒症(9)和调节这些在其他炎症介质的释放条件(14,56]。然而,TRPV1损失函数与肿瘤坏死因子的增加产量α在细菌感染(7,9,32]。可能TRPV1不同调节单核细胞和巨噬细胞对他们产生TNF的能力α。此外,TRPV1对肿瘤坏死因子的影响α生产在不同阶段的疟疾可能会有所不同。

NK和NKT细胞是重要的效应器先天免疫应答的疟疾,直接承认疟原虫来华的红血球和疟疾抗原,除了产生干扰素γ为了遏制parasitaemia [2,18,40]。事实上,这些细胞已经提出早起在疟疾和调解的分化Th1 / Th2反应和贩卖白细胞必不可少的大脑在脑型疟疾(评论[2])。此外,类似于巨噬细胞,它们可以积累在脑型疟疾进入大脑,导致更糟糕的结果(18]。NK细胞也与树突状细胞成熟和脾脏T细胞激活通过释放细胞因子(53,57]。同时,证据表明,在疟疾、NK细胞可能经历一场激烈的营业额甚至迁移的脾(18]。这是在一个类似的调查时间点,在我们的研究中使用(感染后1周)。在这里,我们评估了动态循环和脾脏NK和NKT细胞之间。我们发现p .鼠ANKA-induced感染引起脾NKT但不是NK细胞群的扩张。这不是伴随着任何变化对循环NK和NKT细胞数量。有可能在这个时间点,NK和NKT细胞已经迁移到大脑。事实上,汉森和合作者表明NK细胞积累C57BL / 6小鼠大脑早在感染后4天p .鼠安卡,引发T细胞的迁移到大脑微脉管系统(18]。另一方面,我们表明,NK和NKT细胞成为激活感染,激活细胞NK细胞占多数。令人失望的是,扩张的脾脏NKT细胞没有翻译激活这些细胞CD69表达的只有少数。Capsazepine治疗感染小鼠导致循环NK人口的进一步扩张,但它的激活是类似于vehicle-infected组。此外,capsazepine治疗减少一半脾激活NKT细胞相比,其感染对照组。我们希望减少脾激活NKT细胞和F4/80⁺Ly6G⁺单核细胞由capsazepine会影响干扰素γ释放。然而,我们展示capsazepine对这些人群并不影响干扰素抑制的影响γ生产在疟疾,表明TRPV1干扰素可能不会发挥作用γ生产或NK细胞干扰素的唯一来源γ一旦TRPV1屏蔽。此外,缺乏capsazepine对parasitaemia的影响可能与干扰素的类似的水平γ在两组中发现的动物。

我们的研究提供了第一个证据,TRPV1调节疟疾通过调解先天免疫反应,特别是通过干扰效应细胞的扩张和激活,尤其是单核细胞。我们还表明,TRPV1调节免疫平衡不同单核细胞数量之间除了调节中介发布。可能阻塞TRPV1可以是有益的,减少氧化应激可能反映了在减少血管功能障碍,或有害的,先天反应的损伤可能导致低效的去除寄生虫的除了疟疾低效的获得性免疫反应。然而,TRPV1对抗可能对严重疟疾的影响结果的重要性,仍有待调查。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq;巴西),Coordenacao de Aperfeicoamento Pessoal de含量比(斗篷;巴西),Fundacao德帕罗尽管e Desenvolvimento Cientifico马拉尼昂(FAPEMA;巴西),Fundacao德帕罗尽管Estado de圣保罗(FAPESP,必须占州政府巴西)。