文摘
神经性疼痛对药物治疗反应不佳,部分缓解只有大约一半的病人。葛根素的主要组成部分Puerariae Lobatae基数,中国已被广泛用于治疗高血压和肿瘤。当前的研究检测了葛根素对神经性疼痛的影响使用两个最常用的动物模型:慢性收缩损伤(CCI)和糖尿病神经病变。我们发现连续鞘内管理葛根素抑制7天(4 - 100 nM)机械和热CCI和糖尿病引起的疼痛的反应而不干扰正常的疼痛反应。与此同时,在两种模型葛根素抑制小胶质细胞的激活和脊髓背角星形神经胶质。葛根素也减少了调节水平的核因子-B (NF -B)和其他促炎细胞因子,如il - 6、il - 1和肿瘤坏死因子-在脊髓。总之,葛根素缓解CCI diabetes-induced神经性疼痛,和其有效性可能是由于脊髓神经炎症的抑制作用。葛根素的抗炎作用可能与抑制脊髓NF -B和/或细胞因子激活upregulation。我们得出这样的结论:葛根素对缓解神经性疼痛有显著的影响,因此可以作为神经性疼痛的治疗方法。
1。介绍
神经性疼痛是由于异常的感觉处理外围——和/或中枢神经系统(CNS)和可以由多种因素,包括创伤性损伤,感染,和糖尿病(1]。异常的神经活动在神经性疼痛的发病机制中起着重要的作用,而目前的治疗,抑制异常的神经元活动普遍缺乏有效性,除了他们的多种不良副作用2]。最近的研究表明,中枢神经系统的免疫反应,神经胶质细胞的关键,起着重要的作用在发展和持久性的神经性疼痛3,4]。引起的痛觉过敏和异常性疼痛经常增加促炎细胞因子的水平,包括TNF -,il - 1il - 6,在中枢神经系统,以及由此产生的或伴随神经胶质细胞的激活5]。因此细胞因子和神经胶质细胞在中枢神经系统被认为是强大的伤害感受调节器的控制并保持强大的潜力神经性疼痛(6]。
葛根素的主要组成部分葛根,有各种各样的药理学特点7]。葛根素已被证明能够有效地抑制促炎细胞因子的生产和/或神经胶质细胞的激活在各种疾病(8- - - - - -10]。我们推测,葛根素在鞘内也可以有效的治疗神经性疼痛通过抑制脊髓炎症;因此,本研究旨在探讨葛根素对神经性疼痛的影响使用两个最常用的啮齿动物疼痛模型(部分坐骨神经损伤和糖尿病)。除了疼痛,葛根素对促炎细胞因子的影响生产和胶质激活脊髓也检查了。
2。材料和方法
2.1。动物
男性Sprague-Dawley老鼠(220 - 250克)是购自上海实验动物中心,中国科学院(中国上海)。老鼠被安置在一个温控室(22 - 25°C)在塑料笼子(5动物/笼),12小时光/暗周期和免费的食物和水。动物实验都是厦门大学动物保健和使用委员会的批准。所有的努力都是尽量减少动物的痛苦和实验用动物的数量。
2.2。药物
鞘内注射,葛根素和fluorocitrate溶解在人工脑脊液(ACSF)。解决方案是在蒸馏水完成。葛根素fluorocitrate和所有其他试剂购自Sigma-Aldrich。
2.3。鞘内导管插入术
鞘内药物管理局,鞘内导管(11)是由推进PE-5导管尾8.5厘米的腰椎扩大切口进行池状的膜异氟烷麻醉面具下的老鼠。导管被外部化,并确保在切口部位的肌肉组织。老鼠显示任何神经功能障碍,如瘫痪或尿失禁导管插入后,实施了安乐死。证实了一个合适的导管的位置后,后肢麻痹10μL鞘内注射2%利多卡因(σ)导管插入后1天。只老鼠显示正常的梳理、移动和体重增加后导管被用于以下研究。
2.4。1型糖尿病神经性疼痛模型
糖尿病是由一个诱导大鼠腹腔内(i.p)注射链脲霉素(STZσ;60毫克/公斤,i.p。) [12]。与控制老鼠收到同等体积的汽车(0.01 M柠檬酸缓冲,pH值4.5)。血液收集通过尾静脉注射STZ后72 h测量血糖浓度。大鼠血糖水平在16.67 L更易被认为是糖尿病和包含在后续实验。葛根素(4、20、100海里),fluorocitrate(1纳米,作为一个积极的控制),或车辆管理鞘内每天一次连续7天开始注射STZ后20天。正确的后爪的机械撤出阈值测定注射STZ前(基线),药物治疗前(初始剂量)和60分钟后每个早上药品管理局(postdose)。
2.5。慢性收缩损伤(CCI)神经性疼痛模型
神经性疼痛的老鼠CCI模型是根据之前描述的方法(13]。成年男性Sprague-Dawley老鼠与水合氯醛麻醉(400毫克/公斤,i.p)。常见的坐骨神经是孤立在大腿中间水平并松散绑定使用铬肠道缝合(5)在四个地点相隔1毫米的间隔。虚假的手术,右坐骨神经暴露,但神经不结扎。所有的动物都被允许3天从手术中恢复过来。葛根素(4、20、100海里),fluorocitrate(1纳米)或车辆管理鞘内每天一次连续7天开始在术后4天。机械撤出阈值测定手术前(基线),药物治疗前(初始剂量)和60分钟后每个早上药品管理局(postdose)。
2.6。机械触诱发痛
机械触诱发痛测量使用商用电子·冯·弗雷仪(型号2390;IITC生命科学公司,林地,CA)如前所述14与一些细微的修改。老鼠放在一个树脂玻璃框在一个钢网层。压力被应用于中心的后爪·冯·弗雷灯丝在向上运动,直到脚撤军。退出阈值被自动记录。灯丝是55 g的最大强度。过程是重复每个日常会话,大约10分钟后,平均机械撤出阈值(MWT)计算。
2.7。测量NF -B DNA结合活性和炎性细胞因子
NF -B DNA结合活性的测量进行了使用商业NF -提供B转录因子结合分析工具包(开曼化工、CA、美国)根据制造商的建议的协议。分析是基于原则,只有NF -的活性形式B在示例包含NF -寡核苷酸结合B共识网站(5′-GGGACTTTCC-3′),固定在微量滴定板(15]。简而言之,腰段脊髓在裂解缓冲均质。核提取准备使用核提取工具包(开曼化学),和样品的核提取第一次孵化一夜之间在4°C井预镀dsDNA序列对应NF -一致的主题。NF -分析主题的共识应该结合人类和老鼠p65。5洗后,样品被孵化一夜之间在4°C主要抗体(兔多克隆,开曼群岛化学)p65 NF -亚基b主要抗体p65 NF -亚基B用于分析系统是只能当NF -B是激活并绑定到目标DNA。随后,样本孵化为60分钟,HRP-conjugated山羊anti-rabbit二级抗体(开曼化学),其次是比色检测在450 nm (Multiskan FC,热科学)。背景减法,后吸光度措施被称为标准曲线得到一系列重复包含测量井数量的人类重组p65(开曼化学),然后转换成数量的估计p65 /好吧,这是规范化p65估计除以总数量的蛋白质样品测量。肿瘤坏死因子-、il - 6和il - 1美国量化使用ELISA试剂盒(Abcam)根据制造商的指示。
2.8。免疫组织化学
老鼠与戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤,i.p。),灌注intracardially 300毫升的0.9%盐水其次是300毫升的4%多聚甲醛在0.1 M磷酸盐缓冲剂(铅、pH值7.2 - -7.4、4°C)。腰椎段被移除,后缀一夜之间在4°C,并保持在30%蔗糖0.1磷酸盐(PBS)在4°C。解剖组织安装在10月化合物和冷冻−20°C。横向(10脊髓部分μ米)准备使用低温恒温器(Microm HM550),放置在PBS。部分在0.01 PBS洗两次10分钟和阻塞1 h在海卫一5%的牛血清白蛋白和0.1%的x - 100。一夜之间,自由浮动的组织部分被孵化在4°C的摇臂兔多克隆antiastroglia marker-GFAP抗体(Abcam;1:1000)或兔多克隆antimicroglia marker-Iba-1抗体(Abcam;1:1000)。然后洗两次组织样本和PBS 8分钟每个孵化和FITC -或Cy3-conjugated anti-rabbit抗体(1:300年,杰克逊免疫研究实验室Inc .)在屏蔽解决方案没有特里同x - 100对1 h在黑暗中在室温下。控制染色是由省略主要抗体。荧光图像捕获与数码相机(奥林巴斯)。积极应用面积的百分比分析了背角使用Image-Pro软件(+ 6)版本。
2.9。免疫印迹
核和胞质蛋白提取核和胞质提取设备(开曼化学)。每个样本中的蛋白质含量测定采用BioRad蛋白质化验(BioRad实验室)根据制造商的协议。免疫印迹分析,25岁μ克蛋白质sds - page,转移到膜上,并探索与特定的抗体:NF -B p65(1: 5000年,Abcam);phospho-NF -B p65 (Ser 536, 1: 5000, Abcam);核纤层蛋白B(1: 2000年,Abcam);肌动蛋白(1:2000年,Abcam)。二次抗体HRP-conjugated二级抗体(圣克鲁斯生物技术,1:5000)是用于检测抗体的绑定。膜是孵化与清晰的西方ECL衬底(Bio-Rad实验室、CA、美国),和目标蛋白质被可视化和量化使用las - 3000发光图像分析仪(富士)。结果表示为一个相对比的目标蛋白质来引用。
2.10。统计分析
antimechanical疼痛效果进行评估后的增量MWT药物治疗和百分数表示的最大可能的效果(% MPE):迈普% = [(postdose阈值)−(初始剂量阈值)]/[(基线阈值)−(初始剂量阈值)×10016]。可以获得一个负值的%迈普如果MWT减少治疗后,就是加强allodynic应答。行为测试的数据、ELISA和免疫组织化学分析使用双向方差分析或单向方差分析其次是迷幻药以及进行事后分析。所有的数据提出了均值±SEM,和所有使用SPSS统计分析软件版本16.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。
3所示。结果
3.1。葛根素对正常大鼠疼痛的影响
葛根素(100海里、信息。,for 7 consecutive days) did not affect MWT (Figure1)。
3.2。葛根素对CCI, Diabetes-Induced神经性疼痛的影响
事后测试显示CCI和糖尿病显著下降(,而虚假的控制)MWT机械刺激(数字2(一个)和2 (c),,而虚假的控制),展示机械触诱发痛的发展持续整个观察期。与fluorocitrate,葛根素明显减少了机械触诱发痛CCI和糖尿病模型相比,车辆(数字2(一个)- - - - - -2 (d))。葛根素的迈普CCI, diabetes-induced神经性疼痛7天16.41%±5.66% 4海里,43.41%±2.75% 20 nM,和64.2%±3.71%在100 nM CCI和23.93%±5.49% 4海里,49.11%±4.23% 20 nM,糖尿病和62.07%±6.34%在100 nM,分别为(数字2 (b)和2 (d))。迈普的CCI fluorocitrate为69.9%±5.48%和76.24%±5.27%糖尿病,分别(数据2 (b)和2 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。脊髓小胶质细胞和星形神经胶质激活CCI和糖尿病大鼠
CCI组,小胶质细胞激活的染色标记Iba-1难以觉察的是在虚假的脊髓控制老鼠(图3(一个))。Iba-1免疫反应细胞的数量显著增加的背角侧CCI损伤手术后11天(数字3(一个)和3 (c),)。葛根素减少增强Iba-1免疫反应性脊髓(数字3(一个)和3 (c),葛根素20,100海里)。老鼠接受虚假的CCI手术低级GFAP染色,显示一个星形神经胶质激活标记,在脊髓(图3 (b))。GFAP免疫反应细胞的数量显著增加在背角侧CCI损伤手术后11天(数字3 (b)和3 (c),)。葛根素的增加降低GFAP免疫反应性脊髓造成的CCI(数字3 (b)和3 (c),葛根素20,100海里)。
(一)
(b)
(c)
至于糖尿病组,有一个类似的趋势。低水平和扩散Iba-1染色注意到大鼠的脊髓接收车辆注入(图4(一))。Iba-1免疫反应细胞的数量急剧增加的背角糖尿病感应(数据后27天4(一)和4 (c),)。葛根素减毒的增加Iba-1免疫反应性在糖尿病大鼠脊髓(数字4(一)和4 (c),葛根素20,100海里)。GFAP染色的脊髓几乎没有明显的老鼠接受车辆(图4 (b)),而显著增加的背角糖尿病感应(数据后27天4 (b)和4 (c),)。葛根素扭转了高架GFAP免疫反应性脊髓(数字4 (b)和4 (c),葛根素20,100海里)。
(一)
(b)
(c)
3.4。葛根素对肿瘤坏死因子的影响,il - 1,生产和NF - il - 6B激活CCI和糖尿病大鼠
CCI增加肿瘤坏死因子-,il - 1,生产和NF - il - 6B激活脊髓(与控制,图5)。葛根素减毒CCI-induced增加TNF -,il - 1和il - 6 (对il - 1100海里,il - 6在20和肿瘤坏死因子-在20和100 nM,分别地。,图5(一个))。高架NF -B DNA结合活动也与葛根素治疗显著降低(和在20和100 nM,分别地。,图5 (b))。此外,过度的NF -B p65 p65核易位与葛根素治疗显著降低,数据5 (c)和5 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
用相同的模式,TNF -,il - 1,生产和NF - il - 6B激活明显升高糖尿病大鼠的脊髓(与控制,图5)。葛根素在20和100 nM diabetes-induced海拔降低TNF -,il - 1和il - 6 (,图5(一个))和NF -B DNA结合活动(和在20和100 nM,分别地。,图5 (b))。此外,过度的NF -B p65 p65核易位与葛根素治疗显著抑制(,数据5 (c)和5 (d))。
4所示。讨论
神经性疼痛是由异常感觉处理引起的周围神经系统和/或中枢神经系统,目前缺乏有效的治疗。我们发现连续鞘内葛根素老鼠抑制机械和热CCI和糖尿病引起的疼痛的反应,这可能是通过抑制小胶质细胞的激活和星形神经胶质在脊髓背角,减少核转录因子的调节水平B (NF -B)和促炎细胞因子il - 6、il - 1和肿瘤坏死因子-在脊髓。
神经性疼痛的特点是自发性疼痛,增加对疼痛刺激响应性(痛觉过敏),和疼痛感知响应通常nonnoxious刺激(异常性疼痛)1]。越来越多的文献表明,增强脊髓神经免疫和神经炎症活动启动和维护后神经性疼痛的主要神经损伤(6,17]。具体来说,肿瘤坏死因子等促炎细胞因子-,il - 1强烈,il - 6参与的起始和发展神经损伤后神经性疼痛(18,19]。神经性疼痛通常是伴随着周边和中枢神经系统损伤。神经损伤导致疼痛介质的快速释放,如肿瘤坏死因子-,il - 1、il - 6和前列腺素,导致炎症反应,使中枢神经系统,促进疼痛处理(20.]。NF -B在这些过程起着至关重要的作用,是一个重要的中介的监管促炎细胞因子和炎症和免疫反应21]。许多炎症介质(如。肿瘤坏死因子-,il - 1,il - 6,不,和TGF-1)与神经性疼痛的调制可以激活NF -NF - B或可以被激活B (22]。抑制NF -的表达B和促炎因子(TNF -,il - 1和il - 6)可以减轻机械触诱发痛和热痛觉过敏在慢性收缩损伤(CCI)大鼠模型(23]。综上所述,NF -B是最重要的一个转录因子调控基因表达的促炎细胞因子24,25),涉及的起始和发展通过neuron-mediated神经性疼痛的中枢敏化方式和神经胶质cells-mediated促炎细胞因子的表达和疼痛介质(6,23,26]。
居民星形神经胶质和小胶质细胞在中枢神经系统中扮演着重要角色存在(27]。脊髓胶质激活已经证明在各种动物疼痛模型,包括神经性和炎性疼痛模型(28]。刺激后,脊髓神经胶质细胞增殖,进行形态学变化,增加细胞表面受体的表达,增加生产和释放促炎细胞因子(TNF -,il - 1和il - 6)和其他细胞毒性产品,进而提高疼痛传输在脊髓背角的28,29日]。此外,脊髓神经免疫和神经炎症激活前馈回路是一个积极的促炎细胞因子介导的神经胶质细胞,NF -B (28]。
在最近的研究中,对神经性疼痛两个经典模型:坐骨神经慢性收缩损伤模型(30.)和糖尿病神经病变模型(31日,32),使用。我们表明,fluorocitrate,特别是块胶质代谢活动通过抑制顺乌头酸酶的活性,发现克雷布斯循环酶只在神经胶质(33- - - - - -36),担任积极控制在这项研究中,减少了疼痛反应在两个模型作为先前的报道(12,37,38]。与先前的研究一致(5,23,27,39- - - - - -42),TNF的表达,il - 1il - 6, NF -B p65 (p-p65)大幅增加在脊髓,脊髓星形神经胶质和小胶质细胞被彻底激活CCI损伤和糖尿病模型。葛根素的影响存在剂量依赖的相关性和可比性fluorocitrate。葛根素并不影响正常大鼠痛阈,表明葛根素在神经性疼痛是特定的影响。事实上,葛根素抑制脊髓肿瘤坏死因子的过度,il - 1、il - 6和NF -B p65 (p-p65)和脊髓神经胶质激活与神经性疼痛的作用在我们的研究表明,葛根素对神经性疼痛涉及神经炎症过程的监管和神经免疫系统(图6)。
5。结论
总之,鞘内管理葛根素产生剂量依赖性antinociceptive CCI和diabetes-induced神经性疼痛的影响。一个可能的机制是抑制神经炎症过程和神经胶质激活。目前的研究还表明,葛根素小说是一种很有前途的发展平台代理治疗神经性疼痛。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金的资助,淑玉商量杨(30973912),Suhuan刘(81270901),和李Xuejun (81073113);关键项目福建省科技计划项目(2012 d60)和厦门创新项目优秀青年科学家Suhuan刘(2011 s0446);厦门科技局(厦门代谢性疾病系统生物学研究平台,3502 z20100001)。