文摘

CD73, ecto-5′核苷酸酶,是关键酶催化转化细胞外腺苷AMP,控制血管通透性和免疫抑制。前列腺酸性磷酸酶(PAP)拥有ecto-5′核苷酸酶/ AMPase活动和存在于白细胞。然而,它的作用与免疫系统是未知的。因此,我们分析了酶的活动和白细胞CD73亚型和PAP淘汰赛和生成CD73 /巴氏双基因敲除小鼠来阐明CD73和PAP免疫参数的贡献。酶化验证实重组人类PAP水解的能力(3H] AMP,虽然比人类CD73速度低得多。然而,5′核苷酸酶/ AMPase活动从人民行动党在脾细胞和淋巴细胞−−/老鼠往往低于野生型控制,建议PAP的潜在贡献,随着CD73,进入淋巴AMP代谢体外。单淘汰赛中有数量的下降 调节性T细胞在胸腺和CD73 /巴氏CD4的双重淘汰赛中表现出减少的百分比+细胞在脾脏,调节性T细胞在淋巴结、胸腺和CD4细胞+和CD8+细胞的血液。这些发现表明,人民行动党CD73一起协同作用,造成了免疫系统的平衡白细胞亚种群的数量,特别是调节性T细胞在淋巴结和胸腺。

1。介绍

平衡细胞外ATP、ADP、AMP和腺苷控制炎症微环境的状态,因为ATP是促炎而腺苷是高度抗炎。CD73 ectonucleotidase是关键酶purinergic脱去磷酸腺苷酸并生成腺苷信号级联。内皮细胞和白细胞表达CD73的某些子集。在内皮1- - - - - -4]CD73-dependent腺苷生产控制血管通透性明显证明了漏水的脉管系统和加重炎症CD73缺乏小鼠(5- - - - - -8]。调节性T细胞亚群)表达CD73通过腺苷和发挥他们的免疫抑制效果。另一方面,腺苷促进Treg扩张和触发器 腺苷受体效应T细胞诱导NF-kB-mediated抑制细胞因子的生产和其他抗炎作用[9,10]。

人类前列腺癌表达大量的人民行动党和血清中酶活性的水平几十年前已经连接到前列腺癌(11,近年来人民行动党已经成为前列腺癌免疫治疗的目标(12]。实际上,有两种亚型的前列腺酸性磷酸酶,分泌(sPAP)和1型跨膜(TMPAP)同种型,由相同的剪接变体编码基因(ACPP)[13]。PAP礼物ecto-5′核苷酸酶活动,和随后的研究已经明确证明了它广泛表达前列腺以外的包括白细胞(14],TMPAP同种型被发现在不同的组织,包括脾、胸腺和神经元13,15]。除了基质等βlysophosphatidic酸甘油磷酸盐,phosphoamino酸,行动党也可以催化AMP (16),事实上,PAP-mediated腺苷形成已被证明是一个重要的监管机构的疼痛抑制疼痛的神经传递(17- - - - - -19]。因此,关于PAP的研究集中在前列腺癌和神经系统的功能,与CD73不同,它在免疫系统中的作用仍然未知。在这项工作中,我们分析了核苷酸酶纯化hPAP活动相比,重组CD73体外,此外,体外用淋巴细胞悬浊液野生型隔绝,CD73 PAP基因敲除,和CD73 /巴氏双基因敲除小鼠,小鼠淋巴结以及人类扁桃体cryosections酶来源。此外,我们将展示PAP不足的后果,加上缺乏CD73主要淋巴器官的免疫细胞组成。我们所知,这是第一个示范的PAP免疫系统的作用。

2。材料和方法

2.1。老鼠

(肺动脉平均KO) (CD73 KO)是由目标基因中断(如前所述)(20.,21]。小鼠C57BL / 6 j小鼠backcrossed > 10代。dKO(肺动脉平均KO / CD73 KO)老鼠繁殖backcrossed生成的 和 老鼠和双突变小鼠被pcr基因分型的选择。他们进行了分析与C57BL / 6 j小鼠野生型控制。两到四个月大的老鼠。老鼠下了12:12光:在光暗周期和使用阶段。老鼠保持在一个特定的无菌阶段在图尔库大学中心动物实验室,遵守国际准则的护理和使用实验室动物和执行符合3 rs原则。所有的动物实验被芬兰动物伦理委员会批准,项目3791/04.10.03/2011许可证号码。

2.2。净化人类CD73和PAP

重组体人CD73从转染CHO细胞纯化。收成纯化使用固定化N6 - (6-amino) hexyl-AMP(耶,耶拿生物科学Gmbh德国)。绑定rhCD73筛选了使用0.25安培Tris-HCl 50毫米,0.1 M氯化钠,pH值7.4。净化后,缓冲区被改为20毫米Tris-HCl, pH值8.0,使用Amicon超30设备的最终浓度CD73测量使用特定内部ELISA。

hPAP是从人类净化精浆如前所述[22,23]。去磷酸化的酶比活度p-nitrophenylphosphate pH值4.8(50毫米柠檬酸钠缓冲)是5500年μ摩尔/分钟 毫克。

2.3。细胞隔离,流仪分析和免疫组织化学

单个细胞悬浮液从碎准备的外周淋巴结(汇集轴向和腹股沟节点),胸腺,脾脏通过机械取笑一个金属网状组织,冲洗股骨骨髓细胞。血液通过心脏穿刺收集。红细胞被低渗的溶菌作用从脾和血。白细胞表现型是使用马伯对CD4(647年克隆RM4-5, Alexa萤石共轭),CD8(克隆53 - 6.7,PerCP-Cy5.5共轭)和anti-B220(克隆RA3-6B2,太平洋蓝共轭),所有来自BD生物科学。调节性T细胞识别使用鼠标调节性T细胞染色工具包(eBioscience;CD4-FITC、CD25-allophycocyanin FoxP3-PE)。细胞使用LSRII使用BDFACS-Diva软件进行了分析。代表点印迹和直方图是用FlowJo软件。冻结部分胸腺也染色CD8, CD4和CD25。

2.4。薄层色谱(TLC)分析酶的活动

Purinergic从骨髓中分离出单个细胞的活动,脾脏,周围淋巴结使用[2,8 -确定3H] ATP, [2, 8 -3H] ADP(珀金埃尔默),[2 -3H] AMP(商生物学研究,通用电气医疗集团,Rushden,英国),和[2 -3H]腺苷(Amersham,小都,英国)如前所述[24]。简单地说,单一细胞悬浊液(5 - 10×104细胞)孵化为45 - 60分钟37°C 80年最后一卷μL rpmi - 1640中性pH值补充4更易与Lβ甘油磷酸盐和下面的示踪剂基质:500μ米(3H]三磷酸腺苷(ATP酶),500μ米(3H] ADP (ADPase), 300年μ米(3H] AMP (ecto-5′核苷酸酶),300年μ米(3H]腺苷(腺苷脱氨酶),400年μ米(3H] AMP + 600μ米γ-phosphate-donating ATP(腺苷酸激酶)。同样,AMP-hydrolyzing净化人类酶的活性是由孵化PAP (1μ0.5克蛋白质)或CD73 (ng)和40μ米(3H] AMP在没有和存在β甘油磷酸酯(4更易/ L)或选择性ecto-5′核苷酸酶/ CD73抑制剂α,β-methylene-ADP (AMPCP;5μ米)。混合整除被应用到Alugram G / UV254年表(Macherey-Nagel)3H-labeled基质及其代谢产物分离和TLC的量化闪烁β计数。

2.5。酶组织化学

的本地化ecto-5′核苷酸酶/ AMPase和其它核苷酸酶活动确定小鼠淋巴结也人扁桃体的cryosections通过使用一个修改的硝酸铅(Pb(没有3)2)方法,如前面描述的(25,26]。组织部分也与苏木精和伊红染色。幻灯片是安装Aquatex(默克公司)和图像获得使用一个奥林巴斯BX60显微镜。

2.6。统计分析

结果提出了均值±SEM,除非另有说明。统计分析是使用双面的学生的 以及和价值观的 被认为是重要的。

3所示。结果与讨论

3.1。CD73主导活动在人民行动党AMP水解在体外和体内

人民行动党已经证明贡献,以及CD73为主,细胞外腺苷酸转化为腺苷酸(16,17),我们首先比较纯化hPAP和纯化CD73的活动。测量hPAP活动显示有效的人工基质水解pNPP纯化酶(图1(一)),进一步证明其代谢的能力3H] AMP(图1 (b)),最高的催化活动被发现在酸性博士有趣的是,AMP-hydrolyzing能力hPAP ~ 400和~ 50倍少与纯化相比CD73化验时pH值7.2和5.5,分别,此外,它不是由选择性抑制ecto-5′核苷酸酶抑制剂AMPCP(图1)。值得注意,人民行动党也可能潜在的水解β甘油磷酸盐作为替代磷酸化底物(16]。但是,没有利率的差异(3H] AMP水解纯化hPAP或hCD73被发现在我们的TLC化验没有执行,4毫米的存在β甘油磷酸酯(数据没有显示)。

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图1
核苷酸酶活动的人类CD73净化人类行动党和重组。(a)的活动hPAP和hCD73测定spectrophotometrically在中性或酸性pH值通过使用人工基质p-nitrophenylphosphate (pNPP)。ND:无法探测。Radio-TLC分析核苷酸酶的活动也是由孵化纯化hPAP (b)和hCD73 (c)和40μ米(3H] AMP在不同pH值没有和5μM AMPCP表示。表示为酶的活动μ摩尔的pNPP或[3H] AMP水解一毫克每小时的酶蛋白。 。

进一步评估PAP的潜在作用在淋巴核苷酸体内平衡,我们测量的活动ecto-5′核苷酸酶(图2(一个))和其他相关purinergic酶、atp酶(图2 (b)),ADPase(图2 (c)),和腺苷酸激酶(图2 (d)),在淋巴细胞分离脾和骨髓的PAP基因敲除小鼠和野生型。无统计差异被发现在这些活动中,虽然有一个倾向减少ecto-5′核苷酸酶活动PAP基因敲除小鼠的脾脏。接下来,我们集中在从外周淋巴结淋巴细胞分离,排水外围和主网站对抗原的免疫应答通过传入淋巴管从外围,并分析了在野生型酶活动,CD73,人民行动党和CD73 /巴氏双淘汰赛。双淘汰赛中生成的这个工作没有任何明显的表型,当位于特定的无菌条件。

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图2
人民行动党缺陷小鼠没有显著改变细胞外核苷酸代谢。的活动ecto-5′核苷酸酶/ AMPase (a)、腺苷三磷酸酶(b), ADPase (c)和腺苷酸激酶(d)测定放射化学在骨髓和脾脏白细胞与野生型和PAP基因敲除小鼠(意味着±扫描电镜; )。

正如预期的那样,几乎没有AMPase活动检测淋巴细胞分离CD73基因敲除小鼠,从而证实淋巴ecto-5′核苷酸酶/ CD73的确代表了主要的酶负责细胞外腺苷酸转化为腺苷(图3(一个))。尽管如此,在脾脏的情况下研究(见图2(一个)),一个明确的趋势减弱(3H] AMP水解PAP−−/淋巴细胞(图3(一个))。这些数据表明,人民行动党可能的贡献,随着CD73,淋巴AMP新陈代谢,大概在某些协同时尚。符合我们的以前的观测(27),我们还发现显著增加atp酶和ADPase活动从CD73缺乏动物淋巴细胞,后者核苷酸酶活动剩余显著调节也CD73 / PAP基因敲除小鼠的两倍。在其他purine-converting酶无显著变化,腺苷脱氨酶和腺苷酸激酶,研究基因型(图中被检测到3)。

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图3
Purine-converting CD73和PAP缺陷小鼠的活动。的活动ecto-5′核苷酸酶/ AMPase (a)、腺苷三磷酸酶(b), ADPase (c)、腺苷酸激酶(d)和腺苷脱氨酶(e)薄层色谱测定从野生型小鼠淋巴结淋巴细胞( ),CD73单( )、巴氏单( ),CD73 /巴氏双淘汰赛( )。被表示为nanomoles酶的活动3每小时10 H-substrate代谢6细胞。 , 。
3.2。人民行动党和CD73不同表达在老鼠和人类淋巴组织和核苷酸代谢

淋巴组织中不同的核苷酸酶的分布是由铅沉淀原位评价方法。短时孵化小鼠淋巴结和人类的扁桃体cryosections核苷酸不同底物显示高AMPase特别是atp酶的存在活动(图4)。TMP衬底和增加就业的孵化时间还允许我们检测相对温和但清晰可见染色,这是特别局限于鼠标的被膜下的区域淋巴结,人类扁桃体的上皮细胞层,单个淋巴细胞分散在淋巴组织(图4)。引人注目的是,最激烈TMPase染色观察在酸性pH值,表明人民行动党酶的核苷酸酶的主要贡献的活动。最近引人注目,它提出了选择性的表达tissue-nonspecific碱性磷酸酶和另一个pH-dependent酶tartrate-resistant酸性磷酸酶(陷阱)相应的碱性和酸性腔隙的骨头可能函数作为特定的pH传感器的定向调节核苷酸受体介导破骨细胞功能和骨吸收(28]。也提到相关的,在某些情况下,如缺血、细胞内的pH值下降~ 6.4,伴随着显著抑制5′核苷酸酶活性和嘌呤心中内稳态的变化(29日]。可能合理推测,不同定位的CD73和PAP及其逆pH值依赖提供有效调整监管方式的嘌呤在淋巴组织内稳态炎症、缺氧等(patho)生理状态。还需要进一步的研究来验证这一假设。


图4
淋巴结分布核苷酸酶活动的老鼠和人类的扁桃体。是由孵化酶组织化学染色组织切片在不同pH值的表示没有(空白)和不同的核苷酸基板。组织部分也与苏木精和伊红染色())。胶囊由虚线表示,箭头指向一些积极分散细胞,GC:生发中心,SS:被膜下的鼻窦,和E:上皮。原来放大:×100。酒吧规模:200μm。
3.3。人民行动党对淋巴细胞数量不足只有轻微影响

由于没有可靠的抗体分析巴氏在鼠标的蛋白质水平表达,我们在挖掘ImmGen财团数据银行,其中包含详细的分析不同的小鼠白细胞和内皮细胞的人群对他们的基因表达谱。人民行动党表示主要的子集γδ在胸腺T细胞和不变的自然杀伤T细胞和CD4和CD8 + T细胞在二级淋巴器官比CD73虽然一般在较低水平。一个简化的比较CD73表达式如表所示1。行动党缺乏独自没有改变B细胞,CD8或小鼠CD4数量(数字5(一个)- - - - - -5 (d))。唯一的统计上的显著差异是CD8+细胞在血液里,尽管在这个增加是最有可能的生物学意义。时也同样适用的血液和骨髓淋巴细胞的数量进行了分析八个月大的老鼠PAP(数据没有显示)。我们选择这个时间点PAP基因敲除小鼠发展nonmetastatic在老年前列腺癌(30.]。淘汰赛前列腺在这个年纪包含比野生型前列腺B细胞( %与 %, )。还唾液腺含有更多的免疫细胞在这些雄性老鼠,当他们年轻,但消失与衰老的区别(31日]。几乎nonexisting改变的主要免疫细胞亚群缺乏PAP表明PAP似乎并没有任何标记在免疫系统中的作用或其没有被CD73补偿。同样,CD73基因敲除小鼠微小变化(数据5(一个)- - - - - -5 (d))。更少的B细胞和检测到轻微的调节性T细胞数量增加外周淋巴结。

表1
表达谱CD73和PAP的mRNA水平不同的淋巴组织。
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图5
协同效应的人民行动党和CD73缺乏白细胞的亚种。血液中淋巴细胞表型(a)、脾(b),淋巴结(c)、胸腺(d)野生型小鼠( ),CD73单( )、巴氏单( ),CD73 /巴氏双淘汰赛( )(胸腺: 使用流式细胞仪对所有基因型)进行了分析。(e)调节性T细胞在淋巴结。的例子,调节性T细胞的流式细胞仪分析野生型和CD73 /巴氏KO小鼠显示。在左边的面板显示了控制策略和中间板CD4的百分比+/ CD25+细胞。强度的CD4 FoxP3染色法+/ CD25+细胞在右边面板显示为直方图。对数荧光在 设在和细胞的数量 设在。(f)相结合的调节性T细胞分析结果显示为不同的器官。 , , 措施。
3.4。CD73和PAP调节血液中CD4和CD8细胞和淋巴结的调节性T细胞数量和胸腺

在单淘汰赛,调节性T细胞的数量明显减少在胸腺和双淘汰赛PLN和胸腺(数字5 (e)和5 (f))。仍然FoxP3的表达强度,调节性T细胞的标记,是在同一水平上双淘汰赛和野生型小鼠(图5 (e))。因此,我们可以得出结论,在胸腺CD73和PAP贡献独自调节性T细胞的数量,但没有需要在PLN产生影响。

尽管腺苷由CD73调节性T细胞传播生成更多的调节性T细胞通过 腺苷受体(32),调节性T细胞的数量很低,主要的腺苷可能来自外周淋巴结基质细胞,如内皮细胞。基质细胞并没有包含在我们的酶分析显示几乎完全没有ecto-5′核苷酸酶活动孤立CD73 KO小鼠淋巴结淋巴细胞。

我们发现正常水平的调节性T细胞在胸腺器官以外,调节性T细胞的数量减少,在淋巴结,稍微调节性T细胞数量的增加,在协议的观察Ehrentraut et al。33),没有发现调节性T细胞的数量差异野生型和CD73缺陷小鼠肺。这表明表达CD73总体不需要一代的调节性T细胞,尽管它是这些细胞的免疫抑制功能的基础9,33]。

双基因敲除小鼠也有显著降低CD8的百分比+(减少32%, )和CD4+细胞(减少51%, )在他们的血液和CD4细胞的数量减少+细胞在脾脏(数字5(一个)和5 (b))进一步表明这两个酶的协同作用在控制淋巴细胞池。

胸腺是中央机关在T细胞的发展,我们也分析了胸腺的形态和T细胞亚型CD73,人民行动党,双淘汰赛和比较他们的野生型老鼠。双基因敲除小鼠胸腺正常形态(图6(一))和组织位置不同细胞类型的基因型之间的可比性。CD4双染色法及CD25的例子,如图所示6 (b)。

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图6
胸腺CD73 /巴氏双淘汰赛中显示类似的形态和野生型小鼠细胞分布。野生型(a)苏木精和伊红染色法和CD73 /巴氏淘汰赛胸腺。野生型(b)免疫荧光染色法及CD73 /巴氏淘汰赛胸腺使用anti-CD4(绿色)和anti-CD25(红色)抗体。

淋巴结、脾和血代表结构上和功能上不同的环境对白细胞提供独特的蜂窝网络和细胞外环境。这也可以实现PAP的表达差异和CD73(表1)。因此,我们的研究结果显示双淘汰赛瀑特异性淋巴细胞亚群的变化是可以理解的,强调这一事实,例如,在淋巴结和脾脏促进调节性T细胞的活化和分化的因素至少有部分显著不同,在脾不受CD73行动党,但这两种酶是呈现在这些器官。调节性T细胞在胸腺生产,从那里他们分散到全身各个器官的hematolymphoid外围系统或分化。调节性T细胞是异构的关于他们的表型、功能,和表观遗传状态和homing-associated分子调节性T细胞变化(34,35]。这使他们优先迁移到不同的器官,如周围淋巴结,内脏相关淋巴组织,脾,或nonlymphoid器官取决于homing-receptors在其表面的模式35]。例如,CXCL12高度表达的骨髓和脾红髓吸引调节性T细胞,而CCL25新兵小肠。因此,调节性T细胞在表型上不同的器官有独特的特点。

4所示。结论

生成和维护不同白细胞亚种群之间的平衡是免疫系统的正常运行的一个关键元素在健康和疾病。抗炎产生的腺苷AMPase CD73中央在免疫抑制活性。尽管腺苷传播调节性T细胞很重要,缺乏CD73很少影响调节性T细胞的数量。这是第一个报告展示PAP的分布在不同的老鼠和人类淋巴组织和它的贡献,结合CD73,淋巴嘌呤体内平衡和平衡各种器官中白细胞的细胞亚群。然而,就没有人民行动党在胸腺外,没有任何显著的影响,但结合CD73的不足,后果变得重要。进一步的工作是需要阐明的确切机制作用方式的PAP免疫系统。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Gennady博士g . Yegutkin佳兆业集团奥维宁的,受到和玛丽Karikoski造成同样的纸。

确认

这项工作是由芬兰癌症基金会的资助,Sigrid Juselius基金会,芬兰科学院,下午和Inkeri Suominen基础。作者感谢Joona Valtonen和诺玛Jappinen帮助染色。他们感谢博士海基Irjala提供人类扁桃体的样本和安妮Sovikoski-Georgieva秘书的帮助。这项工作从ImmGen财团组装的数据中获益。