文摘

绝大多数的骨骼肌成肌细胞移植到死后第一周内注入。炎症反应的肌肉细胞转移研究同种异体而不是自体模式。本研究的目的是评估自体肌原性的细胞免疫反应和评估其动态后第一周内注入。肌源性细胞或媒介就注入完好无损在自体骨骼肌模型。组织样本收集1、3、7天之后的程序。我们的分析揭示了峰值增加所有评价细胞因子的基因表达(Il-1α,il - 1βil - 6, Tgf -β,和Tnf-α在第一天)。的mRNA水平分析细胞因子归一化在随后的时间点。的增加伊尔-β实验进一步证实了基因表达的蛋白质水平。分析组织部分显示快速渗透注入细胞集群的中性粒细胞和巨噬细胞。炎性浸润在第七天几乎完全解决。存活细胞能够参与的肌肉再生的过程。结果表明,自体移植物提出古典早期肌源性细胞诱导免疫反应在注射部位出现的可能导致细胞移植消除。

1。介绍

成人肌肉组织是高度暴露在内部和外部因素的影响在整个寿命,因此需要有效地再生的能力。主要负责骨骼肌组织的细胞修复能力被称为卫星细胞。卫星细胞的后代的想法提供肌母细胞到不正常的肌肉的方法治疗于1978年首次提出了帕特里奇和他的同事们(1]。此后,成肌细胞转移疗法(MTT)已被广泛研究的主题。起初,成肌细胞被认为是一个非常有前途的替代治疗肌营养不良(MDs);然而很明显,这个人口不能嫁接后骨骼肌系统交付(2]。穷人迁徙能力阻碍的潜在使用myoblast-based治疗杜氏MD和缩小可能的应用的障碍更多的焦点人物。然而,成肌细胞转移仍被视为未来可能的替代治疗在许多条件。其中包括括约肌功能障碍(尿道、肛门、食道癌和幽门),经过神经移植肌肉萎缩,直肠阴道的瘘管,当地因伤肌肉损失,某些类型的肌营养不良(如oculopharyngeal或facioscapulohumeral MDs)。不幸的是,成肌细胞转移过程与另一个至关重要的尚未解决的问题,穷人供者细胞的存活率。这是证明,绝大多数的移植后移植物丢失前3天内。大量消除注射肌母细胞被粉丝和他的同事们在1996年(3),随后证实了其他研究。观察这一现象无论类型的动物模型(鼠或猪),类型的目标区域(骨骼肌、心肌、或尿道括约肌),主机肌肉状态(完整或受伤),或状态的宿主生物体(免疫缺陷或免疫活性的)(4- - - - - -9]。此外,霍尔泽和他的同事证明了肌母细胞是自体移植后甚至消除7]。几个潜在的原因提出了转移后快速肌原性的细胞死亡。他们包括注射部位的炎症反应(5),缺血(10,11),组织缺氧,12女性],[13]。成肌细胞注射后的免疫反应研究集中在同种异体模型(5,14- - - - - -17但不像这种类型的自体移植后被认为是nonimmunogenic转移。然而,以前的研究表明,氧化应激可能发挥作用在自体移植后消除肌原性的细胞(18]。因此,我们假设自体肌原性的细胞也触发转移早期免疫反应与氧化破裂。作为自体移植被认为是最安全的选项在上面列出所有的临床应用中,这似乎是最重要的评估这种嫁接的局部组织反应。因此,本研究的目的是审查的存在和动力学与先天免疫相关细胞因子表达和细胞反应后第一周内自体麻省理工。

2。材料和方法

2.1。动物

所有实验进行三个刘易斯老鼠(in-bred应变)。动物被安置和免费的食物和水是维持在一个恒定的温度。动物住房和实验程序的本地动物福利伦理委员会批准的华沙医科大学。

2.2。肌源性细胞的分离和培养(mdc)

骨骼肌细胞隔离样品(约0.05克)获得进行股薄肌政府在全身麻醉诱导的甲苯噻嗪(10毫克/公斤;Leciva,布拉格,捷克共和国),氯胺酮(40毫克/公斤;Spofa,布拉格,捷克共和国)和布托啡诺(1毫克/公斤;道奇动物卫生堡道奇堡美国IA)。组织抽样不损害大鼠手术后移动。隔离的肌源性细胞进行描述Burdzińska et al。19]。细胞悬浮在标准生长培养基(通用汽车)、DMEM补充10% (v / v)胎牛血清和抗生素,抗霉菌的混合物(所有组件从英杰公司购买,卡尔斯巴德、钙、美国)。为了减少成纤维细胞数量在文化、媒介包含不依从细胞转移到另一个盘细胞播种后24 h (preplating)。第一个变化的培养基进行隔离后72 h。融合的文化达到70%时,细胞被胰蛋白酶化收获(0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA;美国Invitrogen-Gibco卡尔斯巴德)然后在新菜5×10的密度³/厘米²。大多数的细胞培养移植而人口分别被播种的一部分执行在体外描述,肌间线蛋白表达和分化潜力分析。

2.3。Immunocytofluorescence和分化潜能

识别孤立的细胞,mdc肌间线蛋白的存在,分析了肌原性的细胞标记。第一段后细胞培养在Lab-Tek 4-chamber幻灯片w /封面(Permanox滑无菌,Nalge Nunc国际内伯威尔市,,美国),直到他们达到80%融合;然后他们被固定在4% (w / v)多聚甲醛在室温下15分钟和permeabilized冷甲醇70% 20分钟−20°C。样本处理堵塞的解决方案(1%牛血清白蛋白/ 5%正常驴血清磷酸盐)在RT为30分钟,然后用鼠标anti-desmin探测(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国,1:50 v / v, 90分钟,RT)。之后,细胞被洗和探索二次抗体[Alexa-Fluor 594驴anti-mouse(杰克逊ImmunoResearch欧洲,萨福克郡,英国),1:100 v / v, 60分钟,RT)。使用荧光显微镜通过奥林巴斯IX51细胞被可视化。

验证肌原性的潜力,另一个子集的孤立的细胞诱导分化培养与2%的马血清DMEM补充(HS) 3天。细胞分化为肌间线蛋白应用如上所述。融合指数确定比原子核的肌管核的总数相同的字段计算从至少10字段的视图/动物和被表示为一个百分比(0%对100%)。细胞内脂滴在争取民主变革运动人口的存在被证实与油红O染色(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.4。细胞悬液或车辆注入

注塑过程的老鼠与甲苯噻嗪镇静/氯胺酮混合物。领域的皮肤注入剃,消毒。在移植的动物、mdc悬浮在200年μL DMEM以自体的方式管理到腓肠肌肌。细胞悬液是通过22 G针在单个丸直接完整的肌肉没有任何皮肤切口。虚假的动物被以同样的方式对待但收到200μL DMEM车辆。同时,额外的100μL细胞悬浊液的指示微生物(细菌和酵母)测试。注入的细胞被标记(动物基因和蛋白表达分析指定)或标记荧光膜连接器PKH26(指定红色染料,动物免疫组织化学染色)还是(DiIC18 (5) - ds (1 1-Dioctadecyl-3 3、3、3-tetramethylindodicarbocyanine-5 5-disulfonic酸)在动物身上在活的有机体内成像)。准备最后的悬架之前,细胞在DMEM完全去除血清洗两次。

2.5。组织收集

该地区周围组织细胞或DMEM政府收获在第一天(24小时),移植后第三天、第七天。治疗组中,类似的肌肉碎片收集。组织样本立即snap-frozen液氮并存储在−80°C到分析。

2.6。RNA隔离、逆转录和实时PCR分析

指定的动物的基因和蛋白质表达分析移植等量(1×10⁶)的细胞(在每个时间点,6)。MDCs这些实验的标记,以避免额外的操作,这总是与获得性免疫原性的风险增加有关。未经处理的()和虚假的经营组织(在每个时间点,6)作为控制。组织样本收集天1、3和7在TissueLyser均质机均质(试剂盒、GmbH,希尔登,德国)在25赫兹的频率为5分钟。使用RNeasy纤维组织总RNA是孤立的迷你包(试剂盒、GmbH是一家现代化的、希尔登,德国)。RNA浓度使用NanoDrop量化由分光光度计在260海里(nd - 1000分光光度计,NanoDrop Technologies, Inc .)。逆转录的mRNA为cDNA执行使用上标III(美国卡尔斯巴德表达载体,Gibco)根据制造商的指示。实时PCR进行ABI棱镜7500序列检测器(美国应用生物系统公司,培养)。特定的引物和探针组从应用生物系统公司购买:Il-1α(Rn0055700_m1),il - 1β(Rn00580432_m1),il - 6(Rn00561420_m1),Tgf -β1(Rn00572010_m1),Tnf-α(Rn01525859_m1)。Gapdh基因(4352338 e)用于规范化。值表示相对参考样本(校准器):不治疗肌肉。Ct(阈值周期),内部控制的目标基因和Ct对每个样品测定。相关基因表达进行了计算方法。

2.7。ELISA

的评价Il-1α和il - 1β集中在组织匀浆是由ELISA。肌肉样本均质与磷酸盐缓冲和蛋白酶抑制剂(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)。然后在000 rpm探针被离心澄清5分钟PMSF和加法。总蛋白浓度测定用NanoDrop (nd - 1000分光光度计)。在组织细胞因子浓度溶解产物测定使用商业可用ELISA试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)。结果作为一个绝对比:白介素浓度/蛋白质浓度(×10⁻⁹)。

2.8。组织学和免疫组织化学

可视化注入细胞在宿主组织细胞被贴上红色荧光膜链接器,5μPKH26 (在每个时间点,2)。侧腓肠肌肌肉在这组注射车辆。组织学和免疫组织化学染色进行冻结部分(10μ米厚的)准备使用低温恒温器Microm HM 525 (Microm,老总孔翰宁,德国)。有些部分与苏木精和伊红染色。使用初级抗体抗原进行免疫组织化学染色:CD43 (1: 20 v / v)和CD68 (1: 20 v / v) (AbD Serotec, Kidlington,英国)。样本与冷丙酮固定。非特异性结合位点被封锁5%正常驴血清在PBS。组织部分是孵化主要抗体1 h rt,之后,细胞被洗和探索二次抗体[Alexa-Fluor 488驴anti-mouse](杰克逊ImmunoResearch欧洲,萨福克郡,英国1:100 v / v)为1 h rt,最后,幻灯片与DAPI清洗和VECTASHIELD覆盖安装介质(英国彼得伯勒向量实验室有限公司)。样品进行了评估与Eclipse Ni-U显微镜(尼康、东京、日本)。

2.9。在活的有机体内成像

光学成像的平均的mdc如上所述注射()。这些细胞被标记移植前为7.5μ米,一层膜链接器Ex-max 650海里/ Em-max 670海里(AAT Bioquest,桑尼维尔CA)。成像的区域仔细刮和邻近的尸体被黑暗覆盖着结构的一部分,以避免hair-derived自体荧光。在活的有机体内使用新光谱成像进行了系统(马卡尺生命科学、数据)。自动光谱分离算法做了染料对食物和自发荧光背景是用于可视化transplant-specific荧光信号,激发波长为640 nm和六个发射波长(680、700、720、740、760和780海里)。成像数据分析使用生活图像4.4软件(卡钳)。

2.10。统计分析

rt - pcr结果提出了基因表达的褶皱变化与校准器,而ELISA的数据被表示为手段(SD)。结果分析成对VEH VEH与集团和MDC(未经处理的控制与组织在特定的时间点)使用非参数UMann-Whitney测试。的值被认为是具有统计学意义。rt - pcr分析组之间的差异的重要性是衡量ΔCt值。rt - pcr和ELISA分析都是在重复。

3所示。结果

3.1。孤立的肌源性人口是异构的,但主要是肌母细胞

后第一天内隔离程序,单核细胞,克隆形成纺锤形细胞(图都可以看到1(一))。肌间线蛋白表达细胞的平均比例在第一段后获得MDCs人口达77%(图1 (b))。孤立MDCs培养在DMEM / 2%商品分化成肌管(图1 (c)),这证实了他们的肌原性的潜力。均值融合指数为35%。然而,一些细胞在文化自发积累脂质、可视化的油红O染色(图1 (d))。这些细胞可能是纤维- /脂肪形成的祖细胞的后代居住在肌肉组织。

3.2。管理车辆本身引发的重大UpregulationIl-1α,il - 6,Tgf -β基因表达

基因表达的分析显示,200针插入和管理μL汽车到肌肉的重要upregulation引起的Il-1α,il - 6,Tgf -β(7倍、2.3倍和2.7倍,分别地。)在第一天注射部位比较未经处理的控制。的重要高度il - 6VEH组比较,CTRL组基因表达在维持在第三天。其他评价细胞因子的表达规范化在第三天。注射后一周VEH和CTRL组之间没有统计学差异(图2)。

3.3。肌源性细胞的移植造成重大Upregulation mRNA水平Il-α和il - 1β基因和增加il - 1β集中在第一天后注入VEH组相比

细胞悬浊液针对移植是免费的从微生物污染。车辆本身的注入导致细胞因子基因表达显著差异,从移植样本统计分析获得的结果相比,虚假的控制(VEH组)。管理的自体的细胞导致的基因表达显著增加Il-1α和il - 1β(图2)。海拔是5.5倍和5.2倍,分别比较VEH集团和36-fold和统计,分别比较治疗组。的表达il - 6,Tnf-α,Tgf -β显示类似的模式(海拔在第一天峰);然而这些细胞因子之间的差异没有统计学上相关。基因表达(将发生重大变革Il-1α和il - 1β)验证了评估类似样品的蛋白质水平。在的情况下Il-1α、蛋白质浓度没有证实upregulation基因表达;组之间的差异没有统计学意义(图3(一个))。相比之下,il - 1β蛋白质水平严格转录发生了变化。MDCs政府诱导促炎的重要增长4倍il - 1β站点的平均浓度注射移植后24小时相比,虚假的控制(图3 (b))。同时,车辆注入本身也造成显著的地方海拔il - 1β水平相比,未经处理的控制(图3 (b))。

3.4。没有显著差异表达细胞因子在MDC自体移植后7天

评估基因的动态表达清楚地表明upregulation自体MDCs转移后的促炎细胞因子是急性和瞬态。在第三天Il-1α表达仍显著升高样本MDC组相比,虚假的组。在第七天没有显著差异的mRNA水平研究细胞因子后观察移植后或车辆注入(图2)。

3.5。注射细胞的分布之间的不同时间点进行了分析

确定注射细胞注射部位在某些动物(前)MDCs标有红色荧光染料PKH26移植。脾组织样本的分析显示大,不同的集群PKH26染色细胞之间的肌肉纤维(数字4和5)。没有观察到红色荧光假肢体操作(数据没有显示)。移植的细胞形成密集的集群在第一天和第三天但不是注射后一个星期后。PKH26阳性细胞在组织样本收集的第七天相当罕见,在注射部位扩散。

3.6。主机派生培养MDCs诱发炎症细胞的快速渗透

评估的存在炎症细胞在注射部位的组织部分沾)(图6)。这允许准备移植细胞集群的识别收集的样本中,1和3天后注入。大量的炎症细胞,尤其是多形核粒细胞,可以观察到,在第一天的集群。在注射后标本获得7天,炎症细胞没有观察到任何相关数量。描述这个渗透更好,组织部分应用CD68、巨噬细胞标记,和CD43 leukosialin,出现在多数白细胞,而不是巨噬细胞。大量的巨噬细胞和白细胞可以被直接移植MDCs附近集群注射后24小时。在这个时间点周围的大多数CD68表达细胞集群,只有几个巨噬细胞注射细胞(图之间的可以观察到的4(一))。在第三天细胞表达CD68完全覆盖的面积PKH26集群(图4 (b))。一周后注入巨噬细胞的数量大幅减少。在许多情况下,与PKH26红色荧光(CD68与数字4 (b)和4 (c))。CD43阳性细胞的存在是最著名的在第一天(图5(一个))。

3.7。肌源性细胞是自体移植后注射部位淘汰

在活的有机体内荧光成像技术显示的明显减少DiD-derived信号在所有分析动物在随后的时间点()。代表鼠被展示在图的图像7。车辆注入没有诱导荧光分析波长表示信号检测的特异性的移植肢体。这些结果证实了可怜的肌内注射后细胞存活,但这种现象是首次证明了在同一动物自体移植后在随后的时间点。

3.8。幸存MDCs能够融合与主机的肌肉纤维

标记的细胞体外允许识别他们的命运在活的有机体内。在第七天PKH26衍生荧光观察单核细胞位于肌肉纤维和肌肉纤维(数字8(一个)和8 (b))此外,PKH26阳性细胞可以识别在肌肉纤维部分(数据的中心位置8 (c)和8 (d))表明移植细胞拥有参与再生过程的能力。

4所示。讨论

穷人的生存后成肌细胞移植是众所周知的问题,限制了MTT引入诊所。注射肌母细胞是巨大的和快速的消除。在同种异体的模型中,肌原性的细胞移植后24小时只有20%或更少的初始细胞数量能被探测到的注入。这个数量是进一步降低1 - 5%在天转移(后3 - 55,15,16]。自体移植的方法并不能解决这个问题。移植物丢失的过程似乎慢;霍尔泽et al。7]24小时后发现注入人口的60%,但存活细胞的比例下降到10%,第三天(7]。在此,我们确认有限的自体肌内移植后细胞存活率在活的有机体内成像相同的人在随后的时间点。当前的理解这样的移植失败是不清楚。我们以前公布的结果表明氧化应激的作用(可能由免疫细胞吞噬)在细胞移植自体后消除传输(18]。因此提出了本实验的目的是描述急性局部炎症反应的动力学响应MDC自体移植。

在我们的实验中我们孤立的细胞利用preplate (pp)瞿所描述的技术等。20.]。减少成纤维细胞的数量在文化我们使用的一个子集之间的塑料表面细胞坚持24 h和72 h后播种。根据preplating瞿提出的时间表等。20.)我们使用混合人口pp3-pp4细胞主要由卫星细胞的后代,成肌细胞。事实上,我们的研究结果证实,大多数孤立的细胞肌间线蛋白表达。平均融合指数3天后诱导肌原性的分化达到35%。相比之下,C2C12细胞的平均融合指数线(老鼠卫星细胞)被显示约50% (21]。因此,作为获得人口仍然包含一些nonmyogenic细胞如成纤维细胞或fibroadipogenic祖细胞,我们称之为肌源性细胞而不是成肌细胞。

移植后24小时采集的样本分析表明,自体MDCs诱导显著upregulationIl-1α和il - 1β基因表达载体治疗组相比(图2)。的表达显著增加il - 1,特别是il - 1β同种型,在应对肌肉细胞移植,以前曾有报道称在几个不同的模型:同种异体的成肌细胞转移到完整的心肌(5),同种异体间充质干细胞(msc)转移到心肌梗塞(22),同源的msc的转移到完整的骨骼肌(23]。在目前的研究中我们首次展示,对类似的反应il - 1β表达式是自体MDCs转让后也观察到。此外,我们在蛋白质水平(图证实了这一发现3)。的评价il - 1β表达动态在第一周后程序显示的提振il - 1β急性和瞬态,表达在第三天明显低于第一天和它不是明显高于对比VEH集团类似的时间点。铃木et al。5]也评价细胞因子表达在两个时间点的动态转移后(24小时和3天)在同种异体成肌细胞移植到完整的心肌和报道相同模式的变化,峰值在差别upregulation第一天,对这些基因的第三天。作为il - 1β是关键促炎细胞因子与免疫细胞吞噬细胞的活性,这些数据表明,肝癌和后早期炎症反应的动态自动和同种异体移植相似。值得注意的是,在对il - 1显示是重要在同种异体移植细胞的生存模式。这是表明阻断il - 1的行动导致增加移植疗效[14,20.]。我们的数据表明,自体移植可以获得同样的效果。

在目前的研究中我们也反应MDCs早期炎性浸润转移的特征。这部分实验细胞被贴上红膜链接器,PKH26,移植前。这种方法所描述的标签被选中,因为它是在制造商的规范和nonimmunogenic发表的报告(24]。因此,似乎适用于免疫反应的研究。这个细胞跟踪器的缺点是大量稀释在细胞分裂过程中,分析了在我们最近发表的报告25]。然而在短期实验中我们没有预料密集的细胞增殖膜链接器满足我们的需要。争取民主变革运动的组织样本收集组1和3在天移植细胞清晰可见。在这两个时间点他们形成致密,划定细胞集群(数字4(一)和4 (b))。非常相似的外表观察同种异体移植后肌母细胞或肌源性干细胞在注射后第二天20.]。在我们的实验中,移植细胞的分布改变标本收集在第七天;的细胞更加扩散整个网站注入(图4 (c))。PKH26阳性细胞的数量在这个时间点比较低明显第一天或3天。在第七天PKH26衍生荧光观察单核细胞位于肌肉纤维和肌肉纤维(图8(一个))。此外,PKH26阳性细胞可以识别在肌肉纤维部分(图的中心位置8 (b)),这表明,移植细胞存活在注射部位参与再生过程。这一发现与先前的报道是一致的(7,20.,26]。

结果表明有限的持久性注入细胞在第七天经semiqualitative贪污生存分析使用在活的有机体内荧光成像技术(FLI)。虽然这种方法有严重的局限性,因为相当多的动物组织的自体荧光,之前证明FLI的成肌细胞生存率分析肌内注射能有效(8]。在我们的研究中,我们利用光谱分离算法提供的生活图像软件来解决这个问题。使用膜连接器在活的有机体内图像创建一个额外的问题;这些染料可以被吞噬细胞吸收,因此阻碍的解释结果。然而,在我们的实验中DiD-derived信号的辐射效率显著降低在随后的时间点;因此我们可以得出结论,从注射部位细胞确实是消除。

确认存在免疫反应注射自体mdc组织部分进行分析以确定炎症细胞。基本)染色显示集群的移植细胞渗透在第一天与多形核粒细胞(图6(一))。在第三天,中性粒细胞在他走时彩色部分的存在不是那么明显;最多的细胞在移植集群在这个时间点大,单核这可能表明巨噬细胞。更精确地识别渗透的部分应用了CD43-an抗原存在于多数白细胞,而不是巨噬细胞。典型的事件序列的分析显示早期的先天免疫反应,快速渗透的目标区域与中性粒细胞(在第一个24小时内)和延迟出现的巨噬细胞在第三天最大强度。在第七天,炎症反应是几乎完全解决与细胞因子基因表达分析结果是一致的。因此,我们的研究结果首次表明,自体移植肌源性细胞诱导早期古典在注射部位出现的免疫反应。它可以声称,巨噬细胞在注射部位的存在有利于移植疗效。它曾表明,巨噬细胞增强,甚至需要肌肉再生(27,28]。此外,它表明coinjection成肌细胞和巨噬细胞改善生存、增殖和迁移的移植肌肉前体细胞(9,29日]。然而,结果得到了关于coinjection后同种异体或异种的注入免疫缺陷。因此,很难预测如果主机派生巨噬细胞也可以提高移植细胞存活率。

最可能的解释有两种先天反应的外观。首先,炎症细胞被激活,因为注射细胞在体外操作成为免疫原性。第二,注入细胞死亡由于其他原因如缺血,缺氧,或女性和吞噬细胞渗透移植物清理死细胞而不是消除可行的。验证的机制主要是评估的关键重要性自体肝癌疗效改善未来的策略。我们先前公布的数据表明,细胞抵抗氧化应激增加自体肌内移植后更好地生存。类似的研究结果提出了由Urish et al。26在同种异体移植模型。活性氧的生产与白细胞活动有关,因此抗氧化应激的重要性支持假设炎症的原因而不是结果是移植细胞死亡。成肌细胞的炎症消除后自体政府所扮演的角色也显示了Ito et al。30.]。作者表明,强劲的系统性免疫抑制移植的疗效改善nondystrophic狗。另一方面一些报告表明中性粒细胞和巨噬细胞不负责的早期死亡供体成肌细胞即使在同种异体模型(15,16),从而支持理论,由于其他原因和炎症细胞死亡只是二级这种死亡的后果。两个潜在的机制并不优越的,可能只有复杂的保护方法能有效防止成肌细胞移植后死亡。

最后,提出数据表明,自体移植细胞内MDCs诱发早期古典在注射部位出现的免疫反应。这些结果,当考虑同此前发布的报道,表明天生的炎症反应可以促进有限生存理论上nonimmunogenic自体的细胞移植。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

Radosław Zagozdzon的工作是由欧盟第七框架计划的资助:fp7 regpot - 2012之下ct2012 - 316254堡垒。