文摘

利什曼虫amazonensis(利什曼虫)展品与宿主的相互作用特性。因为无鞭毛体的主要形式与发展相关的感染,我们研究的影响胰岛素样生长因子- i (IGF)之间的相互作用l . amazonensis (l)无鞭毛体和巨噬细胞。被感染的巨噬细胞与IGF-I刺激后,我们观察到减少一氧化氮产量但精氨酸酶表达和活动增加,导致增加寄生。然而,刺激amastigote-infected巨噬细胞与IGF-I并未导致改变细胞因子水平相比,如果控制。因为IGF-I存在于体液和组织也在巨噬细胞内,我们检查了可能的影响因素对磷脂酰丝氨酸(PS)在无鞭毛体接触,以前在tissue-derived无鞭毛体导致增加寄生。刺激与IGF-I诱导PS曝光promastigotes无鞭毛体但不上。使用PS-liposome代替无鞭毛体,我们观察到PS-liposome而不是控制phosphatidylcholine-liposome导致精氨酸酶活性增加巨噬细胞,这个过程并没有被anti-TGF -β抗体。我们的研究结果表明,l . amazonensis (l)amastigote-infected巨噬细胞,IGF-I诱发精氨酸酶活动直接在无鞭毛体和巨噬细胞通过感应PS暴露在后者的无鞭毛体,这可能导致另一种通过cytokine-independent机制激活的巨噬细胞。

1。介绍

Leishmaniases与外皮的疾病或内脏形式属原生动物引起的利什曼虫并通过昆虫传播,影响超过1200万人在世界的热带和亚热带地区(1]。利什曼虫amazonensis(利什曼虫)是一种最普遍的物种造成外皮的利什曼病在新世界引起局部皮肤,粘膜,或弥漫性皮肤leishmaniases [2]。脊椎动物宿主的控制或利什曼病的进展取决于非特异性免疫反应的特定因素以及寄生虫逃避宿主反应的能力(3]。然而,各种疾病表现和结果可能导致来自不同利什曼虫与免疫和immunopathogenic响应l . amazonensis (l)展品特点,区别于其他物种。

病人感染的immunopathogenic机制的差异l . braziliensis (Viannia)或l . amazonensis (l)巴西普遍的物种,明显。而反应l . braziliensis (v)感染相关的恶化Th1-type响应(4- - - - - -6)或干扰素的调制,缺陷γ生产或降低il - 10受体表达在严重的粘膜情况下(6,7),l . amazonensis (l)感染会引起少有效的或有限的T细胞的免疫应答对寄生虫(5,8),这就可以解释弥漫性皮肤利什曼病在某些情况下的开发。这些差异也明显在小鼠皮肤利什曼病。相比l .主要感染BALB / c小鼠的应变敏感,C57BL / 6株耐药(9),鼠标菌株都是抵抗l . braziliensis (v)(10),都容易l . amazonensis (l)(11]。病变的发展l . amazonensis (l)来华的老鼠不仅依赖于Th2免疫反应(12而是在Th1 CD4的存在⁺T细胞(13)和干扰素-γ促进寄生虫生长在amastigote-infected巨噬细胞体外(14]。特异性免疫反应的不同结果和发展中l . amazonensis (l)感染可能归因于改变观察在早期先天利什曼虫主机的交互涉及炎性细胞因子,趋化因子,toll样受体,树突状细胞激活,等等15]。因此在目前的研究中,我们关注的影响非特异性相互作用的生长因子l . amazonensis (l)和巨噬细胞。

特异性的要素之间,我们一直在研究胰岛素样生长因子(IGF) -我的影响利什曼虫leishmaniases。IGF是多肽的分子量大约7.5 kDa,中存在的两种主要形式,IGF-I IGF-II,份额60%的相似性和在循环与IGF结合蛋白和组织。igf影响细胞代谢和内分泌生长和分化的因素是很重要的16]。根据这些特点,我们以前研究igf对利什曼病的影响在他们最初的相互作用特异性的因素,尽管Th1细胞因子干扰素-γ众所周知,抑制IGF-I [17),Th2细胞因子il - 4和IL-13增加IGF-I表达式(18]。

我们先前已经表明,添加生理浓度的外在IGF-I文化产生不同种类的扩散利什曼虫promastigotes和无菌无鞭毛体,这是一个效果,没有观察到IGF-II尽管高相似性IGF-I [19,20.]。在实验模型中,外在IGF-I显著增加病变大小和可行的寄生虫的数量(21]。

然而,在感染无鞭毛体与宿主细胞相互作用的发展是至关重要的感染和疾病,promastigotes是不同的。这个事实是优雅证明最近使用无菌利什曼虫主要无鞭毛体(22]。具体来说,比较利什曼虫amazonensis (l)promastigotes和无鞭毛体显示树突状细胞激活的差异22干扰素-后,寄生γ刺激(14),对组蛋白蛋白质(23IGF-I刺激(后),以及细胞内信号24]。因此,在目前的研究中,我们分析了影响IGF-I之间的交互利什曼虫amazonensis (l)无鞭毛体和巨噬细胞。

因为我们之前的数据显示,IGF-I有利于寄生虫生长和精氨酸酶激活使用利什曼虫amazonensis (l)promastigotes [25),我们最初评估寄生和精氨酸酶活动amastigote-infected巨噬细胞和cell-free-amastigotes IGF-I刺激。然后,我们分析了炎症和Th1、Th2细胞因子在被感染的巨噬细胞在生产IGF-I刺激巨噬细胞激活(因为他们的潜在作用26]。另一个现象的发展有关l . amazonensis (l)感染是磷脂酰丝氨酸(PS)接触观察,只有在tissue-derived无鞭毛体(27- - - - - -29日]。因为没有确定之前和IGF-I诱导因素存在于组织的液体,我们评估PS暴露IGF-I刺激和PS的可能作用在巨噬细胞活化分子。

在目前的研究中,我们因此表明IGF-I诱发精氨酸酶活动直接利什曼虫amazonensis (l)无鞭毛体和amastigote-infected巨噬细胞,后者通过PS的感应接触无鞭毛体,可能会导致另一种通过cytokine-independent机制激活的巨噬细胞。

2。材料和方法

2.1。寄生虫

利什曼虫amazonensis(利什曼虫)(MHOM / BR / 73 / M2269)请提供的克拉拉·露西亚巴比里教授大学联邦德圣保罗和维护通过定期通过inBALB / c小鼠。无鞭毛体来源于拦路贼BALB / c小鼠感染的病变早一个月。病变是无菌解剖和洗0.01磷酸盐pH值7.4 (PBS)和削减在皮氏培养皿中PBS和地面。然后,中止中断四个段落通过22码针头和离心机在250 g×10分钟3次;得到的上层清液离心机在1400 g×30分钟和寄生虫是悬浮在RPMI 1640介质(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA)。纯化的无鞭毛体实验中立即使用或在199年扩大到promastigotes和维护媒介(Gibco)补充heat-inactivated 10%胎牛血清(Cultilab,坎皮纳斯、SP、巴西)26°C。promastigotes用于这些实验被固定相的增长和经历了不超过4个段落文化。

2.2。老鼠

BALB / c小鼠的男女,年龄6 - 8周,得到的动物设施Faculdade药物da圣保罗和用作源腹膜巨噬细胞或体内的维护l . amazonensis (l)。本研究伦理委员会批准的动物研究(CEEA),生物医学科学研究所/圣保罗,协议数量041/03,坚持道德原则在动物研究采用巴西大学动物实验(COBEA)。

2.3。巨噬细胞文化、感染和刺激

居民腹膜细胞获得腹膜腔的BALB / c小鼠和悬浮在RPMI 1640 UI中补充了100 /毫升青霉素,100μg / mL链霉素,2% heat-inactivated BALB / c小鼠血清(完全培养基)。浓度被调整至4 - 5×10⁶细胞/毫升和不同数量的细胞被镀在13毫米²玻璃盖滑倒放在24-well板块的井(美国康宁生命科学,MA)或直接到井和孵化2 h坚持在板上37°C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司₂。此后,水井洗两次RPMI 1640中删除任何不依从细胞。然后,贴壁细胞(巨噬细胞)或利什曼虫无鞭毛体或promastigotes preincubated 5分钟和50 ng / mL重组人类IGF-I或IGF-II (R & D系统,明尼阿波利斯,美国),然后洗掉。这种寄生虫悬架(2个寄生虫/ 1个细胞比率)分发到2 h井和允许感染的33°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂然后noninternalized寄生虫冲毁,文化是维持在33°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂。在某些情况下,IGF-I和IGF-II维护整个实验周期。没有IGF-I控制维护。在一些实验中,100年μ米-hydroxy-L-arginine醋酸盐(名字)(Sigma-Aldrich有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)添加到文化或用于preincubate无鞭毛体5分钟,洗了30.]。测试一式六份,孵化2、24、48、72 h。盖玻片,上层清液,或细胞溶解产物恢复了不同的评估。在实验评价H₂O₂生产、使用无酚红培养基。

2.4。寄生虫负担在巨噬细胞

封面会从盘子中移除,安装和染色染料染色和加工寄生在光学显微镜评估(卡尔蔡司,哥廷根,德国)。六百细胞数为每个治疗条件。数据提出了寄生虫的数量在100个细胞从公式((感染细胞的寄生虫数量:数量)×(感染细胞的数量/细胞总数)×100]。这个分析是由两个独立的观察者对实验条件也不清楚。

2.5。细胞和寄生虫溶解产物:样品准备

500年四百万个细胞μL镀在24-well文化板块、感染和刺激IGF-I如前所述。一些与干扰素刺激——集γ(10 ng / mL)和脂多糖(LPS)大肠杆菌(西格玛有限公司。(圣路易斯,密苏里州,美国))(1μ克/毫升)或名字(100μ米)。孵化24小时后,冰冷的PBS的细胞被洗了两次,然后用冰冷的裂解细胞溶解10分钟的缓冲(10毫米Tris-HCl pH值7.6,150毫米氯化钠,2% NP-40替代(octylphenoxypolyethoxyethanol), 1毫米4 - (2-aminoethyl) -benzenesulfonyl氟化物和5μ米亮抑酶肽)。细胞溶解细胞准备在10000×g离心5分钟在4°C和上层清液中的蛋白质浓度确定使用Lowry蛋白质测定(31日调整前的浓度分析。这些溶解产物用于免疫印迹分析和精氨酸酶的表达和活性测定。分析利什曼虫无鞭毛体精氨酸酶的活动,使用相同的溶菌产物制备协议。

2.6。sds - page及免疫印迹分析

细胞溶解产物(20μg蛋白在20μL)钠十二烷基硫酸盐- 10%聚丙烯酰胺凝胶上运行。分离蛋白被electrotransferred到0.2毫米孔径硝化纤维膜使用transblot SD-semidry转移细胞(生物Rad、钙、美国;30分钟15 mV)。150毫米氯化钠的膜被封锁,20毫米三,0.01%渐变20,pH值7.4缓冲区(TBS-T缓冲区)含5%无脂牛奶一小时。膜的反应与单克隆抗体anti-arginase-I PBS(1: 1000)(美国圣地亚哥BD生物科学Pharmigen CA)在室温下2小时,洗了三次与TBS-T和孵化peroxidase-conjugated多克隆anti-mouse免疫球蛋白g (1: 1000) (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在室温下一个小时。彩虹蛋白质分子量标记(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。结合抗体的ECL化学发光检测工具(美国新泽西州Amersham生物科学,皮斯卡塔韦)根据制造商的指示。

2.7。精氨酸酶活性

细胞和无鞭毛体被从文化和获得溶菌产物化验了精氨酸酶活动如前所述[32]。简单地说,精氨酸酶激活,50μL溶解产物的处理同样体积的5毫米MnCl₂56岁,25毫米Tris-HCl pH值7.4°C 10分钟。然后,到25μL活性溶解产物,25岁μL 0.5精氨酸的pH值9.7添加和孵化37°C 60分钟。与400年反应停止μL H₂所以₄/小时₃阿宝₄/小时₂O (1/3/7, v / v / v)。尿素浓度为540 nm Multiskan MCC / 340 P 2.20版板读者分光光度计(Labsystems,万塔,芬兰)后的25μL 9%α-isonitrosopropiophenone 100%甲醇和孵化45分钟的100°C。一个单位的酶活性被定义为大量的酶,这种酶催化1的形成μ摩尔每分钟的尿素。

2.8。亚硝酸盐的检测

亚硝酸盐积累在细胞培养上清液作为一氧化氮产量的指标,它是由格里斯反应(33]。反应产物的吸光度在570纳米测量使用ELISA读者。亚硝酸盐的浓度决定使用亚硝酸钠作为标准。

2.9。检测H₂O₂

分析是基于辣根过氧化物酶(HRPO)介导氧化酚红的H₂O₂被挑选和Keisari [34]。建立了标准曲线用H₂O₂已知浓度的溶液。十四烷酸佛波醇酯(PMA) 2毫米(σ有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)作为积极的控制。测试一式六份。

2.10。测量细胞因子

细胞培养上清液是收获24 h后il - 1的分析β48 h对il - 6和TNF和TGF - 72 hβ和干扰素-γ通过ELISA根据制造商的指示使用BD OptEIA工具包(美国BD生物科学)在96年组织培养板(美国康宁合演有限公司)和阅读在450 nm Multiskan MCC / 340 P 2.20版本分光光度计(Labsystems,万塔,芬兰)。细胞因子的敏感性分析如下:干扰素-γ8 pg / mL;摘要意思- - -β8 pg / mL;il - 6、16 pg / mL;TGF -β,20个pg / mL;和TNF, 8 pg / mL。浓度测定的标准曲线从每个细胞因子生成。所有的细胞因子的测量进行了一式三份,同时为了避免已经变化。

2.11。测量前列腺素E₂(铂族元素₂)

分析是基于竞争的铂族元素绑定技术₂上层清液与一个固定数量的竞争中碱性phosphatase-labeled铂族元素₂鼠单克隆anti-PGE网站₂抗体。分析了根据制造商的指示使用前列腺素E₂免疫测定(研发系统,Inc .明尼阿波利斯,美国)。铂族元素的敏感性₂实验15.9 pg / mL。浓度的测定与标准曲线比较。

2.12。的影响IGF-I Phosphatidylserine-Exposure上

膜联蛋白V与带负电荷磷脂对PS表面特异性更高。膜联蛋白V的检测是由流式细胞仪和荧光素染色后isothiocyanate-conjugated膜联蛋白V和propidium碘(PI)使用商用设备(膜联蛋白V FITC凋亡检测装备II-BD生物科学)。无鞭毛体(10⁶寄生虫/毫升)治疗同样如上所述50或100 ng / mL IGF-I或H₂O₂(4或8毫米)(35)积极控制24 h。然后,这些细胞被洗冷PBS和100年的两倍μ(10 L的解决方案⁵细胞)在膜联蛋白V resuspended绑定缓冲(10毫米玫瑰,140毫米氯化钠,2.5毫米CaCl₂;与5 pH值7.4)和孵化μ膜联蛋白V FITC和5的Lμ在4°C L(π在黑暗中15分钟。在400年这一时期μL(绑定缓冲被添加到每个管和收集细胞BD FACSCalibur(美国新泽西州,正欲富兰克林)和分析细胞的追求。10000事件是收获从每个样本。我们评估膜联蛋白V积极和π-人口。

2.13。带负电荷的脂质PS-Liposome对精氨酸酶的影响BALB / c巨噬细胞的活性

2.13.1。脂质体的制备

脂质体是由film-hydration方法,使用氢化磷脂(类脂Gmbh,德国)36]。对带负电荷的脂质体的制备(PS-liposomes),饱和鸡蛋磷脂酰胆碱,饱和鸡蛋磷脂酰丝氨酸,和胆固醇(Sigma-Aldrich)(7: 2: 1摩尔比率)或中性脂质体(PC-liposomes-control组),磷脂酰胆碱,和胆固醇(9:1)溶解在氯仿:甲醇(1:1的比例)。解决方案是进一步用10分钟。混合物在旋转蒸发器蒸发在55°C 60 rpm 40分钟在真空和保护。入预热(55°C)解决方案的2.25%甘油(9毫升)添加到脂质膜用玻璃珠。的膨胀过程的脂质体进行旋转蒸发器在55°C 80 rpm没有真空的60分钟。中性的表面电荷和带负电荷的脂质体以前使用电动电势分析证实,在一个ζ+分析仪(布鲁克海文Instr。公司)。1毫升的样本稀释3毫米氯化钾作为推荐的制造商。然后稀释样本分析十周期的电压4 mV。 The phospholipid content of the liposomal formulations was determined by the Stewart assay [37]。

2.13.2。精氨酸酶活性和脂质体

巨噬细胞(2×10⁶/ 500μL RPMI 1640中)在24-well镀板和孵化2 h允许坚持在37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂。此后,水井洗RPMI 1640删除任何不依从细胞的两倍。然后,我们感染了一些井无鞭毛体(2寄生虫/ 1细胞比率)或使用30μL 30%的卵磷脂(PC)脂质体,30岁μL PS-liposome 30%,或30μL 2.25%的甘油作为刺激。如果巨噬细胞被用作控制。并行使用3中我们做了相同的实验μanti-TGF - Lβ抗体(15μg / mL)在每个(美国研发系统,Inc .)。24小时后,细胞治疗获得溶菌产物和精氨酸酶活性反应进行如上所述。

2.14。统计分析

统计分析使用GraphPad棱镜5 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。数据分析通过方差分析学生Newman-Keuls对比测试后,被认为是重要的时候。细胞因子变换和线性回归后吸光度进行了分析。结果表示为中位数和百分位数(25 - 75)。学生Newman-Keuls对比测试后的克鲁斯卡尔-沃利斯检验是用于统计比较组间使用SigmaStat Windows版本3.10(加利福尼亚州圣何塞Systal软件,Inc .),美国)。0.05置信水平被认为是显著的。

3所示。结果

使用tissue-derived利什曼虫amazonensis (l)无鞭毛体,我们首先分析了寄生在被感染的巨噬细胞和细胞外无鞭毛体和精氨酸酶的活动。IGF-I的影响化验在以下三种不同的方式:预培养的无鞭毛体或巨噬细胞5分钟与IGF-I冲毁或因素在培养基中维护整个实验周期。我们观察到的数量增加后巨噬细胞内寄生虫感染48 h(无鞭毛体所有IGF-I刺激条件测试(图1(一)),如前面观察promastigotes [25]。我们没有观察到任何影响IGF-II时使用L . amazonensis (L)无鞭毛体(数据没有显示)。

我们观察到增加精氨酸酶表达IGF-I刺激后感染巨噬细胞(图1 (b))。证明IGF-I刺激后的酶活性在场,我们测量了由尿素测定精氨酸酶活动,活动增加IGF-I治疗后(图1 (c))。确认尿素来源于精氨酸酶的活动,一个特定的精氨酸酶抑制剂(名字)被用来抑制尿素的形成(图1 (c))。尿素形成相对于增加如果寄生虫和抑制了名字。寄生与精氨酸酶活性和抑制增加了名字(图1 (d))。然而,一氧化氮产量显著降低比控制缺乏IGF-I(图1 (e))。无论是IGF-I还是IGF-II改变了生产的过氧化氢l . amazonensis (l)来华的巨噬细胞(数据没有显示)。此外,精氨酸酶活动IGF-I-stimulated cell-free-amastigotes也评估和精氨酸酶活性增加在这些条件(图1 (f))。

Th1、Th2细胞因子之间的平衡是一个重要的决定因素的激活精氨酸代谢途径导致一氧化氮的产生或聚胺类26)和巨噬细胞刺激与il - 4、il - 10, TGF -β诱发arginase-I激活并导致巨噬细胞内无鞭毛体增长的增加(30.,38]。除了这些细胞因子的生产其他炎性细胞因子(IFN -γ,il - 1β、il - 6、il - 10、IL-l2 TGF -β、TNF和铂族元素₂)进行了分析利什曼虫amazonensisamastigote-infected IGF-I刺激后巨噬细胞。IGF-I没有改变细胞因子生产amastigote-infected巨噬细胞相比,控制没有IGF-I(数字2(一个),2 (c),2 (e),2 (g),2(我))。作为对比,我们将研究扩展到分析细胞因子的生产利什曼虫promastigote-infected IGF-I刺激巨噬细胞。没有改变il - 10、il - 12和铂族元素₂也观察到利什曼虫形式(数据没有显示);然而,我们观察到降低干扰素-γ(图2 (b)),但增加了TGF -β(图2 (h))和肿瘤坏死因子(图2 (j))水平相比nonstimulated promastigote infected-macrophage控制。IGF-I增加产量未受感染的巨噬细胞il - 6,虽然无鞭毛体感染(图2 (e))导致其降低IGF-I-stimulated细胞,promastigote感染并没有促进il - 6减少IGF-I-stimulated细胞(图2 (f))。il - 1βamastigote-infected细胞(图水平保持在低位2(一个))高水平相比promastigote-infected细胞有或没有IGF-I刺激(图2 (b))。

因为我们没有观察到影响由于IGF-I amastigote-infected巨噬细胞在细胞因子的生产,我们寻找另一种机制,该机制可以解释替代巨噬细胞激活,专注于PS暴露在无鞭毛体描述(27]。我们调查了可能IGF-I对PS暴露的影响l . amazonensis (l)后IGF-I刺激。我们使用过氧化氢刺激作为一个积极的控制(35),感应PS曝光控制promastigotes但不是控制无鞭毛体。然而IGF-I明显提高PS暴露在无鞭毛体(图3),但不是promastigotes(数据没有显示)。

然后决定是否参与PS诱导巨噬细胞中精氨酸酶的活动。限制分析这个分子的影响,我们使用一个带负电PS-liposome代替无鞭毛体。控制,我们用中性脂质卵磷脂(PC)脂质体和甘油。PS-liposomes之前为特征,表现出电动电势−88 mV(±20),这是一个相当大的负电荷PC-liposomes相比,演示了一个电动电势的+ 1.25 mV (±0.2)。暴露在PS-liposome导致巨噬细胞精氨酸酶活性的增加。无论是PC-liposome还是甘油诱导巨噬细胞(图中精氨酸酶的活动4)。另外,我们观察到没有改变PS-liposomes引发的精氨酸酶活性的巨噬细胞使用anti-TGF -β抗体(图4)。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们使用tissue-derived无鞭毛体来模拟条件类似感染组织体内。最初,我们观察到的替代激活巨噬细胞与精氨酸酶表达和活动增加和减少一氧化氮产量l . amazonensis (l)amastigote-infected巨噬细胞,导致寄生后IGF-I刺激。这些发现是类似于以前的观测promastigote-infected巨噬细胞(25]。活性氧和活性氮中间体是重要的非特异性parasiticidal元素(39)和超氧化物和一氧化氮已被证明是必要的l . amazonensis (l)无鞭毛体杀死在巨噬细胞(40]。在我们的实验中,我们评估过氧化氢生产期间,发现并不是增加无鞭毛体或promastigote感染并没有改变IGF-I刺激(数据未显示)。然而,在目前的研究中,只有降低生产在IGF-I足以增加寄生在巨噬细胞。对于这个结果,我们应该考虑的额外IGF-I对激活的影响利什曼虫精氨酸酶在我们的系统。寄生虫精氨酸酶至关重要的增长和精氨酸酶基因缺失已被证明损害的恶化感染体外和体内41,42]。因素,激活利什曼虫精氨酸酶是未知的,但在我们之前的研究promastigotes [25)以及与无鞭毛体在我们目前的研究中,我们表明,宿主IGF-I激活寄生虫精氨酸酶。

因为另观察巨噬细胞的激活可能是由于细胞因子生产的灯26),我们分析了IGF-I刺激后细胞因子的生产(25]。在l . amazonensis (l)amastigote-infected巨噬细胞,我们观察到没有改变IGF-I刺激后细胞因子的生产相比,如果感染控制,表明巨噬细胞精氨酸酶激活由于无鞭毛体感染不涉及细胞因子生产的调制。有趣的是,在一个平行分析,相同的细胞因子的生产l . amazonensis (l)promastigote-infected IGF-I刺激巨噬细胞显示改变。我们观察到降低干扰素-γ但增加TGF -β和TNF水平与之相比,如果那些promastigote-infected巨噬细胞,这表明增加TGF -β以及减少IFN -γ导致替代IGF-I刺激激活的巨噬细胞l . amazonensis (l)promastigote-infected巨噬细胞。TGF -β生产已经在感染期间增加l . amazonensis (l)promastigotes如前所观察到的(43),进一步增加了IGF-I暴露在目前的研究。干扰素-的存在γ在文化上层清液可能起源于污染物淋巴细胞因为腹膜巨噬细胞被使用;然而,这样的淋巴细胞污染,如果有的话,会非常低,干扰素的生产γ通过巨噬细胞已被证明之前(44];因此,我们相信,干扰素-γ巨噬细胞起源于IGF-I刺激后,其产量下降。

虽然细胞因子生产没有改变在amastigote-infected IGF-I刺激巨噬细胞,当与promastigote-infected巨噬细胞相比,我们观察到的差异il - 1的生产β和il - 6。il - 1β生产中没有改变amastigote-infected promastigote-infected巨噬细胞巨噬细胞,但增加,而且没有观察到变化后IGF-I刺激。我们也观察了il - 6在IGF-I刺激的巨噬细胞无毒性,保持在同一水平上增加promastigote-infected细胞,但减少amastigote-infected细胞未受感染的水平,如果细胞。这些数据表明,无鞭毛体抑制细胞因子的生产。与我们的结果一致,il - 1β生产之前是抑制杜氏利什曼虫amastigote-infected人类单核细胞(45]。此外,l .主要无鞭毛体不产生TNF促炎细胞因子和趋化因子的产生CCL3和亚兰,这是与更高的生产在promastigote感染(22]。同样,与杜氏利什曼虫无鞭毛体,很大一部分的基因被证明是抑制宿主细胞(46]。

没有改变我们观察到的细胞因子的生产amastigote-infected巨噬细胞也观察研究利什曼虫主要在寄生虫精氨酸酶进一步可以影响宿主细胞精氨酸酶的活化作用[42]。这一发现将会是很有趣的确认l . amazonensis (l)但在这里,我们研究了PS tissue-derived曝光L amazonensis (L)无鞭毛体与进展相关的感染和被称为凋亡拟态(27]。诱导因素是未知的,因为IGF-I存在于组织液体(47和巨噬细胞内48无鞭毛体领域,我们认为的可能的影响因素对PS暴露在无鞭毛体。事实上,IGF-I刺激诱导PS曝光l . amazonensis无鞭毛体,但有趣的是,不是promastigotes。最近出版的关于利什曼虫promastigotes显示没有PS在这种形式的寄生虫49]虽然在我们的实验中promastigotes过氧化氢诱导的PS或一些类似的分子绑定到anexin V(数据未显示)。然而,我们应该强调凋亡拟态(27),目前的结果是指PS暴露在无鞭毛体,和PS的存在被认为是可能在其他增长阶段由同一作者(49]。

在凋亡研究拟态,寄生虫增长是由于板-β生产(27];然而,在目前的研究中,我们探讨了在巨噬细胞PS暴露对精氨酸酶活性的影响。使用PS-liposomes限制这个特定分子的分析,我们能够表明,事实上PS-liposomes但不是控制PC-liposomes导致精氨酸酶增加巨噬细胞的活动。此外,中和TGF -β使用一个anti-TGF -β抗体对精氨酸酶活性没有影响。值得注意的是,PS-liposomes以前对精氨酸代谢产生影响,导致减少在生产lipopolysaccharide-stimulated巨噬细胞(50]。在目前的研究中,我们还观察到减少一氧化氮产量,但增加精氨酸酶活性在amastigote-infected IGF-I刺激后细胞,建议优先选择巨噬细胞通路的激活,可能是因为PS暴露在刺激后无鞭毛体。必须进行进一步的研究来阐明如何PS-liposomes激活巨噬细胞精氨酸酶,但由于精氨酸酶是一种三聚物的金属酶,其中包含一个双核的锰簇活性部位(51),我们可以推测,PS-liposome可以携带负电荷的锰通过细胞膜当PS-liposomes内化巨噬细胞(37),提供锰酶并激活它。

研究使用鼠标[52和人类细胞53]显示增加利什曼虫寄生虫负担当凋亡中性粒细胞被巨噬细胞摄取。这个负担增加时使用的中性粒细胞利什曼虫主要易感染BALB / c小鼠压力。考虑到本研究的数据,我们可以推测,这种现象可能与PS暴露引起的精氨酸酶激活凋亡细胞。在上述研究中,效果与铂族元素的感应₂和TGF -β生产(52,53];然而,我们的数据与这观察作为一个可能的机制在目前的实验。

目前的数据表明,在l . amazonensis (l)amastigote-infected巨噬细胞,IGF-I诱发精氨酸酶活动直接在无鞭毛体和巨噬细胞。细胞因子的生产数据表明,无鞭毛体感染导致抑制细胞因子的生产没有贡献IGF-I刺激巨噬细胞激活。一个看似奇怪的现象l . amazonensis (l)无鞭毛体是PS的感应接触,以前观察到在tissue-derived无鞭毛体和被IGF-I诱导,导致感染在当下研究的进展。最后,我们应该强调激活的巨噬细胞由PS-liposomes导致精氨酸酶替代激活巨噬细胞通过cytokine-independent机制。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究支持Fundacao德帕罗尽管做Estado de圣保罗(批准号01/13009-9和平01/08799-0 CMVV),慰问Nacional de尽管(研究奖学金304064/2005-0 HG和批准号484499/2006-8),Seropidemiology和免疫生物学实验室LIM / 38 (HC-FMUSP)。作者感谢法Pettito-Assis求助与脂质体的实验。