文摘
本研究进行了检查的可能作用interleukin-1 (il - 1)在银屑病调节性T细胞的功能不足,通过比较il - 1受体的表达健康控制和银屑病T细胞。严重慢性斑块性银屑病患者和健康志愿者,年龄和性别匹配,被选为所有实验。CD4+CD25−效应和CD4+CD25+CD调节性T细胞分离和用于实验。信使rna的表达il - 1受体(IL-1R1、IL-1R2 sIL-1R2)是由定量实时rt - pcr。细胞表面表达il - 1受体被流式细胞术进行评估。信号传输的相对表达il - 1受体1型(IL-1R1) mRNA在休息更高银屑病效应和调节性T细胞和活化诱发高IL-1R1银屑病T细胞的蛋白表达比健康的细胞。银屑病监管和效应T细胞表达增加mRNA水平的诱饵(IL-1R2和sIL-1R2) il - 1受体激活与健康同行。银屑病T细胞稍微sIL-1R2释放到周围健康的T细胞。总之,il - 1受体的表达变化在银屑病监管和效应T细胞可能导致牛皮癣的发病机理。
1。介绍
牛皮癣,一种常见的炎症性皮肤病影响1 - 2%的个人在西方社会中,是由遗传倾向,可以引发或受到各种环境刺激因素的影响,如机械应力(Koebner现象)、感染、情绪压力、饮食、体重指数、饮酒、吸烟、某些药物,和气候的影响1- - - - - -3]。牛皮癣患者皮肤损伤渗透激活T细胞和hyperstimulatory抗原呈递细胞(4- - - - - -6]。最近发表的研究表明,intralesional激活T细胞产生细胞因子,引发了基底干细胞角质细胞增殖和延续皮肤炎症。角化细胞之间的相互作用和免疫细胞通过自分泌和旁分泌的细胞因子网络是一个关键的组件在牛皮癣的发展7,8]。
(il - 1)是一种强有力的炎性细胞因子参与host-defence反应损伤和感染。几个因素(il - 1受体,受体激动剂和拮抗剂)参与il - 1的规定活动(9]。1型受体(IL-1R1)被描述为一个信号传输受体,引发了il - 1α和il - 1β配体。的胞内域IL-1R1负责初始化在靶细胞炎症信号流程。2型il - 1受体(IL-1R2)诱饵受体,因为它们缺乏胞内信号传输域介导il - 1的效果。IL-1R2可以找到相关的质膜和可溶性分泌形式。这两种受体形成强烈绑定il - 1;然而,他们无法初始化il - 1信号通路。可溶性IL-1R2脱落产生的蛋白质从细胞表面或合成可溶性形式从一个不同的基因(sIL-1R2)。il - 1的贡献和相关信号炎性皮肤病,牛皮癣发病机理是由几项研究[10,11]。
根据我们最近发表的数据,牛皮癣患者CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)在抑制CD4激活功能缺陷+CD25−扩散效应T细胞(苔麸)相比,健康Treg细胞(12]。然而,调节性T细胞缺陷的原因大多不明。由于il - 1信号导致多种促炎细胞因子的释放,包括肿瘤坏死因子α,IL-17A [13)和il - 6,它已经涉及预防免疫抑制的调节性T细胞(14]。因此,我们假设,il - 1信号通路可能参与的功能缺乏调节性T细胞在银屑病。本研究旨在比较Treg il - 1受体亚型的表达和画眉草细胞从银屑病和健康的人。
2。材料和方法
2.1。病人
严重慢性斑块型银屑病患者和健康志愿者,年龄和性别匹配,被选为所有实验。银屑病患者未经治疗或只接受局部疗法在过去4周在抽样之前。至少有四个病人收集的样本和四个健康志愿者为每个实验。人力调查审查委员会批准的这项研究是大学的塞格德,编译的道德标准研究与符合《赫尔辛基宣言》。书面知情同意了所有捐助者参与这项研究。
2.2。试剂
人类T淋巴细胞监管隔离设置,anti-CD127-PE anti-CD45RO-FITC, anti-CD25-APC、PE和APC共轭链霉亲和素,和人类重组蛋白质买来BD - 2生物科学(美国加利福尼亚州圣何塞)。流式细胞术和流分类的实验都是在FACSCalibur流式细胞分析仪和数据分析与CellQuest软件(BD生物科学)。rpmi - 1640中,anti-CD3 / CD28涂布珠和试剂盒试剂是来自生命技术(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。胎牛血清(的边后卫)获得HyClone实验室,Inc .(美国犹他州南部洛根)。Anti-CD4-PerCP,生物素化的anti-IL-1R1、anti-IL-1R2和人类sIL-1R2 Quantikine酶联免疫试剂盒来自研发系统(明尼阿波利斯,美国),和anti-GARP-PE (LRRC32)从恩佐生命科学(美国纽约法明岱尔)。抗生素/抗真菌的解决方案、谷酰胺MEM的维生素的解决方案,和叠氮化钠从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。聚蔗糖Paque收购通用电气医疗集团生物科学(乌普萨拉,瑞典)。
2.3。隔离和监管和效应T细胞的活化
梯度离心后从银屑病患者和健康志愿者外周血使用聚蔗糖Paque, CD4细胞+细胞分离外周血单核细胞通过负选择使用antibody-coupled磁珠。激活的细胞是由孵化与CD3 / CD28珠(1:4珠细胞比),6日和24小时(rt - pcr实验),(流式细胞术),48小时和72小时(ELISA实验),制造商的指示。
不同的T细胞亚群被确定通过流式细胞分析仪使用CD45RO和CD25标签。CD45RO和CD25双重否定细胞被认为是幼稚T细胞(TN)、CD45RO和负面的CD25阳性细胞为天真的调节性T细胞(TNreg)、CD45RO阳性和CD25 -细胞记忆T细胞(TM)和CD45RO和CD25双阳性细胞调节性T细胞(Treg);anti-GARP激活细胞的抗体被用来代替anti-CD25 CD4歧视+亚种群,如前所述15]。
CD4+和CD4+CD25+细胞分离与人类T淋巴细胞监管隔离设置实时rt - pcr和ELISA实验。CD4细胞被进一步选择+CD25+人口anti-CD127抗体和流式细胞分析仪辅助排序如前所述16]。
2.4。细胞培养
T细胞是维持rpmi - 1640中补充了10%的边后卫,1%的抗生素/抗真菌的解决方案,1%的谷酰胺,MEM的维生素的解决方案在37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司2。
2.5。实时rt - pcr
监管和效应T细胞被激活在表示时间和总RNA分离使用试剂盒试剂;RNA浓度由A260值决定。互补脱氧核糖核酸合成从1μ总RNA的g使用Bio-Rad iScript互补脱氧核糖核酸合成装备,和rt - PCR实验做iCycler智商实时PCR机Bio-Rad(美国大力神,CA)。每个感兴趣的基因的丰度是正常18 s核糖体,核糖体rna基因的表达每个检查样本;数据表示为任意数量与mRNA水平成正比。
2.6。流式细胞术
CD4+一夜之间,T细胞被培养后的分离过程。激活细胞培养2天与CD3 / CD28涂布珠子的10 U / mL - 2。没有珠子和2控制细胞被孵化。两天后细胞收获和PBS洗一次。CD4+细胞> 95%的纯验证了反CD4-PerCP标签。不同的细胞群被染色和反CD45RO-FITC反CD25-APC或反GARP-PE 45分钟的冰。细胞被标记生物素化的反IL-1R1或生物素化的反IL-1R2单克隆抗体或适当的同形像控制在1μ克/毫升浓度在冰上45分钟。洗两次后用流式细胞仪缓冲区(1%的边后卫+ 0.1%叠氮化钠在PBS) PE或APC-conjugated链霉亲和素添加在冰上和孵化30分钟。500年样本清洗和resuspendedμL流式细胞仪缓冲区;染色用FACSCalibur测量。
2.7。分泌sIL-1R2测定采用ELISA技术
千百个正常和银屑病效应和调节性T细胞种植每井一百九十六年板。上层清液的控制和CD3 / CD28细胞被激活后三天的孵化。可溶性IL-1R2浮在表面的蛋白质水平是由使用的酶联免疫试剂盒sIL-1R2制造商的指示。
2.8。统计分析
所有数据都统计分析和比较意义使用单向方差分析(Holm-Sidak方法)为多个比较SigmaPlot软件(Systat软件公司,芝加哥,美国)。
3所示。结果
3.1。银屑病天真,记忆,天真Treg, Treg定量细胞数量相同的健康的细胞群
CD4+T细胞是分离PBMC分数的健康和银屑病外周血样本使用磁珠技术。天真(TN),内存(TM),天真的监管(TNreg)和调节性T细胞(Treg)亚种群被CD45RO和CD25 / GARP标签(图1(一)和1 (b))。类似的T细胞的数量分布在正常休息和银屑病样品和没有显著差异的细胞数量控制和银屑病T细胞的子组。天真的40%左右,45%的内存和2 - 5% TNreg和Treg CD4检测+细胞(图1 (c))和无显著变化观察两天后CD3 / CD28刺激。
(一)
(b)
(c)
3.2。银屑病Treg细胞显示持续增加IL-1R1基因表达与健康同行相比
为了研究CD4 IL-1R1 mRNA的表达+T细胞亚群,外周血单核细胞分为CD4细胞+CD25−效应细胞和CD4(画眉草)+CD25+CD127−监管细胞(Treg)使用磁珠和流式细胞分析仪(图辅助排序方法2(一个))。总RNA分离控制和CD3 / CD28珠激活细胞,和IL-1R1 mRNA水平被实时rt - pcr检测(图2 (b))。控制休息画眉草细胞表达非常低水平的IL-1R1 mRNA在健康和银屑病样本。激活显著诱导IL-1R1画眉草细胞基因表达;感应更加明显在银屑病画眉草细胞在所有时间点检查,尽管健康和银屑病样本之间的差异没有统计学意义。
(一)
(b)
(c)
(d)
休息Treg细胞显示更高IL-1R1基因表达与画眉草细胞相比,与银屑病Treg细胞显示mRNA水平升高在健康的同行。IL-1R1 mRNA表达一直诱导健康Treg细胞在6小时后达到最高水平,剩下的升高在24小时后CD3 / CD28刺激(统计学意义在24小时,图2 (b))。银屑病T细胞,然而,没有回应IL-1R1 mRNA水平的进一步提高T细胞受体激活信号;甚至在24小时观察略有减少。IL-1R1基因表达在激活更高银屑病Treg细胞与健康同行(统计学意义在24小时,图2 (b))。
3.3。IL-1R2和sIL-1R2基因表达的诱导后细胞的激活在银屑病画眉草细胞相比健康更突出
mRNA表达模式的两个诱饵il - 1受体(IL-1R2和sIL-1R2)是惊人地相似。没有显著差异在基线的mRNA表达IL-1R2(图2 (c))和sIL-1R2(图2 (d))健康和银屑病苔麸或Treg细胞之间的基因。CD3 / CD28激活,诱饵的mRNA表达il - 1受体增加在每个画眉草和Treg样品检查(统计学上显著差异在银屑病苔麸后24小时内激活IL-1R2 mRNA表达;在健康和银屑病Treg IL-1R2 sIL-1R2 mRNA表达相比基线静息细胞)。后T细胞受体刺激银屑病T细胞表达高水平的诱饵比健康的il - 1受体(银屑病和健康之间的显著差异画眉草细胞IL-1R2和sIL-1R2 mRNA表达在24和6小时后激活,职责)。
3.4。更高比例的激活银屑病Treg细胞表达IL-1R1蛋白质与降低强度相比,健康细胞
正常和银屑病CD4+细胞培养两天在(激活细胞)或缺失(控制单元)anti-CD3 / CD28涂布珠子和2 (10 U /毫升)。细胞表面IL1R1和IL-1R2表达式使用流式细胞仪测定。T细胞亚群(TN, TM、TNreg Treg)如前所述封闭(图1(一))。细胞的百分比显示IL-1R1积极控制健康和银屑病样本之间的比较(图3(一个))。在休息的T细胞,IL-1R1表达在Treg分组人口比例最高的健康和银屑病样本,分别达到了32.31%和31.87%。细胞表面存在IL-1R1明显降低TM(17.89% / 19.52%)和TN(16.21% / 11.73%)的亚种。IL-1R1受体表达的强度(图3 (c))在银屑病Treg细胞高(平均荧光强度,)与健康同行();但是这种差异不显著()。
(一)
(b)
(c)
(d)
激活后,IL-1R1表达细胞的数量大量增加,显示与银屑病Treg细胞更明显上升,导致一个重大区别IL-1R1阳性细胞的数量的健康(68.4%)和银屑病(80.8%)样品(图3(一个))。我们发现IL-1R1表达强度显著增加(图3 (c)两天)在健康Treg细胞(CD3 / CD28刺激后);这不是在银屑病样本()。
IL-1R1阳性细胞的比值在TM分组人口增加到48.39%在健康和47.8%银屑病样品两天之后激活(图3(一个))。CD3 / CD28刺激健康的小梁网细胞呈现显著增加IL-1R1染色(图的强度3 (c)、控制,激活),而银屑病小梁网细胞静息细胞相比没有变化(控制显示,激活)。未发现显著变化的数量IL-1R1表达TN细胞激活后;然而蛋白质的表达强度增加在健康TN。综上所述,这些研究结果表明,活化诱发IL-1R1表面受体表达健康和银屑病Treg和小梁网细胞;然而,受体密度是只会增加在健康的T细胞CD3 / CD28激活。
3.5。IL-1R2表达Treg和小梁网细胞激活大大增加
CD4+细胞治疗和标记流式细胞术分析如前所述的健康和银屑病样本(图1(一))。T细胞亚群被定义和IL-1R2表达决心。大多数的休息从所有CD4细胞+的亚种群研究负IL-1R2诱饵受体(图3 (b))。与IL-1R1蛋白不同,表达的膜结合诱饵受体不是Treg细胞之间的比例更高。然而,两天后激活大多数Treg细胞显示IL-1R2积极性。只有在适度增加IL-1R2表达TM和TN亚种群几乎没有变化。细胞表面强度IL-1R2表达式(图3 (d))是增加在健康Treg和小梁网细胞CD3 / CD28刺激,而在银屑病我们注意到一个小样本的情况下减少IL-1R2表达强度;这些变化在统计学上没有显著意义。
3.6。在银屑病T细胞相比略有升高sIL-1R2生产健康的T细胞
在确定细胞表面诱饵il - 1受体表达,我们检查是否Treg和画眉草细胞控制和银屑病人可溶性IL-1R2释放到上层的激活。IL-1R2在上层清液的浓度的细胞在静息状态由ELISA,经过三天的CD3 / CD28激活。我们发现一个明显的释放IL-1R2蛋白质,尤其是后激活。虽然画眉草细胞分泌大量的蛋白质比Treg细胞进入上层清液,差异没有统计学意义在健康或银屑病细胞(图4)。银屑病T细胞产生轻微的但不是sIL-1R2的蛋白质水平显著升高与健康同行相比。
4所示。讨论
银屑病是一种炎性皮肤病,复杂的皮肤的免疫力失调(17]。银屑病斑块的形成是由组件皮肤先天免疫系统的异常交互和持续的皮肤居民细胞与细胞的造血系统1,18]。T细胞牵扯维护银屑病的发病机制中的关键球员似乎涉及细胞因子网络集中在IL-17 / IL-23和肿瘤坏死因子α(19- - - - - -22]。
在这里,我们提供的证据表明,成员中差异表达受体家族银屑病及健康的外周血T细胞。虽然监管的比例、内存、天真,天真的监管在CD4 T细胞的数量+T细胞池是相似的在银屑病和健康人外周血;il - 1受体的表达差异,成为著名的特别是在激活,可能导致牛皮癣的发病机理。这里我们还提供额外的信息效应/调节性T细胞特征,表明存在着根本性的差异表达之间的信号传输和诱饵Treg和画眉草细胞il - 1受体。
是其中一个因子连接先天和适应性免疫反应,它长期以来一直与银屑病的发病机制(10,23),与最近的发现进一步支持这一概念(24]。il - 1α活动在银屑病病变已被证明是减少,相对于正常表皮水平(23)和nonlesional皮肤(10,24]。另一方面,增加了il - 1β生产一直在报道银屑病lesional皮肤(24]。高度诱导IL-1R2受体表达在上皮细胞在银屑病病变中相对于健康控制活组织检查(25]。最近,增加血清il - 1受体拮抗剂的检测银屑病患者相比,匹配控制(26]。几个小说表达il - 1的家人(IL-1F6, IL-1F8、IL-1F9 IL-1F5)增加2到3个数量级银屑病斑块与冷漠银屑病皮肤,诱导抗菌肽的表达,在表皮细胞中基质金属蛋白酶(27]。化学刺激小鼠皮肤overexpressing il - 1家人IL-1F6导致炎症条件类似于人类牛皮癣(28]。显然,从这些研究中,il - 1家族成员的重要作用可以建立牛皮癣。差一些配体和受体的表达il - 1的家庭已经广泛被调查在牛皮癣;然而,可能与表皮细胞相互作用的免疫细胞通过这些细胞因子/细胞因子受体尚未看着。
il - 1α和il - 1β两个绑定并激活相同的受体(29日),刺激其他促炎细胞因子的释放,如肿瘤坏死因子α和il - 6,诱导细胞适应性反应的Th17偏见(13]。两人肿瘤坏死因子α和IL-23 / Th17轴强烈与银屑病的发病机制(30.,31日),而il - 6最近被证明是重要的预防免疫抑制的调节性T细胞(14]。因此,一些证据表明,il - 1可能直接或间接地导致牛皮癣的炎症过程。
除了信号传输受体(IL-1R1), il - 1α和il - 1β可以绑定几个il - 1受体家族的其他成员。最近发现il - 1受体在体外扩大人类Treg细胞(32]。IL-1R1是il - 1的信号受体,而IL-1R2中和il - 1作为诱饵受体表面或裂解和分泌受体同种型(9]。IL-1R1不断休息Treg细胞上表达,而在激活调节在其他T细胞亚群,同时保持优惠表情Treg子集(15]。我们的结果是一致的最新发现关于亚群中和il - 1β活动;因此很可能优惠的表达IL-1R2通过这些细胞可能有助于抑制功能。
5。结论
在我们的研究中,T细胞刺激通过TCR IL-1R1表达谱显示类似于先前发表的结果;也就是说,尽管Treg细胞保持最高水平,CD4细胞+T细胞移植他们的子集IL-1R1表达式。有趣的是,尽管在静止条件下的区别IL-1R1表达健康和银屑病T细胞是最小的,它变得明显高于激活银屑病细胞激活健康对照组相比。根据最近的il - 1的数据β结合2,自然人类Treg细胞转换成Th17谱系细胞(33),人们很容易推测银屑病T细胞在一个IL-1-rich环境中,如皮肤发炎,更有可能将比nonpsoriatic个人Treg细胞效应细胞。总的来说,我们的研究表明,il - 1受体的微分表达式可能导致牛皮癣银屑病T细胞的发展。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
阿提拉碧碧和费伦茨Kovacs-Solyom同样这项工作。
确认
这项工作是支持的Orszagos Tudomanyos Kutatasi阿拉普(OTKA)赠款K73548和NK77434 TAMOP授予TAMOP-4.2.2。A-11/1 / konv - 2012 - 0035和TAMOP 4.2.4.A-2013/2-A2-SZJO-TOK-13。