文摘

Chlamydophila肺炎(CPn)是一种常见的呼吸道病原体导致长期和持续的呼吸道感染。老年人显示这个感染易感性增加和严重程度。然而,潜在的机制并不清楚。树突状细胞(dc)是免疫反应的发起者和监管机构。因此,我们调查了DCs与年龄增加尼共感染的作用在体外在人类身上。虽然活化标志物的表达是两个年龄组之间的可比性,DCs从岁受试者分泌增强的促炎介质如TNF水平并在应对尼共CXCL-10。相比之下,分泌il - 10和天生的干扰素干扰素-和干扰素-在DCs严重受损,享年捐助者。DCs的激活增加岁受试者尼共还导致增强的CD4和CD8 T细胞的增殖DC-T coculture。此外,T细胞会从岁受试者CPn-stimulated DCs分泌水平的提高干扰素-并降低il - 10水平与DCs来自年轻的学科。总之,从老年人DCs显示增强炎症反应尼共可能导致气道重塑的敏感性,增加老年哮喘等呼吸道疾病。

1。介绍

老年高危个体发展慢性气道炎症性疾病如哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD) (1- - - - - -3]。在所有气道疾病,哮喘是成为最重要和最普遍的疾病之一(3]。最近的一项调查估计,哮喘影响4 - 8%的美国人口超过65岁,预计将增加在即将到来的年3]。大部分的死亡引起的哮喘也发生在这个年龄段(2,3]。急性呼吸道病毒感染如流行性感冒经常引发哮喘发作,因此被认为是主要的罪魁祸首在老年哮喘的发病机制(4,5]。

有一个缺乏信息的影响慢性或潜在的呼吸道感染,这可能引起长期的气道炎症。Chlamydophila肺炎(CPn)是一种专性细胞内的细菌病原体导致慢性、持久,通常无症状感染(6]。据报道也参与哮喘恶化,咽炎,支气管炎7]。流行病学资料表明,大多数人一生中受到感染和感染(8]。社区获得性肺炎(CAP)仍然是一个全球发病率和死亡的重要原因,严重威胁老年人尽管有效的抗生素的可用性。尼共,盖由于非典型病原体肺炎支原体单个或copathogens,在老年患者可引起严重的疾病,导致住院治疗。从文学研究表明支原体和Chlamydophila负责9 - 12%和6 - 13%的上限,分别为(9]。报告也显示,抗体特定于CPn的患病率在老年人显著增加(10]。此外,老年小鼠感染尼共显示感染严重程度的增加而年轻的动物(11]。的age-associate改变免疫系统的功能可能会扮演一个角色在尼共感染的发病率和严重程度增加老年人并不好理解。

树突状细胞(dc)是目前在上皮细胞衬气道和初级急救员在呼吸道感染12]。DCs出席航空意识和捕捉病原体通过各种病原体识别受体(PRRs)。随后DCs成为激活上调costimulatory和受体分子的表达和分泌促炎细胞因子。在激活期间,DCs迁移到淋巴结'和激活幼稚T细胞。激活分子和细胞因子分泌DCs对T细胞反应(产生重大影响13,14]。我们和其他人已经报道,年龄显著影响直流功能和改变他们对感染的反应(15]。DCs在捐助者展览增强炎症反应在基础层面和显示增加反应性自体抗原(16,17]。与自体抗原相比,DCs从老年人到病原体的反应往往是妥协。例如,DCs岁从主体的生产能力严重受损干扰素-(IFN -)和干扰素-(IFN -)与流感病毒激活后18,19]。最近在活的有机体内在老鼠身上的研究已经证明尼共可以感染DCs和改变其功能诱导促炎的状态。此外,尼泊尔共产党也可能利用DCs对于肺外的传播(20.,21]。与年龄有关的变化响应的DCs尼共可能因此发挥重要作用在尼共老年人感染会增加。

本研究的目的是比较对CPn的DCs获得这两个年轻人和老年人。

2。材料和方法

2.1。献血者

捐献的血液样本,健康的老年人和青年志愿者,收集。年轻献血者的年龄是20到35年,老年是在65年和90年。老年人被认为是中产阶级的社会经济地位和独立生活。队列中提供了表的描述1。本研究机构审查委员会批准的加州大学(美国CA欧文)。

2.2。在体外人类Monocyte-Derived DCs的推导和文化

DCs是像之前描述的那样准备(22]。外周血单核细胞(PBMCs)被Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离。单核细胞被积极的选择与纯化从PBMCs anti-CD14微(加拿大干细胞的9月,温哥华BC)。孤立的CD14的纯洁性⁺单核细胞> 90%,由流式细胞术。DC分化的诱导、纯化CD14⁺单核细胞被培养在湿润的气氛中5%的有限公司₂在37°C RPMI 1640补充10%的边后卫,1毫米谷氨酰胺,100 U /毫升青霉素,100μ50 g / mL链霉素,ng / mL人类rGM-CSF (PeproTech,落基山,新泽西,美国),和人类rIL-4 10 ng / mL (PeproTech)。一半的媒介是每2天更换一次,DCs (CD14⁻HLA-DR⁺CD11c⁺收集细胞)后6天。DCs的纯度> 95%是由CD14表达,CD11c, HLA-DR。

2.3。刺激

c .肺炎cm - 1(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)在Hep-2细胞传播和存储在谷氨酸2-sucrose磷酸盐缓冲−80°C。不成熟的DCs收集6天与紫外线灭活的刺激尼泊尔共产党与莫伊相当于0.01尼共:1直流或0.1尼共:1直流或1尼共:1。

2.4。DC表型

控制和CPn-stimulated DCs两年龄组的受试者彩色表面表达CD80、CD86, CD83, HLA-DR使用直接共轭Abs(美国圣地亚哥BD Pharmingen CA)。总共10000 CD14⁻CD11c⁺细胞每条件是获得使用FACSCalibur (BD Pharmingen)。数据分析使用FlowJo(树明星Inc .,亚什兰,美国)。

2.5。细胞因子和趋化因子生产直流

DCs是刺激与尼共24 h如上所述。上层清液被收集并存储在−70°C到被分析。细胞因子、干扰素-、il - 6、TNF -、il - 10、il - 1,CXCL-10 CXCL-8和IL-12p40上层清液被流测量Cytomix (BD Pharmingen)按制造商的协议。干扰素-用ELISA测定(PBL生物医学,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。

2.6。同种异体T细胞Cocultures直流

未成熟dc刺激与尼共如上所述。孵化24小时后,细胞被收集和清洗。随后,1×10⁴DCs是培养1×10⁵磁珠纯化(公元前干细胞,温哥华,加拿大),天真的同种异体T细胞从年轻的个体。对于幼稚T细胞隔离,首先总T细胞被负选择孤立;随后,CD45RO珠子被用来消除记忆细胞。CD45RA其余细胞> 95%⁺由流式细胞术。DCs和年轻岁为每个实验对象的培养与同种异体T细胞从一个年轻的主题进行比较。T细胞是来自另一个年轻的主题为每个实验。经过7天的孵化,上层的收集和干扰素的分泌圣地亚哥,il - 10, IL-21 (eBiosciences CA,美国),干扰素-(BD Pharmingen)和IL-17使用ELISA (eBiosciences)评估。

2.7。CD4和CD8 T细胞增殖

刺激DCs与纯化培养,CFSE-labeled外源的年轻捐献者的T细胞的比例1:10 96 -孔板。T细胞的纯度从直流T细胞培养7天后85 - 91%,由流式细胞术。彩色CD4和CD8细胞被收集和标记。通过测量CFSE的稀释,我们确定的增殖能力的CD4 T和CD8 T细胞。增殖指数(部门总数除以数量的细胞进入分裂)计算使用扩散FlowJo平台。

2.8。隔离和人类文化传统骨髓DCs (cdc)从血液

疾控中心从PBMCs丰富老年和年轻受试者的负选择使用基于磁珠的装备从干细胞的分离。纯度> 90%是由使用CD11c及HLADR流式细胞术。大约1 - 3×10⁵疾病预防控制中心从40毫升血液中恢复过来。疾病预防控制中心(5×10⁵/毫升)刺激与紫外线灭活尼共莫伊相当于1直流:1尼共24 h。上层清液分别收集了各种细胞因子对DCs如上所述。

2.9。统计分析

数据分析和数据使用GraphPad Prism 5.00软件生成(美国圣地亚哥GraphPad软件)。组间显著差异在90%置信区间由Mann-Whitney测试(值< 0.05被认为是显著的)。

3所示。结果

3.1。类似的表达激活标记DCs在应对尼共老年和年轻的学科

年龄可能改变的反应DCs尼共(11]。因此,我们调查是否upregulation DC活化标记在尼共改变在DCs从主题与DCs岁年轻的学科。

表中描述的主题1。控制人口包括24个人20-32年龄段的平均年龄为26岁。24个人的老年人口由65 - 93年龄段的平均年龄为78岁。年轻的人是健康的,而不是药物。

DCs从年龄和年轻的人与紫外线灭活尼共刺激比1:1 24 h。这个浓度的尼共被发现最优(补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/436438)。刺激与DCs的细菌导致大量激活衰老和年轻受试者(图1)。激活标记的表达相当的DCs和年轻岁(图1(一))。荧光强度的平均值(MFI)建议的所有科目中DCs岁受试者显示增强的表达CD80和CD83但差异不显著(数字1 (b)和1 (d))。CD86的表达的MFI和HLA-DR另一方面在DCs可比从年龄组(获得数据1(一),1 (b),1 (e))。这数据表明感染与尼共导致轻微虽然微不足道的增加激活和DCs的成熟年龄与DCs从年轻的学科。

3.2。改变的分泌细胞因子和趋化因子的DCs岁年轻捐献者的捐赠者与DCs与尼共后刺激

接下来,我们调查了这些刺激细胞因子分泌的DCs。刺激与尼共24 h后,上层的收集和化验流Cytomix和/或ELISA量化细胞因子的分泌。DCs与尼共的刺激诱导的生产增加的促炎细胞因子(il - 6、TNF水平,il - 1白介素、干扰素-和干扰素-),趋化因子(CXCL-8 CXCL-10)和抗炎细胞因子(il - 10)如果DCs在两个年龄组(图2)。然而,分泌细胞因子和趋化因子的水平是两个种群之间的截然不同。刺激与尼共导致显著增强分泌CXCL-10 (,图2(一个))和肿瘤坏死因子-(,图2 (b)在DCs)岁受试者相比DCs从年轻的学科。类似于Th1支持趋化因子CXCL-10特区从岁捐助者也分泌il - 12的水平明显高于相对于年轻捐献者的DCs (,图2 (c))。相比之下,抗炎细胞因子的分泌il - 10在CPn-stimulated显著降低DCs从岁受试者相比,DCs年轻学科(,图2 (d))。有趣的是这种高分泌il - 10岁的DCs的主题也观察到当DCs从年龄和年轻受试者孵化尼共,较低,0.1 CPn和1尼共(数据未显示),这意味着接触尼共,即使在低浓度,诱发免疫抑制反应而非炎症反应在DCs年轻的学科。然而,在DCs岁来自个人,这种反应是逆转,更多的炎症反应。

先前的研究已经报道生产先天干扰素水平显著下降,干扰素-和干扰素-通过DCs,享年捐赠者对呼吸道病毒感染(18,19,23]。因此,我们调查是否缺乏干扰素生产延伸到呼吸道细菌感染。类似于我们的结果与病毒感染、孵化的DCs岁受试者与尼共导致干扰素-水平显著降低(,图2 (e))和干扰素-(,图2 (f))相对于DCs从年轻的学科。所有其他细胞因子的分泌il - 6, CXCL-8, il - 1(数据2 (g)- - - - - -2(我)从两组),相当CPn-stimulated DCs。总之,这些数据表明年龄提高CPn-stimulated DCs的能力从年龄到分泌促炎和Th1促进细胞因子和趋化因子是伴随着减少了抗炎和保护细胞因子的分泌。

在老年人科目根据并发症(表有几个子组1)。亚组分析是进行骨关节炎、高血压和受试者服用维生素和抗氧化剂在这些子组有足够的数量。然而,我们没有观察到任何显著差异的两组之间细胞因子水平()。基于这些子群分析,我们感到相当自信,比较年轻的控制和老年人口产生有效的结果在一个通用的老年群体。

3.3。常规骨髓DCs (cdc)岁的受试者的血还显示增强的CPn的炎症反应

上述实验进行DCs来源于单核细胞在体外在rGM-CSF rIL-4。排除任何可能在DCs的反应由于工件在体外推导,我们调查的反应直接从血液净化中心的尼共老年和年轻的学科。类似于单核细胞衍生的DCs,刺激与尼共导致显著增强分泌TNF -(,图3(一个))和CXCL-10 (,图3 (b))从年龄对象相对于疾病预防控制中心疾病控制中心从年轻的学科。il - 6的分泌也明显高于(,图3 (c)岁)在疾控中心主题而年轻的同行。相比之下,美国疾病控制与预防中心从捐赠者岁显示il - 10的重要障碍生产(,图3 (d))和干扰素-(,图3 (e)相对于年轻捐献者的疾控中心)。水平的il - 12、il - 1、CXCL-8和干扰素-低于检测限制我们的分析。这些数据表明,两者兼而有之在体外DCs和疾控中心的血岁受试者对CPn刺激显示类似的反应。其余的实验被执行在体外派生的DCs。

3.4。提高CD4和CD8 T细胞增殖的CPn-Stimulated DCs享年捐助者

为了确定CPn-stimulated DCs的T细胞启动能力是否也改变了老人,我们调查了DCs的能力从年龄和年轻受试者诱导CD4和CD8 T细胞的增殖利用同种异体细胞DC-T coculture系统前面描述的(22]。CPn-activated未激活的DCs与天真,培养纯化,CFSE-labeled T细胞年轻,健康个体(排除异常T细胞)作为T细胞从老年人已报告有许多缺陷(24,25]。六天后,T细胞是化验的稀释扩散通过测量染料CFSE流式细胞术。

文化的CD4 T细胞CPn-stimulated DCs岁受试者诱导扩散大约58%的CD4 T细胞相对于如果DCs增殖诱导47%(图4(一),)。CPn-stimulated DCs从年轻的学科也诱导增殖显著水平的CD4 T细胞(45%)如果DCs(38%)(图4(一),)。因此,CD4 T细胞增殖的增加大于4%,在DCs coculture从年龄和T细胞(图4(一))。

CD8 T细胞扩散的模式类似显著增加CD8 T细胞增殖后观察到文化与CPn-stimulated DCs岁从个人(65%)(图4 (b),相对于如果DCs) (52%)。相比之下,CPn-stimulated DCs从年轻受试者未能提高显著增加CD8 T细胞增殖(49%)相对于如果DCs(54%)(图4 (b),)。没有观察到扩散CD4和CD8 T细胞单独培养没有DCs。总之,这些数据表明,DCs岁从主题引起更激烈的T细胞反应对CPn感染与DCs从年轻的学科。

3.5。CPn-Stimulated DCs岁从捐赠者诱导增强T细胞的促炎细胞因子水平

接下来,我们决定由T细胞分泌细胞因子的本质影射CPn-stimulated DCs与年龄和年轻的学科。考虑到不同的细胞因子分泌的DCs和年轻岁捐赠者,我们预期的极化差异对Th T辅助(Th)细胞反应₁,₂Treg,届₁₇,或者T_跳频。从图确实是明显5(一个)岁、文化CPn-stimulated DCs的科目诱导更高级别()的IFN -T细胞分泌物比年轻的同行。与干扰素-岁,CPn-stimulated DCs捐助者诱导显著降低水平(,图5 (b))il - 10生产的T细胞相比,年轻的直流T细胞coculture,进一步确认CPn-stimulated DCs岁受试者显示增强的激活水平与DCs从年轻的学科。分泌IL-17的T细胞之间比较老年和年轻的主题(图5 (c))。以来我们也决定IL-21分泌il - 12的分泌通过DCs可以诱导IL-21除了干扰素-。CPn-stimulated DCs从年龄或年轻的捐赠者没有引起显著水平的IL-21和两组(图中的数据相当5 (d))。没有干扰素-il - 10, IL-17, IL-21 T细胞培养中发现没有DCs。DCs没有T细胞单独培养6天还没有分泌的细胞因子(数据没有显示)。

4所示。讨论

老年人人口据报道,是在更高的风险开发呼吸道疾病如慢性阻塞性肺病、支气管炎,和哮喘2,3]。几项研究文档的重要性持续尼共感染这些疾病的发病机理(7,26]。然而,潜在的机制并不清楚。DCs显示是至关重要的,不仅吸入性抗原致敏的,而且对建立肺部炎症(27]。在活的有机体内研究已经证明,尼泊尔共产党可以感染DCs和利用他们从肺部传播到其他器官。持续性尼共也感染诱发炎性状态在DCs (20.,21]。我们和其他人证明年龄导致DCs的功能将发生重大变革。DCs从岁受试者在他们的能力来控制炎症受损是由于减少了抗炎细胞因子的生产,例如,il - 10 [22]。这里我们报告,与年龄有关的变化在DC函数提高他们对CPn的反应。这些改变诱导炎症反应增加老年人比年轻的学科。

我们的结果与monocyte-derived DCs是按照先前的研究报道,尼泊尔共产党感染DCs诱导促炎Th1 / Th17响应通过生产的il - 12、il - 6和il - 1(28,29日]。这些研究都是利用可行的尼共虽然我们与紫外线灭活尼共的研究已经完成。之间的差异反应可行和紫外线灭活细菌不是明显的细胞因子分泌以来dc dc可以应对细菌组件。然而,可能会有其他DC功能如吞噬作用的差异。

我们没有观察表型差异DCs从年龄和年轻受试者尼共刺激。这与先前的报道是一致的,也显型DCs TLR刺激后,从年龄和年轻的主题相当(15,30.但炎性细胞因子的分泌是升高的。细胞因子的差异由DCs生产并不总是与表型的差异(31日]。在这项研究中,也从老化DCs显示增强的促炎反应在尼共刺激TNF -明显的增加、CXCL-10和il - 12和il - 10分泌的减少(数字2(一个)- - - - - -2 (d))。我们选择测定CXCL-10由于其重要的作用作为一个关键的趋化因子的招聘Th1淋巴细胞进入组织和协会也因为CXCL-10与炎症和过敏性疾病(32]。此外,通过鼻内感染的老鼠与尼共路线也在航空公司和增强炎症诱导CXCL10 [33]。CXCL-10分泌增加以及增加了DCs的il - 12岁从主题将因此提高老年人的Th1呼吸道的炎症反应。此外,肿瘤坏死因子-增加分泌的DCs岁受试者也有利于Th1反应。然而,TNF分泌,以应对在DCs尼共还能抑制细菌的生长和调节炎症通过诱导吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO) [34]。被罩在DCs的感应是一种机制来防止复制或持久性尼共感染但由于本研究使用紫外线灭活尼共执行,我们没有分析IDO的表达。调节炎症受损的DCs岁受试者由于il - 10生产应对尼共不是提升到计数器增加促炎细胞因子的生产。这是在协议与我们先前的观察也表明,刺激的DCs岁受试者与氯化锂,这是良好的il - 10在DCs诱导物,未能在DCs岁受试者表明DCs从本质上是有缺陷的生产il - 10岁(22]。

炎症反应的增加并不是因为TLR表达改变我们之前的报道指出,通常的表达与年龄相当年轻的DCs (30.]。这是与我们的基因阵列数据进一步证实了年龄和年轻的DCs (35]。基因阵列数据也没有表现出任何差异的表达TSLPR, IL-33R或ICOSL DCs相比年轻岁DCs (35]。然而,我们观察NF的改变B信号通路是类似于我们之前报道的发现(16岁],DCs主题显示NF的一个增强的基础水平B激活(16),一个主要的途径参与从DCs促炎细胞因子的生产。这种增强NFB激活在DCs岁受试者可能负责增加分泌炎性细胞因子的年龄DCs在回应通常和病原体(22,30.,36]。

有趣的是,我们也观察到类似的增强分泌TNF -、CXCL-10和il - 6和il - 10分泌减少CPn-stimulated疾控中心净化血液的老年人(数字3(一个)- - - - - -3 (d))建议增加炎症反应CPn从老人和DCs的功能不是由于单核细胞的炎症性质推导出DCs (37]。

除了il - 10, CPn-stimulated单核细胞DCs来自岁受试者也缺乏先天干扰素的生产,干扰素-和干扰素-,作为一个主要宿主抗感染防御机制(数字2 (e)和2 (f))。CPn-stimulated疾控中心从老年人的血液也显示类似的缺陷在生产干扰素-(图3 (e))。干扰素-扮演着一个重要的角色在防御呼吸道感染,如甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、SARS冠状病毒(38];然而,它的作用在尼共感染没有被调查。我们的研究结果表明,干扰素-可能是一种重要的保护性细胞因子对CPn的回应。先前的报道从我们实验室也展示了与年龄相关的干扰素的分泌——受损和干扰素-由血浆树突细胞(23)和单核细胞衍生的DCs在流感感染(19]。这表明,干扰素分泌障碍是一种内在的与年龄相关的变更,而不是与特定类型的感染有关。

先前的研究已经报道了诱导干扰素-由CPn-stimulated DCs和IL-17生产CD4 T细胞(28]。我们还观察到这两种细胞因子的分泌虽然T细胞刺激与DCs岁显示增强的增殖和分泌干扰素水平上升和降低il - 10 T细胞刺激与DCs年轻受试者(数字4(一),5(一个),5 (b))。DCs在感染的细胞因子分泌决定T细胞的增殖和细胞因子分泌(39]。il - 12的分泌31日]和CXCL-10 [32由DCs)诱发干扰素-生产的T细胞,因此增加了生产这些介质的DCs在增加干扰素-岁的结果DCs生产而增强白介素和肿瘤坏死因子的年龄可能负责增加T细胞的增殖13]。此外,降低il - 10岁的DCs生产可能会进一步帮助提高扩散和干扰素-通过T细胞(13,40]。小鼠最近的一项研究表明,il - 10 T调节细胞生产损耗,控制炎症和加剧气道炎症和致敏与尼共感染相关(41]。CD8 T细胞也报有必要清理尼共感染小鼠CD8 T细胞导致的损耗增加细菌感染负担和动力学(42]。此外,CD8 T细胞也产生干扰素-针对衣原体感染,补充了干扰素-由CD4 T细胞(43,44]。更高的干扰素-不受控制的生产CD4和CD8 T细胞在岁受试者在尼共可能因此导致的气道的炎症反应加重老年人口。

5。结论

总之,我们的数据表明,从年龄更激活和DCs分泌更高层次的炎症介质,以应对尼共但仍无法产生一个至关重要的细胞因子,如干扰素-参与预防呼吸道感染。增加炎症反应的DCs岁受试者尼共诱发一个增强的Th1反应T细胞,加重炎症。尼泊尔共产党可以参与促进老年人的慢性气道炎症。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Sangeetha普拉卡什和Sudhanshu Agrawal造成同样的纸。

承认

我们感谢ict,加州大学欧文分校提供血液从年轻的学科。

补充材料