文摘
过敏性鼻炎(AR)是一种过敏性鼻气道的炎症。基于“增大化现实”技术的患病率在世界范围内正在增加。我们调查是否Hyeonggaeyeongyo-tang (HYT)是有效抑制卵白蛋白引起的基于“增大化现实”技术的发展(卵子)。雄性BALB / c小鼠被用于这项研究。过敏性鼻炎是由卵子。治疗HYT评估研究HYT过敏性鼻炎在小鼠的影响。组织学分析、免疫组织化学、细胞因子测定多元、血液分析、细胞生存能力分析进行验证的抑制作用HYT过敏性鼻炎。HYT没有任何毒性保持体重。食物摄入量是稳定的小鼠没有变化。HYT减少炎性细胞和肥大细胞的渗透进入鼻腔。 HYT reduced the levels of cytokines and leukocytes in the blood. HYT decreased the splenocyte cell viability. Antihistamines and steroids are the most common medications used to treat allergic rhinitis. However, long-term use of drug generates resistance or side effects requiring the development of new drug. Our present study clearly demonstrates that HYT suppresses the progression of allergic rhinitis induced by OVA. This suggests that HYT might be a useful drug for the treatment of allergic rhinitis.
1。介绍
过敏性鼻炎(AR)是一种过敏性鼻气道的炎症,表现为打喷嚏、鼻塞、鼻痒、鼻液溢,在任何组合。基于“增大化现实”技术的患病率在世界范围内正在增加。基于“增大化现实”技术的影响大约有6000万人在美国和成人患病率大约是10 - 30%和近40%的孩子(1- - - - - -3]。全国问卷调查有42886朝鲜人使用儿童哮喘和过敏症的国际研究(伊萨克)问卷表明,12个月的6 - 12和12 - 15岁的基于“增大化现实”技术的分别为28.8%和29.1%,分别为(4]。
AR患者存在炎症ige 2型辅助T细胞反应的特点是过敏原(Th2)免疫模式与肥大细胞和嗜酸性粒细胞激活和释放炎症介质接触过敏原(5- - - - - -7]。过敏原是任何物质,经常食用或吸入,可以发现在各种渠道,如灰尘、花粉、和宠物皮屑。这样的过敏原(抗原)引起嗜酸性粒细胞招募到组织和增加血清IgE水平(8]。肥大细胞包含许多颗粒丰富的组胺和肝素。在过敏反应,肥大细胞成为活跃在过敏原结合IgE [9,10]。此外,不仅肥大细胞B细胞AR的发病机制中发挥重要作用[11- - - - - -16]。过敏原2型辅助T细胞(Th2)调节中发挥重要作用的IgE抗体生产B细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞。此外,IL-5 Th2分泌il - 4、il - 6, IL-13调节B细胞和嗜酸性粒细胞介导的反应,而Th1产生干扰素。Th1 / Th2细胞与一系列的免疫和炎症相关的疾病,如细菌性和病毒性传染病17,18]。T细胞介导免疫是一个重要的过程阐述抗原特异性T淋巴细胞(Ag)删除病毒,细菌,寄生虫感染或恶性肿瘤细胞。细胞毒性CD8 + T细胞是杀死被感染的T淋巴细胞,破坏,或恶性细胞轴承Ag),而CD4 + T辅助细胞产生细胞因子,可以直接毒性的靶细胞或其他可以刺激T细胞效应函数和B细胞产生抗体和动员强大的炎症机制(19]。
传统草药Hyeonggaeyeongyo-tang (HYT)是已知的治疗中耳炎、鼻窦炎、扁桃体炎、各种耳鼻喉科症状(20.]。在日本和中国,HYT称为Keigai-rengyo-to或静洁丽安俏唐,分别。然而,它的影响基于“增大化现实”技术尚未阐明。抗组胺药和类固醇是最常见的药物用于治疗AR (21]。然而,长期使用药物产生耐药性或副作用需要开发新的药物(22]。
因此,在这项研究中,我们调查的影响HYT在卵白蛋白过敏反应——(卵子)诱导小鼠AR模型。为此,我们进行组织病理学分析和肥大细胞的数量来衡量。我们也测量了水平的细胞因子在血清和血液中的白细胞水平。此外,我们评估脾细胞生存能力。
2。材料和方法
2.1。制备Hyeonggaeyeongyo-Tang (HYT)
HYT用于这项研究包含13个不同的草药:Schizonepeta穗状花序0.47克,Forsythiae果实0.47克,Saposhnikoviae基数0.93克,Angelicae Gigantis基数0.93克,Cnidii根茎0.93克,Paeoniae基数阿尔巴0.93克,Bupleuri基数0.47克,Aurantii果实0.93克,黄芩基数0.93克,Gardeniae果实0.93克,中药白芷基数0.93克,Platycodi基数0.93克,Glycyrrhizae基数0.67 g。他们由Hanpoong制药(全州,韩国)按照良好生产规范(GMP)过程。干HYT粉是存储在整除−直到进一步分析(表80°C1)。
2.2。动物
雄性BALB / c小鼠(年龄在6周)从东方购买(首尔,韩国)。老鼠的平均体重是26 g。动物们被安置在空调房12 h光/暗周期。所有的老鼠被允许自由获取食物和水。所有程序上执行老鼠庆熙大学动物保健中心的批准(批准文号KHUASP (SE) 12 - 048)。老鼠被分为五组():组1,生理盐水;组2,卵+生理盐水;组3,卵+ HYT(101毫克/公斤);4,卵+ HYT(202毫克/公斤);5,卵+ HYT(404毫克/公斤)。
2.3。敏化作用和治疗
敏实验程序和挑战在图进行了总结1。OVA-induced AR模型的建立,男6 BALB / c小鼠腹腔内致敏与25 ug的卵子每周两次三个星期。三周后,卵子组小鼠致敏的鼻内滴注法500 ug的卵子在30 uL PBS每周两次一个星期。最后,老鼠HYT一起卵巢敏化了两周。在实验结束时,老鼠被吸入二氧化碳,样本收集。
2.4。组织学分析
鼻粘膜样本立即用10%甲醛固定石蜡和嵌入。鼻粘膜的部分样本4 -μ米厚。每个部分是与苏木精和伊红染色(H & E)与甲苯胺蓝炎性细胞或(肺结核)肥大细胞计数和光学显微镜下检查(奥林巴斯)。肥大细胞和炎症细胞数10个地区的高功率领域(高通滤波器)40 x 400 x 1000 x放大。
2.5。免疫组织化学
表达CD4 +淋巴细胞被免疫组织化学检测分析使用anti-CD4 +抗体。鼻腔组织deparaffinized和水化。微波治疗后,部分接受3%过氧化氢在PBS 15分钟血液细胞的抑制内源性过氧化物酶活性。过氧化氢处理后,鼻腔部分孵化与5%牛血清白蛋白(BSA)在PBS,包含一个阻塞试剂在室温下1小时。鼻部分与鼠单克隆抗体CD4 +孵化一夜之间在4°C,随后孵化二级生物素化的anti-rabbit免疫球蛋白在室温下1 h。部分是处理avidin-biotin合复杂(Vectastain ABC工具包,向量实验室、钙、美国)30分钟在4°C和沾diaminobenzidine四氯化(DAB)作为衬底。幻灯片是安装一个水安装解决方案(DAKO、斯特鲁普、丹麦)和cover-slipped。所有的部分进行了分析使用一个奥林巴斯显微镜使用数码摄像机和图像捕获。
2.6。多路复用细胞因子测定
血清Bio-Plex多元分析的细胞因子测定(美国Bio-Rad实验室、大力神、CA)根据制造商的指示。分析阅读使用Luminex 100(奥斯汀,得克萨斯州)使用Bio-Plex管理软件和分析。平均浓度的细胞因子(il - 4、IL-13和仍在上层清液从OVA-stimulated细胞如果细胞(背景)被计算。
2.7。血液分析
通过心脏穿刺收集血液样本。真空采血管的血液被TM管包含EDTA(美国BD科学)。实际上血液处理来确定血液参数(白细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞,中性粒细胞)在950年HEMAVET血液学分析仪(科学,Inc .)、牛津)按照制造商的建议。
2.8。脾细胞
暂停从正常小鼠脾脏在无菌条件下是由同质化rpmi - 1640年中等(含10%的边后卫,1% Ab,和0.05 mM巯基乙醇)。暂停是离心机和颗粒状。污染的红细胞被利用红细胞裂解缓冲(σ,美国)。细胞被离心机和悬浮在完成rpmi - 1640。细胞被维持在37°C湿润孵化器为5%。
2.9。细胞生存能力分析
小鼠脾细胞(1×106细胞/)在96年被镀-文化板块和孵化24 h。细胞治疗反对(2 ug /毫升)或HYT(10、50、100、200、500、1000和2000 ug /毫升)。24小时孵化后,10 uL WST的解决方案是添加到每个盘子,盘子是孵化在黑暗中在37°C 2 h。光密度测量在450 nm使用ELISA板读者(VersaMax、分子器件、钙、美国)。
2.10。统计分析
所有的实验结果都表示为手段±标准差(SD)或意味着±SEM ()至少三个独立的测试。学生的以及用于单变量比较,值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。体重和食物摄入量
体重和食物摄入量监控整个研究。我们发现,正常组显示更高的重量比其他组(图2(一个))。我们还发现HYT没有任何毒性维持体重(图2(一个))。此外,食物摄入量是稳定无变化(图2 (b))。
(一)
(b)
3.2。HYT减少炎症细胞的渗透进入鼻腔
确定HYT减少炎症细胞的渗透进鼻腔,我们执行H & E染色的鼻粘膜样本。各自的数字在鼻粘膜炎症细胞AR小鼠模型被证明是高于正常小鼠。HYT减少这样的炎症细胞的渗透进鼻腔(图3(一个))。炎症细胞数量在每个条件下如图3 (b)。
(一)
(b)
3.3。HYT降低鼻粘膜肥大细胞的渗透
接下来,我们进行对肥大细胞甲苯胺蓝染色观察。肥大细胞在过敏性炎症扮演着主要角色23]。各自的鼻粘膜肥大细胞的数量在AR老鼠是高于正常小鼠。HYT减少这样的肥大细胞的渗透进鼻腔(图4(一))。HYT最低浓度显示肥大细胞的最高效果减少渗透到鼻粘膜。肥大细胞的数量在每个条件下被显示在图4 (b)。
(一)
(b)
3.4。HYT CD4 +细胞表达降低进入鼻腔
CD4 + T辅助细胞产生细胞因子能刺激其他T细胞效应函数和B细胞产生抗体(19]。我们还进行了免疫细胞化学测量细胞内水平的CD4 + T细胞(总)。我们发现卵子数量增加的CD4 + T细胞(总),而HYT减少鼻腔(图5)。
3.5。HYT降低血清中细胞因子的水平
过敏反应导致分泌各种细胞因子(23]。因此,我们测量了水平的细胞因子在多路细胞因子测定的血液样本。我们发现卵子的il - 4水平增加,IL-13,和生活,而HYT抑制这样的增加(数据6(一),6 (b),6 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.6。HYT降低血液中白细胞的水平
众所周知,过敏疾病激活嗜酸性粒细胞,中性粒细胞,单核细胞,嗜碱粒细胞、淋巴细胞24,25]。调查是否HYT抑制炎症现象,我们测量白细胞水平在950年心血管血液样本使用HEMAVET血液学分析仪。我们发现卵巢增加水平的嗜酸性粒细胞,中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、白细胞,而HYT抑制这样的增加(数据7(一),7 (b),7 (c),7 (d),7 (e),7 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.7。HYT对脾细胞生存能力的影响
最后,我们测量了HYT对脾细胞生存能力的影响。为此,我们治疗脾细胞与不同浓度的HYT(10、50、100、200、500、1000和2000 ug /毫升)和测量使用WST测定细胞生存能力。我们发现,反对增加细胞活力,而HYT减少(图8)。
4所示。讨论
在这项研究中,我们调查的影响HYT OVA-induced AR老鼠的过敏反应。增加渗透鼻腔炎症和肥大细胞在OVA-induced AR老鼠。有趣的是,HYT强烈抑制这种增长。免疫组织化学研究表明thatHYT减少数量的增加CD4 + T细胞诱导卵子。此外,各种细胞因子的诱导由于AR也抑制了HYT老鼠。
嗜酸性粒细胞的活化释放多种化学物质引起炎症和组织损伤(26,27]。各种细胞因子释放的炎症刺激(28- - - - - -30.]。我们发现卵子的il - 4水平增加,IL-13,和生活,而HYT抑制增长。我们还发现卵子增加水平的嗜酸性粒细胞,中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、白细胞,而HYT抑制这样的增加。HYT也减少了细胞脾细胞的可行性。这些数据清楚地表明,治疗AR HYT有功效。
基于“增大化现实”技术,也被称为花粉热,影响大约20%的所有年龄的人。开发基于“增大化现实”技术的风险要高得多在患有哮喘或湿疹和哮喘家族史或鼻炎的人(31日]。基于“增大化现实”技术可以在任何年龄,尽管大多数人首先出现症状在儿童或成年早期4]。症状通常是在最糟糕的儿童和30年代和40年代的人。症状的严重程度往往不同的一生中;许多人经历时间当他们没有症状32]。
基于“增大化现实”技术的治疗包括减少暴露于过敏原和其他触发器,结合药物治疗。鼻腔糖皮质激素(激素)由鼻喷雾剂是一线治疗AR的症状。然而,我们需要更有效的疗法治疗AR很少有副作用。HYT已知治疗中耳炎、鼻窦炎、扁桃体炎、各种耳鼻喉科症状(20.]。在这项研究中,我们证实HYT可以用来治疗AR。我们目前的研究清楚地表明,HYT抑制卵巢引起的基于“增大化现实”技术的进展。这表明HYT可能是一个有用的基于“增大化现实”技术的药物治疗。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
承认
这项工作是由韩国传统医学提供资助研发项目的卫生和福利部(没有。HI12C1889)。