文摘
临床研究表明thatandrogen可能与前列腺癌的浸润T细胞良性前列腺增生(BPH)患者,但细节的T细胞子集和机制仍不清楚。本研究测试的假设intraprostatic 5α二氢睾酮(DHT)施加影响T细胞良性前列腺增生上皮细胞的招募。前列腺组织从64例良性前列腺增生患者经尿道前列腺切除术(TURP)后被分为2组:(1)没有药物的历史;(2)管理5α还原酶II型inhibitor-finasteride 5毫克每日手术前至少6个月。组2提出CD8 + T细胞浸润明显高于1组,但没有改变CD4 + T细胞(免疫组化和流式细胞术)。在体外研究更多的CD8 + T细胞迁移到前列腺组织溶解产物从低DHT组2和BPH-1细胞状态。趋化因子的转录(碳碳主题)配体5 (CCL5) mRNA BPH-1细胞趋化因子受体5 (CCR5)(碳碳主题)mRNA的CD8 + T细胞调节低DHT条件(q-PCR)。CCL5表达式也发现被包含IHC高在2组前列腺组织。本研究建议intraprostatic DHT可能参与调节炎症反应而被人类前列腺上皮细胞诱导,通过调制CCL5分泌。
1。介绍
良性前列腺增生(BPH)是老年男性最常见的慢性疾病之一(1]。最强有力的男性雄激素,5α二氢睾酮(DHT),是被广泛接受的更重要比睾酮前列腺上皮细胞增殖和功能(2]。它被认为是主要由睾丸素在前列腺的作用5α还原酶酶(3]。所以治疗的支柱是5α还原酶抑制剂,双氢睾酮调节intraprostatic的水平。非那雄胺,5的竞争性抑制剂α-reductase-type II亲和力较低我型4),一直是最常用的药物管理良性前列腺增生。它显著减少intraprostatic DHT浓度(5]。5α还原酶抑制剂(非那雄胺)产生一个强大的对DHT-dependent上皮细胞凋亡的影响,但在某些良性前列腺增生患者非那雄胺不能控制症状。
迄今为止,慢性炎症被认为是另一个关键球员良性前列腺增生的发病机理和发展6]。与此同时,许多研究表明,绝大多数在BPH组织中淋巴细胞t淋巴球[7,8];长期渗透的T淋巴细胞和炎性细胞因子的分泌前列腺腺良性前列腺增生发病机理被认为是决定性因素和发展9]。不幸的是,大多数的最近的研究集中在t淋巴球和前列腺肥大细胞中分泌的促炎细胞因子(10]。t细胞浸润和免疫失调引起的前列腺仍然是争论的主题。
最重要的潜在原因免疫反应在前列腺癌前列腺微环境(11]。良性前列腺增生的上皮细胞,前列腺微环境的重要组成部分,建议作为一个关键作用诱导的免疫介导的炎症过程(12]。另一方面,intraprostatic DHT可能直接影响上皮细胞的功能13]。因此,这表明一些炎症和双氢睾酮intraprostatic之间的联系。Vignozzi et al。(2012)14)报道,intraprostatic睾酮在代谢中起着保护作用syndrome-associated前列腺炎症在兔模型。从病理生理的角度来看,一些研究显示,双氢睾酮水平之间的相关性和炎症(15),但T细胞浸润子集的细节受到良性前列腺增生上皮细胞和intraprostatic DHT基本上仍没有解决。
在目前的工作,我们之间的关系关注intraprostatic DHT水平,良性前列腺增生上皮细胞和t细胞浸润。我们进一步阐明双氢睾酮intraprostatic的趋化因子的变化在不同的水平。
2。材料和方法
2.1。材料
2.1.1。病人
患者选择通过考虑药物治疗持续时间从726年的医疗记录病人经尿道前列腺切除术(TURP) 2008年1月至2011年12月在北京大学第一医院。根据药物的历史,前列腺组织获得了由64名前列腺增生患者经尿道。患者分为两组:第1组由28个病人用药都没有α肾上腺素能阻滞剂或5α还原酶抑制剂;非那雄胺患者组2由36 5毫克每日超过六个月手术前。包括样品都没有前列腺癌病理证实为良性前列腺增生或前列腺上皮内瘤(PIN)。和患者尿路感染或前prostate-related手术或治疗尿导管被排除在研究之外。
2.1.2。试剂和抗体
单克隆抗体anti-CCL5和重组蛋白免疫球蛋白购买从研发系统(MAB678 MAB002,明尼阿波利斯,美国),和500年μg / mL股票重组在磷酸缓冲盐(PBS)。anti-CCL5治疗,股市调整的最终浓度6μ克/毫升。Ficoll-Paque购买从Amersham淀粉微球生物科技(17144002,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。胶原酶D购买从罗氏诊断(100毫克,11088858001印第安纳波利斯,美国),并调整到最后1毫克/毫升的浓度。抗体用于流式细胞术包括PE-Cy 7-conjugated鼠标反CD3抗体(341091),异硫氰酸荧光素(FITC)共轭鼠标反CD4抗体(340133),藻红蛋白(PE)共轭鼠标反CD8抗体(340046),PE-Cy 7-conjugated鼠标IgG1,κ同形像(555872),IgG1 FITC-conjugated老鼠κ同形像(555909),或IgG1 PE-conjugated老鼠κ同形像统计图(554680)。所有这些抗体流式细胞仪都是购自BD生物科学(美国新泽西州)。抗体用于免疫组织化学包括兔子anti-CD4(+)(稀释1:50,ab133616 Abcam,剑桥,英国),anti-CD8(+)(稀释1:50,rm - 9116 s1,热费希尔科学、柴郡,英国),和兔子anti-CCL5 (+) (2μg / mL, ab9679 Abcam,剑桥,英国)。
2.2。实验程序
2.2.1。血液样品制备
收集血液样本在无菌肝素化容器从6卫生人员10毫升/管。净化人类外周血单核细胞进行根据一些以前的出版物(16]。外周血单核细胞(PBMC)是由聚蔗糖密度梯度分离和血液在2000×g离心20分钟。这些细胞被洗两次磷酸缓冲盐(PBS, pH值7.2)没有钙和镁和resuspended X-VIVO 15介质(04 - 418 q, Lonza,新泽西,美国)进行进一步分析。
2.2.2。前列腺组织准备
前列腺组织准备执行的出版物描述(17]。新鲜的前列腺组织的一部分,从手术是放置在一个解决方案,1毫克/毫升胶原酶D(罗氏)RPMI 1640媒体包含10%的边后卫DNase我(20μg / mL;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。组织是切碎的约1毫米3并放置在37°C 1小时消化,通过70紧随其后μm过滤器。淋巴细胞是由聚蔗糖密度梯度分离。然后组织溶解产物过滤0.22μm过滤这些组织和6例溶菌产物从每两组中随机挑选为进一步迁移试验。另一部分的新鲜组织formalin-fixed IHC染色。
2.2.3。细胞培养
良性前列腺增生上皮细胞系,BPH-1购买从凯基生物生物技术有限公司有限公司(KG1008、新泽西、中国)和主要CD8 (+) T-lymphocytic细胞系,Molt-3 [18),从美国购买类型文化集合(美国位于马里兰州Rockville crl - 1552)和生长在rpmi - 1640媒体含有1%青霉素和链霉素,补充10%胎牛血清的边后卫。细胞系培养在5% (v / v)有限公司2湿润孵化器在37°C。BPH-1木炭中等组的细胞治疗10%炭处理胎牛血清(美国SH30068.03、Hyclone、南洛根UT) 2天,然后收集上层的BPH-1细胞收获为进一步实验。外周血单核细胞(PBMC)从人类血液分离是生长在X-VIVO 15介质(04 - 418 q, Lonza,新泽西,美国),所有进一步的实验将在2天内完成。
2.3。方法
2.3.1。免疫组织化学
确定的表达CD4和CD8细胞表面和细胞内CCL5良性前列腺增生组织,从TUR-P手术标本缓冲福尔马林固定在4%隔夜在4°C,然后在一个提升乙醇脱水系列,通常嵌入在石蜡,分段3μm。在传统deparaffinization、水化和抗原检索、内源性过氧化物酶灭活3%过氧化氢。兔子anti-CD4的主要抗体(+)(稀释1:50,Abcam) anti-CD8(+)(稀释1:50,热),和兔子anti-CCL5 (+) (2μg / mL, Abcam)被用于孵化一夜之间在4°C。与磷酸盐(PBS)洗后,主要的抗体被生物素化的二次抗体(pk - 4001,向量实验室,伯林盖姆,CA,美国)在室温下30分钟和可视化VECTASTAIN ABC过氧化物酶系统和过氧化物酶底物民建联工具包(sk - 4100、向量实验室)。
CD4 +和CD8 +细胞的最大密度定义为比值的最大核阳性细胞数量和细胞数量在100 x。这些指标平均值的两个运营商盲人和计算Image-Pro + 6.0软件(媒体控制论,罗克维尔市,医学博士,美国)。
蛋白质的表达CCL5是半定量的评估和4-tiered系统(0 - 1)弱,2温和,和3强)是使用。两个病理学家评估染色强度和最终结果是他们得分的平均值。
2.3.2。流式细胞术
进一步研究总T细胞浸润T细胞群,分析了从前列腺组织中分离出淋巴细胞流式细胞仪等对T细胞的表型特征的双色根据制造商的过程。细胞在染色resuspended缓冲区(PBS含1%胎牛血清)和彩色30分钟在4°C anti-CD3 PE-Cy 7和anti-CD4 FITC anti-CD8 PE和同形像控制抗体从BD(生物科学)。流式细胞术是一个正欲LSRII (BD生物科学);细胞被获得和数据分析使用流乔软件(BD生物科学)。然后CD4阳性的平均百分比或C8积极总T细胞中每组计算。同时,CD8 + T细胞从血液健康的人也收获了同样的方法。
2.3.3。定量聚合酶链反应
从每个细胞总RNA提取线使用试剂盒(15596 - 018年,表达载体,大岛,纽约,美国)。根据制造商的协议,1的互补脱氧核糖核酸合成μg RNA,使用高容量cDNA逆转录工具包(4368813,应用生物系统、钙、美国)。标准PCR条件包括2分钟50°C和10分钟在95°C紧随其后40周期在95°C扩展了15秒,一分钟60°C。阈值线是自动调整放大相交线放大曲线的线性部分和周期阈值(Ct)自动记录。数据规范化与GAPDH mRNA转录(管家基因)和基因表达的褶皱变化相对于正常使用ddCt方法计算。基因引物的序列设计的引物总理5软件(总理Biosoft国际,帕洛阿尔托,CA,美国),如表所示1。
2.3.4。迁移分析
检测招聘组织溶解产物和BPH-1 CD8 + T细胞的细胞,组织溶解产物或BPH-1细胞不同的治疗被镀成的下议院transwells 5μ米孔聚碳酸酯膜插入(美国3421康宁,MA)。分离的CD8 + T细胞的流式细胞术6健康人和Molt-3细胞被镀到参议院。6小时后,细胞迁移到下议院媒体收集和统计Bio-Rad TC10自动细胞计数。每个样本化验一式三份,每种情况下重复两次。
2.3.5。统计分析
统计分析连续变量配对以及与SPSS 17.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。数据分析通过单向方差分析加上Newman-Keuls测试和Mann-Whitney测试。被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。非那雄胺治疗T细胞的影响人口浸润在良性前列腺增生的前列腺组织
我们检测t细胞数量之间的渗透前列腺组织有/没有(非那雄胺治疗19]。首先,使用anti-CD4免疫组织化学分析显示,CD8 + T细胞和CD8抗体鉴定上皮周围的区域,但CD4 + T细胞在基质区域(数据1(一)和1 (b))。
(一)
(b)
(c)
此外,如图1(一)最大密度的CD8 + T细胞渗透在非那雄胺组和药物组,,他们在非那雄胺组明显高于无药物组()。然而,CD4 + T细胞浸润(图显示没有区别1 (b))。流式细胞仪数据与IHC染色是相一致的。组2的组织提出了一个更高比例的CD8阳性细胞在所有总比组织t淋巴球组1(分别为21.36%和8.78%,图1 (c))。
3.2。CD8 + T细胞迁移在体外
研究渗透之间的潜在的相声CD8 + T细胞在良性前列腺增生和前列腺上皮细胞标本(图1),我们建立了一个coculture CD8 + T细胞迁移试验模型。如数据所示2(一个)和2 (b),超过60%的CD8 + T从血液健康的人迁移到前列腺组织溶解产物的非那雄胺组。这是明显高于药物组(64.02%比10.31%)。
(一)
(b)
(c)
这些数据证实在良性前列腺增生上皮细胞系。如图2 (c),BPH-1细胞使用木炭中有更多的能力来招募Molt-3细胞()。
3.3。感应BPH-1细胞趋化因子的刺激睾酮水平的变化
大多数报道的q-PCR被用来测定趋化因子吸引相关的T细胞(20.,21从BPH-1细胞与正常和木炭的媒介。CCL5信使rna的转录BPH-1细胞低高DHT条件()比正常状态()(图3(一个))。此外,mRNA水平CCR5也是调节近三倍Molt-3细胞与BPH-1 coculture后细胞在木炭中如图3 (b)。
(一)
(b)
(c)
接下来,中断试验检测通过CCL5迁移系统的中和抗体。结果表明,屏蔽CCL5导致了Molt-3显著抑制细胞迁移对BPH-1细胞低DHT条件图3 (c)。
3.4。CCL5表达式在临床样本有/没有非那雄胺治疗
CCL5表达式在高于良性前列腺增生患者调查包含IHC染色如图4。结果表明,位于上皮区CCL5表达式。同时,免疫反应性的得分高的非那雄胺治疗组(2.79±0.26),相比没有药物治疗组(1.41±0.28)。
(一)
(b)
4所示。讨论
目前,很多研究表明,慢性炎症在BPH发展的作用。细胞因子和生长因子如白细胞介素6、IL8 IFN-r由t淋巴球,前列腺肥大细胞参与改变组织重构和增生性的增长在每个阶段的良性前列腺增生(2]。然而,很少有文献集中在BPH慢性炎症的病因学。潜在的原因包括传染性病原体,暴露于其他环境和饮食因素,激素和代谢紊乱(22]。在这项研究中,我们旨在剖析免疫反应的诱导前列腺环境因素。
据报道,70%的前列腺免疫炎性细胞由T淋巴细胞,淋巴细胞15%,和15%的巨噬细胞,肥大细胞(23(我们的unshown数据)。因此,在目前的研究中,我们集中在t细胞亚群。我们所知,非那雄胺治疗6个月意味着低intraprostatic双氢睾酮水平在这些病人24]。IHC和流式细胞术结果显示,非那雄胺治疗可能导致更多的渗透的CD8 + T细胞CD4 + T细胞。但不
IHC在这项研究结果显示CD8 + T细胞周围上皮局部地区良性前列腺增生组织。良性前列腺增生上皮在前列腺组织微环境的重要组成部分。它可以获得的能力表达II类MHC分子(25]。良性前列腺增生上皮细胞之前描述作为一个关键的细胞,来显示他们的潜在作用,诱导和维持自身免疫反应在前列腺内腺[26]。更好地研究雄激素是否能直接抑制t细胞渗透,我们执行使用BPH-1细胞和Molt-3细胞迁移试验在体外研究有/没有低雄激素的条件。数据在体外是一致的在活的有机体内包含IHC染色。
在这个研究结果表明intraprostatic DHT有很强的CD8 + T细胞的免疫抑制的影响渗透良性前列腺增生引起的上皮细胞。其他一些组织也讨论了类似的研究。Vignozzi等人强调,DHT发挥免疫调节作用对人类前列腺基质细胞,抑制他们的潜力,积极诱导和/或维持自身免疫和炎症反应27]。公园和垫片发现非那雄胺可能干扰引起的抗炎反应doxazosin doxazosin和非那雄胺治疗(28]。我们发现更多的病人和T细胞识别子集在非那雄胺治疗后前列腺组织渗透。重要的是,我们也试图找到趋化因子的关键。
进一步剖析如何BPH-1招募更多Molt-3细胞,我们应用q-PCR检查T细胞的表达在BPH-1细胞趋化因子二氢睾酮水平低有关。我们发现CCL5函数作为趋化因子在招聘中发挥重要作用的T细胞(29日)是在BPH-1细胞中表达明显高于雄激素剥夺。我们还发现,CCR5自然CCL5 coreceptor [30.在Molt-3)是调节细胞与BPH-1 coculture后细胞在低雄激素的条件。
然后CCL5表达式被确认在上述临床样本。高表达CCL5非那雄胺治疗后显示在BPH组织中免疫组织化学。重要的是,CCL5上皮周围的局部区域。在正常和良性前列腺增生前列腺组织浸润CD8 + T细胞主要是局部上皮导管(31日,32]。在此,CCL5表达式与CD8 + T细胞的分布是一致的。它表明,CCL5可能由良性前列腺增生上皮细胞分泌的趋化因子的关键anti-DHT后招募CD8 + T细胞疗法。
总之,目前的研究的最惊人的发现是DHT发挥免疫调节作用对人类前列腺上皮细胞,抑制他们的潜在积极诱导炎症反应,CCL5前列腺上皮细胞分泌的趋化因子在这个过程(图的关键5)。anti-DHT替代疗法可能会导致增加炎症前列腺组织。这可能是导致治疗失败的5α还原酶抑制剂。抗炎此外通过针对CCL5结合anti-DHT治疗BPH患者可能需要在未来。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
于风扇和帅胡锦涛同样贡献了这项工作。
确认
这项工作是由中国国家自然科学基金资助81370858。作者还要感谢泌尿道的病理学系,北京大学第一医院,提供样品支持。