文摘
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性炎症性疾病,会导致关节畸形和残疾。Icariin,自然从植物类黄酮甙孤立淫羊藿家庭,已经被证明有多种药理活性。淫羊藿抑制浓度最近的一项研究表明,在小鼠体内的胶原诱导关节炎软骨和骨骼退化。然而,机制需要进一步研究。淫羊藿降低浓度在我们目前的研究中,我们发现关节炎评分和关节炎的发病率与小鼠的水处理。Icariin抑制各种osteoclastogenic标记物的表达,如β3整合素、组织蛋白酶K和MMP9在体外。Icariin治疗小鼠中情局也导致更少数量的Th17细胞和CD4的比率下降+IL-17+细胞。缓解关节炎评分和关节炎的发病率,降低血清水平的IgG2a淫羊藿与附加IL-17政府废除了浓度引起的。淫羊藿抑制STAT3浓度此外,激活T细胞和STAT3抑制剂导致减少IL-17生产和缓解类风湿性关节炎。淫羊藿降低浓度总之,Th17细胞和抑制IL-17的生产,这有助于缓解风湿性关节炎,通过抑制STAT3激活。
1。介绍
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性炎症性疾病,导致关节畸形和残疾1]。疼痛、肿胀、僵硬和组织破坏,伴随炎性疾病造成一连串的事件开始生产和传播的炎症细胞因子(2]。高浓度的促炎细胞因子在RA患者血清和滑液流体,如白介素、引发,TNF-α,IL-17, IL-33 [3- - - - - -5]。许多这些细胞因子并非随机出席,但形成了一个网络或层次控制他们的表情。
RA影响大约1%的人口和30%的RA患者诊断在3年内成为永久残疾工作如果他们不接受医学治疗6,7]。尽管其病因尚不清楚,我们理解的细胞和分子机制,为RA的发病机制允许开发新成功的治疗类风湿性关节炎。然而,有一个持续的需要新的治疗目标不同的分子,因为大量的疾病患者保持活跃。
Icariin,自然从植物类黄酮甙孤立淫羊藿家庭,已经被证明有多种药理活性。淫羊藿显示积极作用浓度先前的研究已经表明,抑制炎症,促进心血管功能(8- - - - - -11]。此外,淫羊藿抑制浓度最近的一篇论文表明,软骨和骨骼退化小鼠胶原诱导的关节炎(12]。然而,机制需要进一步研究。
在这项研究中,我们演示了淫羊藿在调节Th17细胞浓度的至关重要的作用,减轻风湿性关节炎。Icariin减少关节炎评分和关节炎的发病率与小鼠的水处理。Icariin抑制osteoclastogenesis在活的有机体内和在体外。淫羊藿降低浓度此外,Th17细胞和抑制IL-17的生产,这有助于缓解风湿性关节炎,通过抑制STAT3激活。
2。材料和方法
2.1。动物
雄性C57BL / 6小鼠,所有年龄在4到6周,购买实验动物中心,天津大学,中国。所有试验过程检查和批准的机构在天津大学动物保健和使用委员会。
2.2。感应II型胶原诱导的关节炎(CIA)和淫羊藿。浓度治疗
感应的中情局进行了如前所述[13]。开始在中央情报局的发病,20天的小鼠服用口服,淫羊藿(25毫克/公斤)浓度与或同等体积的水12]。在其他的实验中,鼠标在活的有机体内腹腔内注射重组包括鼠标IL-17 rmIL-17(研发系统),5μg /鼠标为20天。一些动物被给予9连续腹腔内注射0.5毫克/公斤STAT3抑制剂STA-21(圣克鲁斯生物技术)在盐水中,为3周(每周3次14]。
2.3。西方墨点法
蛋白质含量是由西方墨点法。蛋白质从细胞或组织中提取分离10% SDS-polyacrylamide电泳凝胶和转移到硝化纤维素膜(皮尔斯,罗克福德,IL)。与在TBS 5%脱脂牛奶被屏蔽后3小时,孵化了膜主要抗体(0.2表示μ在4°C g / mL)一夜之间,其次是孵化HRP-conjugated二级抗体(1:5000)为3小时。β肌动蛋白是用来装载控制对比样本。
2.4。组织准备和组织学
鼠标联合组织在4%多聚甲醛固定,在EDTA脱钙骨脱钙器,在石蜡和嵌入。组织部分(5μ米)是准备和苏木精和伊红染色。共焦显微镜是用来检测对Th17细胞免疫染色,如前所述[15]。净化脾脏CD4+T细胞、脾细胞分离和孵化CD4-coated磁珠和孤立使用magnetic-activated细胞排序(mac)分离列(Miltenyi研究)。MACS-sorted CD4+细胞分类获得天真的CD4细胞通过选择+ CD25− (纯度> 97%;使用CD4 DakoCytomation)或被净化+CD62L+磁珠(Miltenyi研究)。
2.5。评价在体外Osteoclastogenesis老鼠细胞中
隔离小鼠骨骨髓来源的单核细胞/巨噬细胞细胞(BMM),破骨细胞前体细胞的分化,tartrate-resistant酸性磷酸酶(陷阱)染色,和骨吸收分析进行如前所述[16]。
2.6。实时聚合酶链反应
总RNA提取培养细胞或组织使用试剂盒(表达载体,卡尔斯巴德,CA)和反向转录成cDNA使用PrimeScript RT试剂盒(豆类生物技术、大连、中国)根据制造商的指示。目标基因的mRNA水平量化使用SYBR绿色主人混合(豆类生物技术,大连,中国)与ABI棱镜7900序列检测器系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)。每个反应是在重复执行,相对基因表达的变化归一化到18 srna水平测定使用的相对阈值周期的方法。
2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)
大量IL-17和IgG2a测量根据制造的介绍。
2.8。流式细胞术分析
从滑膜组织分离出单核细胞培养在24-well盘子RPMI1640中补充10%的边后卫,十四烷酸200 ng / mL佛波醇酯(PMA,σ,圣路易斯,密苏里州),400 ng / mL ionomycin, brefeldin(σ)4 h。细胞收获和沾FITC-anti-human CD4 4°C 30分钟。与PBS洗涤后,这些细胞被固定,permeabilized,沾染了APC-anti-IL-17或PE-anti-IL-4 (eBioscience,圣地亚哥,CA)在4°C 30分钟。Th17细胞的频率使用流式细胞仪分析血细胞计数器配备CellQuest软件(BD Pharmingen)。
2.9。统计分析
所有数据被当作意味着±SEM。双尾学生的以及统计分析的应用被认为具有统计学意义。数据分析使用棱镜软件(GraphPad软件,Inc .)。
3所示。结果
3.1。在老鼠身上Icariin抑制炎症性关节炎
我们首先研究了淫羊藿会抑制浓度是否治疗风湿性炎症和关节破坏与CIA小鼠。淫羊藿减少关节炎评分和浓度结果表明,关节炎的发病率与小鼠接受水(图1(一))。组织学检查显示,联合icariin-treated小鼠表现出较低程度的炎症,确定后40天,淫羊藿,浓度治疗相比的联合处理的水老鼠(图1 (b))。此外,IgG2a的血清水平显著降低小鼠淫羊藿(图浓度处理1 (c))。
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3.2。Icariin Th17细胞和压制IL-17减产
我们检查了CD4的数量+IL-17+Th17细胞在小鼠脾脏通过执行共焦脾脏组织的染色。结果表明,小鼠脾脏组织样本,淫羊藿显示浓度处理Th17细胞数量减少时比较小鼠脾脏组织样本和控制(图2(一个))。我们也评估IL-17的表达,这是主要的细胞因子特征Th17细胞脾细胞使用实时PCR。老鼠,淫羊藿显示浓度处理降低了表达IL-17(图2 (b))。接下来,我们检查了滑膜CD4的子集+IL-17+Th17细胞用流式细胞术。结果表明,小鼠与中央情报局,淫羊藿,浓度处理与控制,与小鼠相比深刻的滑膜Th17细胞数量减少(图2 (c))。
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接下来我们研究了淫羊藿对Th17细胞分化浓度的影响在体外。CD4+从小鼠T细胞培养在anti-CD3面前,TGF -β淫羊藿,浓度和il - 6,有或没有为72小时。我们发现在体外淫羊藿大幅降低的水平浓度治疗IL-17文化上层清液的小鼠血清和IL-17 mRNA的表达(数字3(一个)- - - - - -3 (b))。淫羊藿的mRNA水平也降低浓度治疗视黄酸受体相关孤儿核受体γt (RORγt)芳基碳氢化合物受体,干扰素调节因子4和CCL20的因素涉及Th17细胞分化(图3 (c))。
(一)
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3.3。Icariin抑制Osteoclastogenesis老鼠
破骨细胞主要是参与了RA的骨破坏。由osteoclastogenesis-supporting细胞RANKL表达是关键osteoclastogenic分子(17,18]。研究淫羊藿对浓度的影响破骨细胞的形成,我们执行陷阱染色组织切片的关节。结果表明,联合组织icariin-treated小鼠表现出明显减少破骨细胞的形成与控制老鼠的联合组织(图4(一))。
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我们下一个淫羊藿抑制破骨细胞形成浓度检验在体外。BMM细胞从正常小鼠准备,然后刺激- csf RANKL在一起。淫羊藿的浓度的细胞培养显著减少TRAP-positive细胞(图4 (b))。信使rna和蛋白质水平的各种osteoclastogenic标记,如β3整合素、组织蛋白酶K和MMP9,淫羊藿(浓度也显著减少了额外的数据4 (c)- - - - - -4 (d))。
3.4。Icariin抑制类风湿性关节炎一定程度上依赖于抑制IL-17生产
高架IL-17与RA相关。证明IL-17抑制的主要中介是抑制炎症反应与中情局icariin-treated老鼠,icariin-treated老鼠注射用重组鼠标IL-17 (rmIL-17)。结果表明,缓解关节炎评分和关节炎的发生率和降低血清水平的IgG2a淫羊藿都废除了浓度引起的额外IL-17管理局(数字5(一个)- - - - - -5 (b))。
(一)
(b)
3.5。Icariin抑制STAT3在T细胞活化在活的有机体内和在体外
我们首先研究了淫羊藿对浓度的影响在关节组织中STAT3磷酸化与中情局的老鼠。淫羊藿抑制浓度蛋白免疫印迹表明STAT3磷酸化与中央情报局(图滑膜组织的老鼠6(一))。接下来,在体外测试使用T细胞执行来自天真C57BL / 6小鼠淋巴结细胞。的磷酸化STAT3在il - 6的刺激,通常与Th17细胞分化有关,淫羊藿(图浓度也抑制了6 (b))。
(一)
(b)
3.6。STAT3抑制剂抑制IL-17生产与CIA小鼠
我们进一步研究STAT3抑制剂是否会抑制IL-17生产与CIA小鼠。结果表明,抑制STAT3减少关节炎评分和关节炎的发病率与小鼠的治疗控制(图7(一))。IgG2a明显降低小鼠的血清处理STAT3抑制剂(图7 (b))。此外,STAT3抑制剂也显著减少IL-17表达式与CIA小鼠(数字7 (c)- - - - - -7 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
我们目前的研究表明,淫羊藿在调节Th17细胞浓度的至关重要的作用,减轻风湿性关节炎。Icariin减少关节炎评分和关节炎的发病率与小鼠的水处理。Icariin抑制osteoclastogenesis在活的有机体内和在体外。淫羊藿降低浓度此外,Th17细胞和抑制IL-17的生产,这有助于缓解类风湿性关节炎通过抑制STAT3激活。
组织蛋白酶K,半胱氨酸蛋白酶活性在酸性pH值,在破骨细胞是最丰富的胶原酶,和它的过度表达在骨和软骨被发现导致骨质疏松症和关节炎,分别。先前的论文表明,组织蛋白酶K基因的超表达导致进步的滑膜炎,加重关节软骨和骨破坏(19,20.]。Icariin,组织蛋白酶K抑制剂(12),减少破骨细胞的形成在活的有机体内和在体外在我们当前的研究。这是符合以前的报告表明抑制组织蛋白酶K减少骨骼和软骨降解胶原诱导关节炎诱发的小鼠(21]。
风湿性关节炎的最重要的特征之一是强化失控的炎症。管理控制炎症可以防止疾病进展,这将是RA治疗的最优策略。一个直接的战略目标是致病性炎性细胞因子。白介素- 17 (IL)是IL-17家族的一员,其中包括6个结构相关亚型:IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D IL-17E, IL-17F。IL-17A被不同的分泌细胞,包括Th17细胞,γδT细胞、NK细胞、NKT细胞和中性粒细胞。IL-17A是中性粒细胞招募和迁移的关键中介通过感应粒细胞生成和中性粒细胞趋化因子。il - 6是一个关键IL-17生产的监管机构,而它能抑制调节性T细胞(22]。IL-23各炎性疾病中扮演着重要的角色,它可以促进IL-17生产以及il - 22生成和IL-17由Th17细胞。IL-17A,加强TNF-α促进活化的成纤维细胞和软骨细胞,目前针对临床试验(23]。在我们的研究结果表明抑制Th17细胞分化在活的有机体内和在体外淫羊藿。浓度与治疗缓解关节炎评分和关节炎的发病率,淫羊藿与附加IL-17政府废除了浓度引起的。淫羊藿缓解RA浓度这些表明,至少在一定程度上依赖于抑制IL-17生产。
的磷酸化STAT3被认为是制约IL-17生产的关键(24,25]。IL-17参与炎性疾病的病理生理学要求特定的细胞因子和转录因子的分化。STAT3被激活和木菠萝的磷酸化。激活STAT-3把到细胞核,然后促进ROR的转录γt, Th17细胞的重要转录因子。也调节IL-17的表达、IL-21 IL-23R,所有这些都重要,Th17细胞的效应函数。此外,过度表达IL-17 STAT3信号通路的激活。因此,形成一个相互关联的循环RA炎症因子,IL-17, STAT3信号通路,IL-17-related细胞因子,可以相互影响,促进风湿性关节炎的发展。因此,缺乏STAT-3 CD4的老鼠+T细胞不能产生Th17细胞和对自身免疫的动物模型26,27]。淫羊藿抑制STAT3浓度在我们目前的研究中,激活在活的有机体内和在体外。此外,STAT3抑制剂显著抑制IL-17生产和减毒关节炎评分和关节炎的发病率。所有这些淫羊藿缓解RA和抑制浓度证明Th17分化至少部分是通过抑制STAT3激活。
总之,我们的研究提供了证据,淫羊藿调节Th17细胞浓度,减轻风湿性关节炎。Icariin减少关节炎评分和关节炎的发病率与小鼠的水处理。Icariin抑制osteoclastogenesis在活的有机体内和在体外。淫羊藿降低浓度此外,Th17细胞和压制生产IL-17,有助于缓解类风湿性关节炎,通过抑制STAT3激活。我们的研究识别未知的免疫,淫羊藿Th17细胞分化和RA浓度的作用。虽然还需要进一步的调查来充分阐明精确的分子和细胞机制参与免疫调节,icariin可能减弱RA的新目标。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。