文摘

背景。矩阵metalloproteinase-9 (MMP-9),由组织抑制剂metalloproteinase-9 (TIMP-1)和细胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN),导致斑块不稳定。自体干细胞从骨髓(mBMC)治疗建议减少心肌损伤;然而,有限的数据存在于mBMC对基质金属蛋白酶的影响。目的。我们调查的影响mBMC MMP-9循环水平,TIMP-1, EMMPRIN在不同时间点纳入随机自体干细胞移植的患者在急性心肌梗死(ASTAMI)试验( )。基因表达分析另外执行。结果。2 - 3周后,我们观察到明显增加MMP-9 mBMC组的水平,相对于控件( ),而EMMPRIN水平从基线减少到2 - 3周,3个月两组( )。基因表达MMP-9和EMMPRIN减少从基线到3个月。MMP-9和EMMPRIN显著相关心肌损伤(CK: 和 、职责)和梗塞大小(SPECT: 和 、职责)。结论。结果表明,金属蛋白酶是重要的在AMI的规定,然而,mBMC影响有限。

1。介绍

早期和晚期急性心肌梗死(AMI)后死亡率下降,但心血管疾病(CVD)仍是发病和死亡的主要原因之一,在西方世界。缺血性心脏病是一种担心,但往往不可避免的动脉粥样硬化的并发症,心肌梗死的主要根本原因(1,2]。炎症被认为是动脉粥样硬化的一个关键的发展过程,这包括一定数量的细胞和分子反应导致斑块的形成(2,3]。尽管证据确凿的治疗AMI的幸存者,医学和经皮冠状动脉介入(PCI),有些病人不接受这种治疗,不能很好地反应,或治疗后仍然出现充血性心力衰竭。

一些动物研究表明骨髓干细胞分化为心肌细胞影响心肌[注入4]。自体骨髓干细胞治疗被建议减少AMI患者心肌损害。临床试验的结果,然而,冲突对改善左心室射血分数(5- - - - - -10]。自体骨髓干细胞行为的可能机制进行了讨论心脏分化转移,旁分泌作用,血管生成,减少细胞凋亡(11,12]。

基质金属蛋白酶(MMPs),一类24肽链内切酶,降解细胞外基质而参与斑块不稳定。MMP-9, zinc-dependent白明胶酶,发现肩膀的斑块,导致plack不稳定和破裂,并与急性冠脉综合征(ACS) (3,13]。循环MMP-9已被证明是AMI患者升高,稳定,不稳定心绞痛(13,14),以及高血压药物(15和吸烟者16]。此外,MMP-9参与讨论相关不良左心室重塑和更高的心血管风险评分(13]。基质金属蛋白酶是由特定的内源性抑制剂,的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)和MMP-9专门监管当pro-MMP-9结合TIMP-1 [14,17]。

最近,细胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN CD147)、免疫球蛋白超家族的一员,参与讨论的表达和释放MMP-9 [18),因此,有一个潜在的监管在心血管疾病中的作用。EMMPRIN表达在动脉粥样硬化斑块(已被证明是19)以及细胞如单核细胞、巨噬细胞和血小板(20.]。

在人类中,有限的数据存在于骨髓干细胞对基质金属蛋白酶的影响可能和心肌梗死的重要过程。在“随机自体干细胞移植在急性心肌梗塞”(ASTAMI)试验10),主要目的是评估的影响冠脉内注射自体骨骨髓来源单核细胞(mBMC) st段抬高心肌梗死患者左心室射血分数肝素)。主要的假设是这样的治疗会减少梗塞后遗症,无法证明,然而,(10]。

的目的ASTAMI substudy的影响是研究冠状动脉注射mBMC MMP-9, TIMP-1, EMMPRIN,循环水平以及基因表达在白细胞,STEMI患者接受PCI成功。此外,调查之间的任何关联测量生物标志物和梗塞大小和左心室功能,我们的假设是,MMP-9水平将会降低mBMC治疗后,与减少EMMPRIN。

2。材料和方法

2.1。主题和研究设计

ASTAMI研究设计和治疗协议之前已经被描述在细节21]。简单地说,这是一个随机1:1项研究,其中一个手臂与mBMC内治疗,和其他控件没有愿望和注入骨髓。患者,年龄在40至75年之间,性别都包括在内。他们都接受PCI与支架植入在左前降枝冠状动脉(小伙子)。

排除标准是之前q波性梗塞、心原性休克或严重疾病干扰遵守协议。

AMI后4 - 5天,期间基线记录进行骨髓前愿望(治疗组)(10]。

研究方案,包括生物,是区域性医学研究伦理委员会批准,所有病人写,知情同意。这项研究是在ClinicalTrials.gov注册,NCT 00199823。

2.2。实验室方法
2.2.1。血液采样

生物,保持在−80°C组成的血浆,血清,和PaxGene管(Hombrechtikon PreAnalytiX GmbH, CH),后者在循环白细胞基因表达的措施,成立。收集血液样本在禁食条件下在08.00和10.00之间是移植前一天mBMC组(普通人)(基线),第二天(第一天)和进一步的第三天,后2 - 3周,3个月后。相同的时间间隔是用于对照组,除了基线抽样(普通人)是中位数4天后PCI mBMC组相比,5天。

2.2.2。酶免疫测定

为分析MMP-9 TIMP-1, EMMPRIN商业酶联免疫吸附测定(ELISA)(研发系统欧洲,阿宾顿,英国牛津版)是用于血清样本,由离心1小时内执行在室温下2500 g×10分钟。interassay的变异系数(CV) 7.3% MMP-9, EMMPRIN TIMP-1为4.4%,5.4%。

2.2.3。基因表达分析

隔离的RNA PaxGene管根据制造商执行指令(PreAnalytix、试剂盒GmbH德国)在一个随机选择的样本子集( ),一个额外的清洗步骤(Rneasy MinElute清理设备,试剂盒)。互补DNA(互补)的信使核糖核酸(mRNA)内容是通过反向转录总RNA样本。信使rna的基因表达MMP-9和EMMPRIN是由使用实时PCR ViiA 7实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)和 方法应用(22]。这个相对或比较Ct方法决定了相对目标数量(RQ-values)样本,通过测量目标的放大(跨越门槛Ct)样品和参考样本和规范化内生控制(辅助基因)。分析目标基因的Hs00234579_m1 MMP-9, Hs00936295_m1 EMMPRIN,β2巨球蛋白(Hs99999907_m1)被选为辅助的基因。

2.2.4。心肌功能的措施

左心室射血分数(LVEF)和梗塞大小是通过electrocardiogram-gated单光子发射计算机断层扫描(SPECT)与4 d-mspect软件)(GE医疗系统基线AMI后(4.0±1.4天)。梗塞大小LAD-area的百分数表示。

2.3。统计分析

MMP-9、TIMP-1 EMMPRIN水平都倾斜分布和非参数统计中使用。中间值和25和75百分位数,除非另有说明。组比较Mann-Whitney测试是用于连续数据和分类数据的x平方分布检验。弗里德曼测试进行分析组内的任何时间点之间的区别。从基线的变化(普通人)随后的时间点,Wilcoxon测试使用只有当弗里德曼测试是重要的。随机的组之间的差异变化,Mann-Whitney测试使用。斯皮尔曼的ρ是用于关联分析。将水平的意义 。使用SPSS软件包版本18.0。

3所示。结果

根据随机的基线特征研究的人口群体如表所示1。

表1
根据随机特征研究的人口群体。值表示为比例,意味着±SD,或中位数1第25和第75百分位数。

一百例患者纳入ASTAMI研究50 50个随机mBMC治疗和控制,跟踪。从一个病人我们没有获得血液样本。关于基线特征组没有差别。他们都是根据当前医学上治疗指南,因此,所有患者他汀类药物,β-阻断血管紧张素转换酶抑制剂/ ATII拮抗剂和抗血栓形成的代理。

3.1。基质金属蛋白酶的循环水平(表2)
表2
循环水平的MMP-9、TIMP-1 EMMPRIN在随机的基线和随访组。中位值(第25和第75百分位数)。

尽管在基线是一天后获得血液样本(中位数)从症状开始AMI mBMC组控制相比,在基线记录组之间无显著差异(普通人)。在MMP-9没有差异,TIMP-1或EMMPRIN mBMC组和对照组之间在任何进一步的时间点。

mBMC组有显著增加MMP-9水平从基线到2 - 3周( ),这不能证明在对照组。我们观察到没有在集团TIMP-1水平变化。EMMPRIN从基线水平显著降低2 - 3周,3个月两组( ,所有)。

在分析组之间的差异变化从基线到进一步的时间点,我们可以证明MMP-9水平的变化之间的显著差异在2 - 3周,3个月后,两组表现出更明显增加mBMC集团( 和 、职责)。组之间没有差异变化观察TIMP-1和EMMPRIN。

3.2。基因表达水平

我们观察到两组之间没有MMP-9基因表达的差异在任何时间点,而EMMPRIN基因表达显著低于mBMC集团( )和控制( )3个月后( )(表3)。MMP-9和EMMPRIN基因表达的水平显著降低从基线到3个月的mBMC集团( 和 、职责)。这不能证明在对照组。不过,两组之间没有差异变化从基线到任何后来的时间点。当定义基准mRNA水平(RQ-values)总人口为1时,有20%的减少MMP-9基因表达从基线到2 - 3周,3个月后,减少了50%的mBMC组。类似的模式被认为在EMMPRIN基因表达,降低20%后2 - 3周,3个月后减少60% mBMC组。基因表达的结果表现为褶皱变化见图1。

表3
基因表达的水平,RQ MMP-9值,EMMPRIN在基线和随访。
(一)
(一)
(b)
(b)
图1
基因表达的MMP-9 (a)和EMMPRIN (b)后2 - 3周,3个月mBMC组和控制相对于基线总人口的表达式。黑条:组在基线;灰色酒吧:mBMC组;白酒吧:控制。*表示减少从基线到mBMC组的3个月 值是指相对于基线组间的差异表达。
3.3。相关性

在总人口中基线MMP-9和EMMPRIN(我们观察到显著的相关性 , )。很强的相关性之间也显示MMP-9和TIMP-1 ( , TIMP-1和EMMPRIN(之间),也 , )。重要的CK和基线水平之间的相关性MMP-9和EMMPRIN被发现( 和 、职责)。MMP-9 EMMPRIN,但不是TIMP-1,显示也显著相关性梗塞大小衡量SPECT ( , 和 、职责)。EMMPRIN水平还发现在基线(LVEF指数呈现负相关 )。

我们观察到循环MMP-9之间没有显著的相关性和基因表达的MMP-9总人口在任何时间点,或在单个组。同样没有循环的EMMPRIN EMMPRIN和基因表达之间的相关性,或EMMPRIN和MMP-9水平基因表达之间的团体或总人口。

4所示。讨论

本研究的主要发现是,有限的影响冠脉内注射mBMC AMI后移植MMP-9循环水平,TIMP-1, EMMPRIN,除了增加更明显MMP-9 mBMC组的2 - 3周后。EMMPRIN水平减少2 - 3周,3个月后两组。在基线MMP-9和EMMPRIN都显著相关生物标志物和梗死心肌损伤评估,大小和可能因此支持predictory能力为以后的结果。

所有患者治疗医学根据当前的指导方针;因此,任何影响药物在测量变量随机组也同样受到影响。

在这两个在体外和在活的有机体内研究,干细胞移植已被证明会降低AMI后基质金属蛋白酶,改善心室重构(23]。我们的假设是因此mBMC治疗将减少的循环水平选择的生物标志物。在一项研究中,使用改进后的间充质干细胞移植到AMI大鼠心(24),减少MMP-9水平了。间充质干细胞是多能的间质细胞,可以分化成多种细胞类型(25),结果并没有完全与我们的。另外,干细胞注入了AMI后一小时。相比之下,我们发现更明显增加MMP-9水平从基线到2 - 3周mBMC组相比,控制。依照我们的发现Roderfelt等人展示了一种瞬态的炎症反应和upregulation MMP-9骨髓移植后的活动Abcb4−−/(肝纤维化)老鼠26]。我们先前已经表明MMP-9水平降低AMI后1天(27]。因此我们假设水平基线时归一化取样本研究和有限的执行受到急性期反应的影响。在我们的研究中,对照组骨髓愿望没有执行。这个过程本身是一个创伤可能影响炎症标记物的释放和促进高浓度mBMC组。

在蜀等人的研究使用间充质干细胞移植,TIMP-1水平没有发生显著的变化(24),这是按照我们的发现没有这个变量的变化的观察期间的任何组。

基因表达的显著减少MMP-9在3个月可能讨论补偿增加循环水平的观察。MMP-9表达式是一个至关重要的致病特性在各种条件和疾病状态,也非心血管疾病(28- - - - - -30.),用干细胞治疗可以抑制或下调MMP-9表达式(30.),从而改善当前的状况。

底层机制的干细胞对基质金属蛋白酶的影响并不明确。在细胞培养中王的心脏成纤维细胞et al。31日)可以证明MMP-2的蛋白表达和活动,但不是MMP-9时增加缺氧和减少cocultured间充质干细胞。它也表明,早期内皮祖细胞增加MMP-9表达式在体外结果,而MMP-2增加内皮细胞(32]。干细胞的类型似乎是重要的关于对基质金属蛋白酶的影响程度(33]。

EMMPRIN作为诱导物的重要性MMP-9人类一直在探索在一定程度上。在我们的研究中循环水平MMP-9和EMMPRIN显著相关,表明一个共同的监管途径(18]。EMMPRIN的循环水平以及基因表达显著降低MMP-9随着增加。这可能是讨论作为一个负面的反馈机制。然而,不影响mBMC EMMPRIN循环水平或基因表达,显示两组显著减少的观察期间。表达式的EMMPRIN-gene循环白细胞,也报道了许等人评估通过流式细胞术(34),可能表明白细胞导致循环水平,尽管没有观察循环水平和基因表达之间的相关性。EMMPRIN表达随时间减少,随后减少MMP-9基因表达,导致假设EMMPRIN是MMP-9的诱导物。

之间的显著相关性发现MMP-9和EMMPRIN和心肌损伤的生物标志物评估梗塞大小衡量SPECT,人类一直在探索稀疏。在实验AMI, MMP-9被证明能增加梗死大小和左心室纤维化(13),按照我们的发现。

EMMPRIN与心肌损伤程度和LVEF曾被报道在聂et al。35),但这是一个事后剖析免疫组织化学研究中显示出强劲增长EMMPRIN在AMI组的坏死区周围。这在某种程度上可以相比,我们的发现AMI的基质金属蛋白酶和生物标志物之间的相关性以及我们的结果的逆EMMPRIN与LVEF之间的相关性。一个额外的贡献已经证明了这种理解CD147+ /−老鼠,破坏EMMPRIN-Cyclophilin互动减少梗塞大小(36]。我们的发现有助于建议EMMPRIN表达的是一个决定性因素在调节MMP-9活动,从而参与心肌重构。

本研究是随机的强度设计、概要的测定,而频繁的样本集合,和基因表达分析在一个相对较大的族群。所有患者治疗医学根据当前的指导方针;因此任何影响药物在测量变量因此会随机的组。

一个限制是,没有在对照组骨髓愿望。然而,在基线两组之间没有显著差异,也就是说,在骨髓mBMC组的愿望。应该注意的是,循环MMP-9的措施和TIMP-1进行血清中,也用于其他研究。释放的蛋白质在血小板活化凝血过程中,因此,测量水平不能反映“真正”的循环水平。然而,同样的标准化程序血清制备应用在整个研究中,因此我们假设随机组织之间的比较有限的影响。基于等离子体样品确认我们的结果是十分必要的。从文学既有一致的结果,而不是在使用血浆或血清样本,因此,重要的是要考虑到这个结果进行对比研究。全血的基因表达分析循环白细胞作为RNA来源,这可能不是最MMP-9或EMMPRIN的重要来源。

当执行干细胞移植作为治疗方案,几项研究已经探讨了时间、类型的干细胞,移植的程序优化的结果37,38),但尚未得出结论。

5。结论

有限的影响冠状动脉内注射mBMC移植循环水平以及基因表达MMP-9和EMMPRIN STEMI患者接受PCI可以证明。EMMPRIN两组水平相对较低,而MMP-9显示增加mBMC组水平。MMP-9和EMMPRIN心肌损伤和梗塞大小显著相关,表明金属蛋白酶的规定在AMI的过程中是很重要的。结果有助于理解病理生理学的金属蛋白酶在AMI,但还需要进一步的调查关于时间和类型的干细胞。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Eline Bredal辅仁贡献在协议的发展研究中,实验室分析,统计数据,准备,和讨论。三位一体鲍尔Opstad导致实验室分析、统计、评估结果和讨论。Svein Solheim发展中研究了协议,包含病人,和讨论。公司Lunde发展中研究了协议,包含病人,和讨论。哈拉尔德阿内森发展中研究了协议,评估研究结果,讨论论文。Ingebjørg Seljeflot发展中研究了协议,评估研究结果,讨论论文。

确认

斯坦Erik毫米基金会支持的研究为临床心脏研究,奥斯陆,挪威。作者感谢Vibeke Bratseth贡献实验室分析。