文摘
Upregulation骨桥蛋白(OPN)是一种中枢神经系统疾病的特征。然而,OPN在炎症中的作用仍有争议,因为它可以防止细胞死亡和诱发潜在的破坏性炎症细胞的迁移。理解OPN在炎症和细胞生存的作用,我们OPN表达,利用一个adenoviral向量,在老鼠的caudoputamen缺乏OPN,使用苷(β加-)表达矢量控制。组织病理学和促炎基因的表达比较两种治疗方法。有趣的是,炎性浸润OPN-vector时才发现结合外围治疗百日咳毒素(Ptx),激活周边细胞OPN受体CD44v6表达。相对于β加,OPN增加炎症标记物的水平,包括IL13Rα1、CXCR3和CD40L。在Ptx-treated OPN科斯,凋亡TUNEL +周围细胞OPN表达网站增加,相比β加。在一起,这些结果表明,当地OPN表达结合外围炎症刺激,如Ptx,可能涉及的开发脑部炎症和诱导细胞死亡,使细胞毒性的分子模式特征。这些是中枢神经系统的炎症病理特征中OPN upregulation是一个标志。
1。介绍
一些中枢神经系统(CNS)障碍,比如在多发性硬化症(MS)、病毒性脑炎,帕金森病(PD),和其他(1- - - - - -8),是高度与炎症有关,干扰素(IFN)和IFN-mediated基因。在先前的研究中,使用neuroAIDS的非人灵长类动物模型,我们研究基因的表达模式相关的中枢神经系统炎症发病机制和认知功能障碍的信号(2]。在十大最调节基因,骨桥蛋白(OPN),也被称为分泌磷蛋白质1 (Spp1),提高了我们的兴趣,因为它出现在密切联系与浸润的巨噬细胞(2),还因为它已被确认在其他中枢神经系统疾病(1- - - - - -8]。我们已经证实的能力吸引炎症细胞OPN表达OPN受体CD44,小鼠模型的外围细胞迁移(9]。neuroAIDS猕猴模型中,有趣的是,brain-infiltrating巨噬细胞表达CD44的变种,CD44v6,的一个主要OPN受体(10),已被证明是一个潜在的生物标志物的中枢神经系统炎症11]。在neuroAIDS, OPN的积累被认为参与大脑中的巨噬细胞通过阻止再循环和保护炎症细胞凋亡(12]。然而,OPN的对比机制促使炎症在大脑中,一直缺乏研究。这里,我们开发了一个小鼠模型来评估当地的能力推动OPN诱导炎性环境和调查促炎的需求是受大脑组织中OPN的影响。
众所周知,OPN在中枢神经系统调节先天和适应性免疫反应和身体其它部位的13]。Arg-Gly-Asp——(RGD)含有酸性糖蛋白,激活巨噬细胞的主要产品之一14),这有助于这些细胞参与炎症过程中细胞附件运动性(15- - - - - -17]。OPN与CD44在细胞表面RGD-independent的方式(18)主要调节巨噬细胞迁移以及激活(19- - - - - -22]。
尽管多个证据表明线将OPN与大脑脑病和中枢神经系统炎症,这个分子的作用仍有争议,OPN在组织修复过程中也发现了(23]。此外,细胞机制和途径受OPN是知之甚少,对这些机制的理解是复杂的复杂性的炎性环境的背景下,各种病态。
为了进一步研究OPN在脑损伤和炎症发病机制中的作用,我们开发了一个在活的有机体内系统OPN的表达是本地驱动使用adenoviral交付OPN的大脑有缺陷的动物。这个系统允许最初的识别分子要求由当地OPN的表达有利于炎症浸润。这些分子提供洞察潜在的发病机制和神经毒性可能由OPN的中枢神经系统病变。
2。材料和方法
2.1。老鼠
OPN缺陷小鼠(B6.129S6 (Cg)从杰克逊实验室/ J)得到(巴尔港,我;股票# 004936),在斯克里普斯研究所的培育。PCR证实了基因型分析。所有的动物都被安置在一个特定的无菌设施chow无限制地水和实验室。TSRI机构批准的实验动物使用和保健委员会进行了我们的研究所和按照动物保健机构的指导方针政策。
2.2。腺病毒的结构
互补脱氧核糖核酸质粒携带OPN或β加编码序列从开放的生物系统,购买生活技术(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。OPN序列对应于“a”等位基因中发现B6和BALB / c小鼠(加入基因库BC057858) (24]。序列克隆和表达分析由cDNA pCMV-SPORT6。蛋白表达在HEK293实现。OPN的表达被免疫印迹证实在上层清液,使用anti-mouse骨桥蛋白(克隆O-17、IBL、日本)。测序DNA质粒用于adenoviral载体建设,这是由向量生物学实验室(费城,宾夕法尼亚州,美国)。
2.3。注射
麻醉动物被注射毫米2和2.0毫米侧中线,caudoputamen stereotactically定义为的区域,在纹状体背侧区(参考p56,冠状)。注射部位是在中线之间的耳朵和眼睛。病毒注射pfu 2 uL的无菌PBS含有3%伊文思蓝(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国),以允许注射部位的定位和解决再现性。24小时后动物收到300 ng Ptx溶解在盐水,独自或生理盐水,腹腔内。6天后,大脑灌注收获来自动物。侧叶,以及颈深淋巴结,被用作within-animal控制。β-gal-injected动物作为群体间的控制。
2.4。探测的发展
做一个调查原位杂交,扩大了410个基点的OPN序列PCR使用引物5′-TAGGGTCTAGGACTAGCTTG-3′, 5′AATCGTCCCTACAGTCGATG-3′。片段的分子克隆pCR 2.1威尼斯平底渔船助教。由此产生的质粒被消化和BamH XhoI subcloned pBS SK +。纯化DNA线性化与XhoI(反义)或BamH(感觉),纯化,放射性标记原位杂交(如前所述)(25]。
2.5。原位杂交、免疫组织化学、组织学和细胞凋亡量化
灌注后动物PBS包含5毫米的EDTA (Gibco生活技术,大岛,纽约,美国),大脑分为实验(侧)和控制(侧)半球,缓冲福尔马林固定在10%或Carnoy的固定剂,其次是70%的乙醇。组织是嵌入在石蜡,切成7μm部分,安装在玻璃幻灯片。患者部分被苏木精和伊红染色或接受原位杂交和免疫组织化学染色程序。免疫组织化学、内源性过氧化物酶活性被过氧化氢处理3%无水甲醇。下面,热处理为0.01 M柠檬酸pH值6.39进行抗原暴露。部分被封锁5 g / L酪蛋白在PBS(西格玛奥德里奇),包含0.5 g / L硫柳汞(西格玛奥德里奇)和孵化与主抗体稀释在同一个缓冲区。抗体是针对F4/80 (eBioscience、圣地亚哥、钙、美国),Iba-1 (Wako化工,里士满,弗吉尼亚州,美国)和Mac-3 (eBioscience)。生物素化的二次抗体(山羊anti-rabbit免疫球蛋白或鼠抗体免疫球蛋白,向量实验室,伯林盖姆,CA,美国)在1/300稀释使用。可视化是通过使用生物素/ avidin-peroxidase实验室(向量)和新星红色(向量实验室)。对比染色是由吉尔的苏木精。TUNEL染色,石蜡包埋部分被标记为根据原位细胞死亡检测设备(美国罗氏应用科学,Indianopolis)协议。计算TUNEL +细胞的数量都使用了Abercrombie校正因子(26- - - - - -28),如下所示。彩色7μ与间隔3米部分,减少从病变的首次发现,直到结束(5 - 7节),检查在一个60 x放大。计算框架定义了周边的病变长度和宽度两个维度。总细胞部分也计算在内。阳性细胞的数量计算框架确定使用公式,在那里是TUNEL +积极核的数量分节,是部分的数量平均的维护,是见过的细胞核数量的原油数量在整个部分,厚度(在吗μ(7米)的部分μ米),平均长度(μ米)的原子核(7μ米)。
为原位杂交、formalin-fixed石蜡包埋水化部分准备如上所述,在柠檬酸缓冲与热处理;然后,部分是培养1小时42岁到46°C prehybridization缓冲区(50%,甲酰胺0.3 M氯化钠,20毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值8日5毫米乙二胺四乙酸,1 M Denhardt的解决方案,10毫米二硫苏糖醇,丙二酸二乙酯和10%硫酸葡聚糖pyrocarbonate-treated水)和杂化cpm放射性标记的探针,如上所述,在同一个缓冲区42一夜之间46°C。控制包括探针。杂交后的部分被清洗,处理与核糖核酸酶和沾Iba-1抗体,如上所述,除了执行衬底发展由HistoMark橙色(美国马里兰州盖瑟斯堡KPL,,)。幻灯片被洗,脱水,vacuum-dried,涂以柯达NTB2乳液(美国伊士曼柯达公司,罗彻斯特,纽约)。幻灯片是在黑暗中就离开了10天前发展(柯达D19)和修复(柯达“调停者”)(美国伊士曼柯达公司,罗彻斯特,纽约),紧随其后的是对比染色与甲基绿(西格玛奥德里奇),与异丙醇脱水,增加。
2.6。大脑细胞悬浮液
个人的大脑被迫通过70年μm尼龙筛,离心收集的剥离,材料在470 g×15分钟在4°C。上层清液吸气,每个颗粒被带到最后一卷,与哈佛商学院10毫升,之后28 U /毫升DNase我和500 U /毫升的胶原酶二世被添加。消化了在37°C的摇晃水浴1 h。之后,这些细胞被颗粒状在470 g×10分钟,然后洗包含1% FCS在哈佛商学院。细胞颗粒resuspended在2.1毫升的1.122 g / mL Percoll(美国通用电气医疗集团生物科技、匹兹堡、PA)解决方案,把最后一个体积与哈佛商学院10毫升,导致1.033 g / mL Percoll。3毫升的1.088 g / mL Percoll衬底,这个梯度是离心机在1200 g×20分钟20°C。1.033/1.088的细胞界面收集,清洗,量化在血细胞计数器。
2.7。检测T细胞和巨噬细胞浸润
细胞分离所述被沾染了50μL混合物的抗体稀释根据先前在染色滴定缓冲区(hbs南FCS为2%和0.01%3)。反对使用的抗体CD11b (eBioscience、圣地亚哥、钙、美国),CD4(美国BD生物科学,圣何塞,CA)和CD8 (BD生物科学)。匹配的同形像控件(BD生物科学)也被使用。细胞被处理通过FACScalibur流式细胞分析仪(BD生物科学)和分析与FlowJo 6.2.1软件(美国或树明星,亚什兰)。
2.8。RNA提取和存在OPN和趋化因子检测
总RNA纯化2毫米3段caudoputamen,包含OPN的网站或β加向量注射,使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)制造商的协议后,与一个额外的离心步骤去除细胞碎片。RNA进一步纯化(RNeasy迷你设备;试剂盒,瓦伦西亚、钙、美国),和总RNA的数量评估Nanodrop nd - 1000分光光度计(Nanodrop;美国威尔明顿,德)。互补脱氧核糖核酸是获得使用RT2第一链cDNA工具包(试剂盒)和一组84个基因参与炎症反应,包括趋化因子和受体(pamm - 022 z,试剂盒)(见补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/358218对所有的分子除了OPN)进行测试。7900年ABI PCR进行ht快速实时PCR仪(美国应用生物系统公司、大岛,纽约)。
2.9。统计数据
双向方差分析,其次是Bonferroni的测试,使用棱镜软件执行(Graphpad软件、圣地亚哥、钙、美国)。在比较中存在测量进行使用PCR数组数据分析软件(试剂盒)。部分进行注射叶6动物每组。流式细胞仪实验动物在6 /组。在两个独立的实验中存在数组进行6动物的解剖病变网站每组和一式三份。统计分析包括(a)一个群体间的比较,采取OPN-injected叶β-gal-injected叶,和(b)会比较,侧半球的vector-injected半球和等效区域考虑在内。第二次是作为接种体泄漏的控制执行,很大程度上表现为控制,因此不显示。
3所示。结果
3.1。本地化OPN的表达吸引周边地激活炎症细胞
新创OPN的表达是由基底神经节的adenoviral向量caudoputamen地区,在中枢神经系统病理与认知高度相关的后果,如neuroAIDS,尤其是被连接到dopaminergic-neuron-rich黑质(29日]。我们执行病毒剂量反应的实验,确定理想的培养液能诱导基因表达长期使用β加构造,并进一步确认结果与OPN-encoding向量。5×10的剂量5空斑形成单位能够诱导基因表达的网站包含注入,早在交货后3天,6天峰,持续交付后21天(数据没有显示)。剂量的十6pfu诱导一个相似的表达模式为我们观察和这里描述(数据没有显示)。剂量的5×106以上被短2-4-day基因表达特征,都在β加OPN-injected大脑,LacZ和探测到原位分别杂交和炎症细胞增长不一致。另一方面,使用剂量低于5×105空斑形成单位,我们不能一直检测组之间的基因表达的变化。添加3%伊文思蓝的接种物允许注射部位的识别,以及潜在泄漏的检测边缘和侧半球。为了确定的体积培养液,中枢神经系统泄漏检查在外围排水淋巴结(颈颈深、浅、鼻和periaortic), 5和10分钟后注入试点实验,和对侧半球。最近进行了有系统的识别不仅泄漏,但也潜在的局部基因表达产生的广泛影响。
注射重组adenoviral向量编码OPN的caudoputamen OPN-deficient老鼠,基于先前描述的模型(30.),导致局部OPN的表达(数字1(一)和1 (b)),是局限于注射部位(图1 (b));类似地,β加包含向量表达式了β加(数据没有显示)。nonperipherally激活炎症细胞的积累OPN-injected侧注入或侧半球(控制泄漏),或在比较β加注入大脑,注射后6天,没有明显不同,以CD45hi-gated细胞流式细胞仪的表达式,描述浸润白细胞的外围原点(图1 (f))。Iba1 +细胞与活化的小胶质细胞形态特征更丰富的网站OPN注入(图1 (c)的网站相比)β加注射(图1 (e)),由包含IHC检测。F4/80 +巨噬细胞在局部邻近OPN-expressing病变部位(图1 (d)),由包含IHC,它们的数量相比,并没有不同β-gal-injected网站(图1 (g))。我们还观察到一个地方增加GFAP +星形胶质细胞(没有显示)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
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(我)
(j)
(k)
(左)
的百日咳博德特氏菌毒素或百日咳毒素(Ptx)众所周知,增加血脑屏障(BBB)通透性31日,32),并促进免疫细胞迁移到中枢神经系统(33,34]。它已经被用于adenoviral交付干扰素的典范γ作为环境条件触发的代理工作的中枢神经系统炎症性疾病(35]。从历史上看,Ptx一直作为佐剂诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元)自1955年以来36]。因此,我们遵循运载体的中枢神经系统注入外围,腹腔内注射的Ptx(或生理盐水作为控制)。炎症被孤立的细胞侧量化(注射)或侧(noninjected)半球(控制泄漏和在动物Ptx)的影响,并通过比较OPN-injected动物β-gal-injected控制。量化进行了基于免疫的表面识别标记和流式细胞仪分析。
动物与Ptx刺激,细胞渗透的高峰发生在感染后6天,与OPN表达相关,其次是逐步衰变浸润细胞的数量。浸润细胞的流式细胞仪的特性,在6天,显示显著增加的CD45hi Ptx-injected动物的细胞侧叶,都在β加在OPN-injected大脑,但特别是OPN的老鼠相对明显β加(图1 (f),,双向方差分析Bonferroni紧随其后的测试)。重要的是,考试的天真侧半球的大脑显示焦点表达的病毒载体编码的产品并没有广泛地影响到BBB。考虑注入叶,CD45hi-gated浸润免疫细胞OPN-injected动物主要是CD11b +(也CD11c -巨噬细胞(图)1 (g)),但细胞表达T细胞标记,CD3 + CD4 +(图1 (h))和CD3 + CD8 +(图1(我)),也确定了。巨噬细胞在小鼠的大脑接收的浓缩OPN向量和Ptx治疗证实了免疫组织化学检测的F4/80 +巨噬细胞病变(图的网站1 (j))。同形像统计图控件进行(图1 (k))。细胞与中性粒细胞的形态或表达CD11b + Gr1high没有观察到在注射部位。提出了许多机制Ptx行动,比如BBB通透性增加和刺激白细胞浸润31日,32,34]。我们假设Ptx-injected动物外周免疫细胞OPN的表达受体增加,尤其是在CD11b +巨噬细胞。事实上,利用流式细胞仪对细胞分离外围网站,如人才外流颈深淋巴结,我们发现大门CD11b + CD11c-Gr1low Ptx-injected动物的巨噬细胞(红色线),增加了CD44v6的表达对碘氧基苯甲醚相比,动物注射生理盐水进入腹膜(蓝线)(图1(左))。
3.2。OPN驱动分子表达模式在其他模型描述神经毒性
评估OPN-induced因素可能导致免疫细胞的浸润细胞OPN表达的角度,我们执行中存在检查各种记录的炎症分子的表达可能改变局部OPN表达,用动物没有刺激周边地Ptx(表1),为了消除记录从这种浸润细胞。基因的选择根据他们的描述执行重要细胞迁移到炎症网站(请参见图的辅助分子分析和表达水平的完整列表)。我们已经确定了基因显著改变注射后6天(使用的叠化>和未修正的)OPN与β加(图2)。有显著增加2.3倍IL13R的表达α1 ()、CXCR3增加2.4倍()、CD40L增加3.38倍(),增加了2.4倍IL2R常见的γ链()和OPN本身()(图2(一个)和表1)。我们还观察到一个0.8倍downmodulation TOLLIP ()和调制CX3CL1的0.5倍()(图2 (b))。大量但不显著降低0.6倍MIF也指出(图2 (b))。在外围地刺激着Ptx OPN-injected动物,我们还观察到一个upregulation CXCR3(数字2 (c)和2 (d))病变网站,相比β加,如通过免疫组织化学方法检测到。
(一)
(b)
(c)
(d)
因为分子概要文件由OPN和周边的炎症诱导局部Ptx治疗可以与神经损伤和细胞死亡有关,我们下一个检查是否有差异在大脑中凋亡细胞的数量的身体周围向量注射部位,以及定义的损伤之外的周边(图3 (c))。在动物接受β加,要么有或没有Ptx治疗,细胞凋亡没有检测到附近的感染网站(数据3(一个)和3 (b))。相比之下,OPN-injected动物增加TUNEL +细胞病变,尤其在外围刺激Ptx(数字3(一个)和3 (b))。死亡细胞的鉴定是被强大的背景picnotic身体(图中未显示),有趣的是,尽管如此,TUNEL +细胞的50%集中在病变周边(图3 (b)),这表明他们可能是神经元或炎症细胞。图3 (c)Ptx-stimulated部分,显示了一个代表OPN-encoding病毒注入大脑,显示病变周边和TUNEL +细胞的存在。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
adenoviral向量编码OPN基因注入OPN缺陷小鼠的大脑是一个干净的系统,允许识别的中枢神经系统病理特点是专门由OPN和新创的重新插入表达式。OPN是本地驱动动物大脑中缺乏内生OPN,为了明确描述当地upregulation的角色,通过检测到原位杂交和PCR。我们没有检查的转化能力OPN adenoviral基因编码的矢量,对蛋白质含量和生化的完整性。然而,OPN的交付基因在大脑似乎生理(如本身,它没有在nonperipherally诱发炎症激活动物),但足够足够引起中枢神经系统的变化截然不同的微环境β-gal-injected控制。此外,这些变化引起OPN表达能够协同提供的外周免疫激活注入Ptx诱导显著的炎症和细胞死亡。这两个主要组件,OPN和外围Ptx先天免疫细胞的活化,配合诱导炎症浸润特征主要由巨噬细胞和细胞凋亡。此外,生成的分子模式OPN的表达神经元损伤和死亡有关。炎症情况下的感应Ptx, OPN的感应,就像在许多方面的结果明et al。35),谁表明,渗透进入大脑也可以通过Ptx和病毒的干扰素γ。除了诱导CD44v6在渗透细胞,Ptx结合OPN及其相关分子模式还可以促进细胞迁移,诱导BBB中断,类似于结合所描述的超表达MCP-1或干扰素γ(35,37),通过感应金属蛋白酶(38]。
为了应对OPN在大脑中,调节基因是IL13R之一α1,可以发挥重要的作用在细胞毒性神经损失机制,如我们所述39]。IL13R的配体α1,使用IL13 IL4, II型免疫反应成分,过敏反应的特点和寄生虫感染(40- - - - - -42),有趣的是,也参与了由氧化应激(DA神经元死亡的易感性39]。既定的大脑中多巴胺(DA)神经元表达这种受体的主要细胞,这是一个因素在DA神经元的选择性损失区域的黑质(SN),模仿一个表型观察在PD (39]。其他人也提出了一个联系OPN upregulation,炎症和DA神经元损失(43]。
我们评估是否增加大脑组织中OPN水平可以触发分子模式,能够支持炎症细胞的积累。我们发现OPN的诱导炎症发生的相关性与上调CXCR3的能力(趋化因子CXCL9的受体,CXCL10 CXCL11)和CD40L。具体来说,除了化学引诱物属性T细胞,在大脑中,CXCR3表达式能够动员小神经胶质细胞和促进树突损失(44]。CD40L已经发现加强与其他致病分子导致神经元损伤和死亡(45,46]。此外,CD40L也可能通过氧化stress-mediated参与神经退化机制(47,48),在BBB破坏(49]。因此,这些分子可能是炎症细胞迁移的关键先决条件。然而,为了真正引起周边CD45hi巨噬细胞和T细胞的迁移,外围触发激活这些细胞被Ptx必须上调CD44v6在这个模型中,可能诱发其他配体促进BBB,正如前面提出的其他模型(11]。
我们还观察到TOLLIP和CX3CL1被OPN downmodulated。相反,这种分子被描述影响神经元生存。例如,TOLLIP TLR信号通路的抑制剂(50),它提出了过度保护神经元免受有毒蛋白质错误折叠(51,52]。这表明OPN的角色,通过诱导TOLLIP下降,作为TLR-mediated增强剂的反应。CX3CL1小胶质细胞表达的是(53),降低毒性,因此,神经损伤(54- - - - - -59]。然而,在短暂脑缺血模型和阿尔茨海默病(AD),据报道,CX3CL1发挥相反的作用[60,61年]。
重要的是,大脑注射OPN-encoding向量有更多的细胞表达细胞死亡标记相比,大脑注射β加,局限于病变部位。诱导的细胞死亡引起的OPN据报道在其他模型62年,63年]。这是相反的报道对细胞凋亡保护OPN所扮演的角色,包括在中枢神经系统(12,63年- - - - - -66年]。炎症细胞的积累OPN-rich网站也可以防止细胞OPN的功能能力倒退的中枢神经系统循环,在所谓的反向轮回穿越内皮(12]。然而,重要的是要注意,我们使用OPN-deficient动物,他们可能更容易被缺乏细胞凋亡从内部这个分子。如果是这样,我们可以假设痛苦凋亡细胞不被感染的细胞OPN-encoding adenoviral向量。事实上,在OPN-sufficient兄弟姐妹,表达相同的背景,类似的实验并没有导致大量细胞死亡,可能由于内生OPN的保护作用(数据没有显示)。此外,鉴于TUNEL +细胞特别丰富的地区内的炎性病变,可能影响其他细胞类型OPN-triggered分子模式。
凋亡细胞的决心是一个技术挑战,作为picnotic细胞被标记抗体。因此,炎性细胞浸润,局部神经胶质细胞,或gaba ergic神经元(考虑到病变的定位)可以控制细胞死亡过程的潜在目标的内生OPN。也必须强调这一事实的外围刺激Ptx可以发挥协同作用在控制局部OPN-expressing活化和细胞死亡的网站。重要的是,据报道,RGD-containing一半的OPN是预防神经炎症的情况下造成的损失(67年]。这种保护作用可能由接触之间的交互OPN的RGD绑定域名,可以通过接触凝血酶,和整合素受体,导致反应性胶质增生的衰减。然而,尽管裂解形成有利于神经元生存,它也出现在大脑肿瘤细胞生存和延续的因素(68年]。研究在体外决定可能是一个关键的相对敏感性不同的大脑细胞亚群细胞死亡中内源性OPN的存在与否,和外生活跃和裂解形式,除了确定外围激活的角色要求细胞穿过BBB和导致大脑病理学。
在生理条件下,发现了OPN表达的是生理上DA神经元和其他基底神经节神经元的数量,尤其是在黑质,没有小胶质细胞和星形胶质细胞69年]。然而,在啮齿动物,在炎症和细菌脂多糖刺激,激活的胶质细胞OPN水平导致当地增加(70年]。因此,在OPN-sufficient条件,当地增加OPN可能是由于胶质激活,并全面促炎的环境。另一方面,在狨猴MPTP-induced PD模型,OPN,由non-DA神经元,表示只显示水平治疗后毒素减少,尽管增加神经胶质过多症(71年]。类似的减少基底神经节的OPN水平被描述与PD人类受试者,多系统萎缩和进步supracellular麻痹(71年]。减少OPN在这些模型和条件可能是一个损失的结果OPN-expressing子集在优势的背景下居民小胶质细胞OPN-rich浸润的巨噬细胞(72年]。无论如何,这些结果表明,特定神经元的机制,导致损失数量不限于OPN的表达及其诱导神经毒性分子模式的能力,但这些机制可能影响结果在某些感染和炎症条件导致胶质细胞强烈增加OPN在本地或浸润细胞增加其水平。
OPN可能取决于的潜在神经毒性的存在所导致的炎性浸润的组合外围激活免疫细胞,引起的表型模式具体的外围刺激,特别是关于upregulation OPN的受体,和upregulation OPN在中枢神经系统11,22,73年]。在我们的模型中,CD44v6的表达与Ptx外围刺激引起的。的感应,OPN在大脑中引起了分子模式可以与一个角色相关联的神经毒性。我们的研究结果表明OPN是炎症组件与一个角色在神经毒性和细胞毒性。战略目标一个调节OPN的表达在中枢神经系统,因为它是在神经病理学观察到如女士,PD, neuroAIDS,在不影响内生的水平,可能有助于防止神经元丢失。进一步的研究是必要的,单独定义一个角色OPN-mediated分子神经元死亡。总之,我们的研究表明,局部OPN的表达触发通路可能相关的细胞毒性与后果,增强中枢神经系统的炎症细胞的积累,在外围的激活上下文。
5。结论
OPN表达的是一种促炎的炎症分子,当大脑触发分子参与了各种模型的神经毒性。因此,分子微环境,开发后新创OPN的表达会影响神经细胞的可行性。另一方面,内生OPN的表达是一个因素,可以拯救细胞毒性。特定的细胞类型的角色OPN表达的内源性水平或当地upregulation控制神经毒性仍有待确定。组件,我们的模型显示,OPN是平衡与中枢神经系统相关疾病如女士,PD, neuroAIDS,特点是炎性浸润和upregulation OPN水平。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。作者没有任何财务利益冲突声明与本文的关系。
作者的贡献
霍华德·s·福克斯获得资金,设计实验的解释并帮助论文的结果和在精化;瑞安Ojakian执行所有的分子生物学实验,导致了生产的慢病毒结构;尼基Bortell免疫组织化学和存在,修改论文;克劳迪娅·弗林的帮助在活的有机体内实验和执行中存在;布鲁诺孔蒂参与讨论和解释数据;玛丽亚塞西莉亚加里波第Marcondes获得资金,设计实验,进行脑部注射,解释结果,进行统计分析,写论文。玛丽亚塞西莉亚加里波第Marcondes和霍华德·s·福克斯同样工作。
确认
这是斯克里普斯研究所的论文编号为27017。这项研究是由国立卫生研究院R01 MH073490霍华德·s·福克斯NS085155和布鲁诺孔蒂的迈克尔·j·福克斯基金会和美国国立卫生研究院一下R21 DA029491玛丽亚塞西莉亚加里波第Marcondes。
补充材料
总记录测量β-gal和OPN-injected大脑的脑损伤。存在被用来评估水平的趋化因子受体和炎性分子使用SABiosciences PCR数组,和SyBr绿色/火箭探测器ABI HT7900快速装置。我们测量84个基因参与炎症反应,包括趋化因子和受体(pamm - 022 z,试剂盒),OPN的病变段- / -大脑注射b-gal或OPN-encoding放置结果代表的平均±SD ddCT共有6动物每组进行,一式三份。* p < 0.05,方差分析Bonferroni posthoc测试紧随其后。