文摘
高机动组盒蛋白1 (HMGB1)主要是公认的化学引诱物的巨噬细胞对致病性刺激宿主反应的初始阶段。然而,最近的研究结果提供的证据合成属性增强扩散、迁移,并支持伤口愈合的能力表明间充质细胞的双重作用的细胞因子调节免疫反应和随后的再生过程。这里,我们研究了合成代谢的潜在影响HMGB1人类牙周韧带(PDL)细胞在牙周改建计划的规定,例如,在矫正牙齿运动。Preconfluent人类PDL细胞(hPDL)暴露在HMGB1蛋白和影响扩散,迁移,成骨分化,生物矿化是由MTS试验,实时PCR,免疫荧光细胞化学、ELISA和冯Kossa染色。HMGB1蛋白增加hPDL细胞增殖,迁移,成骨细胞的标记基因表达,蛋白质生产以及矿化结节形成。目前的发现支持的双重性格HMGB1与合成代谢治疗的潜在可能支持重建后的牙周组织的结构和功能完整性牙周创伤如矫正牙齿运动。
1。介绍
矫正治疗过程中,重构过程中牙齿支持组织包括牙槽骨促进牙齿的运动和随后的稳定在一个新的位置。齿运动的活跃阶段是紧随其后的是一个早期和晚期阶段的牙周再生牙周重建的体系结构和功能的完整性。宿主反应初始阶段的机械刺激,免疫细胞,巨噬细胞为主,吸引到强调网站清除坏死细胞碎片和准备后续的局部微环境功能牙周组织的再生能力剩余牙周韧带细胞(PDL)在后期阶段1]。PDL细胞代表混合人口主要是成纤维细胞的表型,很多人表现出成骨细胞的属性(2),但也举办一些干细胞和祖细胞能够形成所有相关的牙周组织,包括牙龈、牙周纤维装置,根牙骨质和牙槽骨3- - - - - -7]。据最近报道,PDL细胞有助于调节牙周修复过程的释放特定介质包括proregenerative蛋白质功能和促炎细胞因子如,igf,白细胞介素6、IL8, tnf, HMGB1 [4)为了应对机械装载然后启动与免疫有关细胞的交互。在这些介质、高机动组盒蛋白1 (HMGB1)获得了科学的关注作为报警信号组织损伤和被描述为一个促炎细胞因子释放的细胞坏死(8,9]。生理条件相比,HMGB1主要定位在细胞核和调节基因表达,坏死刺激引起蛋白质的分泌和过渡到细胞质中,进一步在细胞外空间,在那里它被分配多个免疫和osteometabolic函数(9]。像等级/ RANKL /功能系统,HMGB1与循环诱饵受体合作sRAGE介导免疫细胞的相互作用并修改趋化作用、扩散,并在目标细胞促炎细胞因子的表达。HMGB1发起生理重塑过程,负责发展的病理生理的组织损伤(10]。
骨微环境内,HMGB1被证明作为化学引诱物对成骨细胞和破骨细胞在软骨内骨化,单核细胞和其他免疫和多发地主管细胞(11]。
结果表明:愤怒基因敲除小鼠显示骨质密度较高,同时,减少监测活动。此外,HMGB1似乎间接监测RANKL-induced分化的前兆在体外和在活的有机体内,证明在RANKL刺激小鼠的骨髓巨噬细胞12]。最后,动物实验数据显示出明显的减少宿主炎性反应在抑制HMGB1释放特定的抗体(13]。
很少被人所知的角色HMGB1的牙槽骨改建。最近,基底HMGB1表达了PDL细胞和牙槽骨吸收的调节作用可能是来源于观察。这个结论是基于发现HMGB1提高促炎和破骨细胞诱导细胞因子的表达,如il - 1β、il - 6、IL-17和RANKL14]。最后,更高水平的观察牙龈沟液内细胞激素HMGB1报道在患有牙周炎的患者与健康人相比(15,16]。
除了其分解代谢的效果,HMGB1的潜在合成属性是从实验推导出建立蛋白质作为伤口愈合和再生的刺激因子通过增强细胞增殖和成骨分化17- - - - - -19]。
捡上发现自己的集团,在持续海拔HMGB1蛋白表达在牙周的后期阶段修复在矫正牙齿运动的老鼠模型20.),这是本研究的目的,以解决HMGB1诱导细胞增殖的变化,移民,和人类PDL细胞成骨分化在体外。我们假设HMGB1蛋白调节这些参数,这样会支持的牙周再生可以讨论的。
2。材料和方法
综述了所有实验协议和伦理委员会批准的波恩大学的(参考号029/08)。
2.1。PDL细胞培养
与牙龈或顶端组织避免污染,人类PDL细胞移植从中间第三提取前磨牙牙根的三个不同的青少年捐助者(12 - 14岁)如前所述21]。拔牙进行矫正的原因和写父母的同意。
第五段,nonpredifferentiated PDL细胞被播种到24-well盘子在10000个细胞密度/好,培养subconfluence(~ 70%)在实验开始前。此设置用于免疫组织化学,矿化分析,高山,骨钙素蛋白质分析。下面提到的偏离播种密度。细胞在DMEM培养含10%胎牛血清和抗生素0.5%(从原液稀释含5000 U /毫升青霉素和链霉素5000 U /毫升;Biochrom AG)、德国)在37°C的氛围中100%的湿度,空气,95%和5%的股份有限公司2。实验使用之前,细胞间充质来源的特征(如前所述22]。
2.2。PDL细胞增殖实验
调查HMGB1在PDL细胞增殖的影响,人类PDL细胞刺激了50 ng / mL HMGB1蛋白(美国GenWay-Biotech)根据以前公布的协议(3天17]。Vehicle-treated (H2O) PDL细胞作为控制。MTS试验进行测量细胞增殖率根据制造商的指示(Promega,德国)。在这个试验,PDL细胞被播种密度的2000细胞/。因为这些实验并没有透露任何浓度之间的依赖测试50 ng / mL, 100 ng / mL HMGB1蛋白,以下所有实验50 ng / mL HMGB1只有执行,根据协议的孟et al。17]。
2.3。PDL细胞迁移试验
解决HMGB1在PDL细胞迁移的影响,transwell进行化验。24-transwell-plates短暂,众议院(美国康宁公司)充满了培养基用于控制目的或条件培养基含有50 ng / mL HMGB1蛋白,重组。二乙酸Carboxyfluorescein succinimidyl ester-labeled PDL细胞培养密度的10000细胞/在参议院。3 h(孵化后,细胞迁移到迁移过滤器的底部在众议院决定使用荧光成像技术根据先前建立的修改协议(23]。量化PDL细胞迁移,迁移的图像过滤评估半定量的使用范围从0(意味着没有任何可见的细胞迁移)到1(即总过滤器的底部是由细胞)。PDL细胞迁移评估在0.1步骤。
2.4。免疫细胞化学
演示HMGB1的影响在早期和晚期hPDL细胞成骨细胞的分化,采用免疫染色在封面使用执行1:50 (40μg / mL)工作主要抗体的稀释高山(兔子反;德国Quartett)或1:25 (80μg / mL)骨钙素(兔子反;德国Biozol)结合二级fluorescence-labeled (Cy-3)抗体(1:100 (1.5μg / mL)工作稀释;山羊anti-rabbit;英杰公司、德国)和显微分析报告之前24]。负控制是由(i)省略主要抗体,(ii)省略中小学抗体和使用TBS / BSA相反,和(3)用主由一个未指明的抗体免疫球蛋白。
2.5。基因表达实验和实时PCR
确定HMGB1的影响成骨的标记基因的mRNA表达预期的高峰发生在转录水平比早些时候在蛋白质水平,第五段PDL细胞播种密度30000细胞/在6井板使用如上所述的协议。在subconfluence PDL细胞暴露在50 ng / mL HMGB1蛋白3 h。Vehicle-treated文化作为控制。在收获,候选基因的表达与成骨分化包括碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨钙素,RUNX2,骨形成蛋白2和4 (BMP-2 BMP-4)和牙骨质蛋白1 (CEMP1)分析了实时PCR如前所述[25]。使用的引物序列如下:高山5′-AGA-GAA-AGC-GAT-GGT-GGA-TG-3′, 5′反义-CGG-TGG-CAT-TAA-TAG-TGA-GAT-G-3′(26];CEMP1感觉5′-CCC-ACA-CCT-CAA-AAT-CAT-CC-3′,反义5′-CAG-GGT-CAG-GGT-GAG-AGA-GA-3′(罗氏诊断);骨桥蛋白感觉5′-AGG-AGG-AGG-CAG-AGC-ACA-3′,反义5′-CTG-GTA-TGG-CAC-AGG-TGA-TG-3′(27];骨钙素感觉5′-ATG-AGA-GCC-CTC-ACA-CTC-CTC-G-3′,反义5′-GTC-AGC-CAA-CTC-GTC-ACA-GTC-C-3′;RUNX2感觉5′-ATG-GCA-TCA-AAC-AGC-CTC-TTC-AGC-A-3′,反义5′-CGT-GGG-TTC-TGA-GGC-GGG-ACAC-C-3′;BMP-2感觉5′-CTC-GGC-CTT-GCC-CGA-CAC-TGA-3′,反义5′-TAA-GAA-GCA-CGC-GGG-GAC-ACG-T-3′;BMP-4感觉5′-CCT-GGT-AAC-CGA-ATG-CTG-ATG-GTC-G-3′,反义5′-AGA-CTG-AAG-CCG-GTA-AAG-ATC-CCG-C-3′。β肌动蛋白是作为内生参考(感觉5′-CAT-GGA-TGA-TGA-TAT-CGC-CGC-G-3′, 5′反义-ACA-TGA-TCT-GGG-TCA-TCT-TCT-CG-3′) (26]。
2.6。高山蛋白表达
分析HMGB1影响早期hPDL细胞分化成骨细胞的通路,第五段细胞培养在50 ng / mL HMGB1蛋白的存在48 h或各自的车辆为控制目的。在收获,细胞被胰蛋白酶化释放文化表面10分钟37°C。这个反应被终止的DMEM包含10%的边后卫。此后,细胞悬液离心,0.01%的细胞颗粒resuspended tritonx - 100。高山特定活动的变化测量在孤立的细胞溶解产物蛋白质水平的函数释放对硝基酚从paranitrophenylphosphate pH值10.2如前所述[28]。确保高山活动的变化并不仅仅源于增殖或凋亡的变化而不是直接HMGB1效果,高山数据计算了样品的蛋白质含量的函数(25]。
2.7。骨钙素蛋白表达
的骨钙素水平的媒体是化验使用商用酶联免疫分析法(ELISA)试剂盒特定人类骨钙素(德国IBL GmbH)根据制造商的指示。
2.8。矿化分析
分析HMGB1在PDL细胞分化能力的影响,PDL细胞培养在成骨的封面会21 d中包含10 (OM)−12米β-glycerolphosphate和82 mg / L抗坏血酸和50 ng / mL HMGB1 OM补充,分别。积极控制10−7M地塞米松补充OM介质。消极的控制,PDL细胞在细胞培养基培养如上所述。文化,21 d后细胞矿化的进一步处理可视化冯Kossa染色和随后histomorphometric评估。
2.9。冯Kossa染色
细胞在PBS和4%多聚甲醛固定了10分钟。洗后,细胞被孵化与5%硝酸银溶液在4°C 40分钟在黑暗中和1%的焦棓酸5分钟。细胞被固定为5%硫代硫酸钠为5分钟和复染色在硫酸铝5% 0.1%核快红了10分钟。封面幻灯片之前一滑在100%乙醇脱水,二甲苯和DePex封面下滑。
两个图像捕获每10×放大和矿化区域面积的函数量化。分析了数据方差分析(方差分析)和Bonferroni学生的的修改以及多个比较。
2.10。统计分析
分析学生的所有数据进行了分析以及,方差(方差分析)和Bonferroni学生的的修改以及多个比较或Wilcoxon测试。值< 0.05被认为是重要的。两个复制的数据是代表实验中,既取得了类似的结果。
3所示。结果
3.1。HMGB1 PDL细胞增殖的影响
72 h暴露hPDL细胞HMGB1 PDL细胞增殖导致显著增加。比未经处理的控制,在HMGB1治疗人类PDL细胞增殖增加~ 17%是观察(图1)。
3.2。HMGB1在PDL细胞迁移的影响
HMGB1的挑战导致增加hPDL迁移细胞通过transwell过滤器。与未经处理的控制相比,添加实验媒体补充HMGB1大约翻了一番迁移的PDL细胞从参议院(图2)。
3.3。基因表达
HMGB1的分化实验演示了一个重大影响各自的参数hPDL细胞。与50 ng / mL HMGB1刺激后,高山的观察基因表达显著增加,BMP-2, BMP-4,骨桥蛋白,骨钙素,RUNX2,牙骨质蛋白1(图3)。
3.4。HMGB1对成骨分化的影响
HMGB1的分析对其调节hPDL细胞的成骨分化能力揭示upregulation高山特定的活动,以应对由大约2.2因素(HMGB1的数字4(一)和4 (b))。骨钙素蛋白表达均获得类似的数据,尽管关于这个参数HMGB1的效果并不明显,然而,他仍然显著(数字5(一个)和5 (b))。
(一)
(b)
(一)
(b)
3.5。PDL细胞矿化
在21 d刺激实验中,HMGB1治疗影响生物矿化。正如所料,PDL细胞培养在缺乏底物β-glycerolphosphate没有任何矿化结节形成。相比β-glycerolphosphate刺激,增加50 ng / mL HMGB1导致进一步显著增加硝酸银富集地区,对于数量级,夷为平地效应之间的中间看到独自OM和地塞米松治疗文化,后者显示预期的矿化率最高21 d后(图6(一))。进一步证实了这种视觉印象的半定量的评估冯Kossa积极的区域(图6 (b))。
(一)
(b)
4所示。讨论
本研究调查了在人类PDL细胞的合成代谢的潜在影响HMGB1可能修改和再生牙周支持流程,例如,矫正后的牙齿运动。我们的数据之间存在相当大的结论性HMGB1增加增殖,迁移,成骨分化,在转录和翻译水平,细胞外基质生物矿化。
除了HMGB1作为化学引诱物的的作用和分解蛋白质的巨噬细胞炎性牙周疾病或宿主反应初始阶段的局部应力导致增加免疫细胞的迁移在当地环境缺陷(29日,30.)和一个增强其他炎症介质释放到当地的微环境(8,9,31日),最近的报告表明合成的性质HMGB1在后续阶段的组织再生。根据收集的数据在cardiologic梗死小鼠模型,HMGB1被证明特别行动多能干细胞和祖细胞缺陷周围和流,从而,促进再生效率(32]。在不同的实验方法,人类心脏成纤维细胞与HMGB1刺激,罗西尼等人证明了水平的提高生长因子包括血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子- 1 (33]。通过实验进一步支持添加在糖尿病小鼠伤口模型中,HMGB1促进伤口闭合,肉芽组织形成,血管生成,最终提高伤口愈合34]。类似的实验研究使用3 t3成纤维细胞,据报道,HMGB1刺激伤口愈合的促进细胞增殖和迁移35]。它不应该仍然未提到的,在这种情况下也存在相互矛盾的报道。一些研究表明一个抑制HMGB1在伤口愈合中的作用造成的损伤胶原蛋白合成的upregulation胶原蛋白降解和基质金属蛋白酶的表达基因8和9,可以中和由丙酮酸乙酯(EP),一种释放HMGB1的有效抑制剂(36,37),导致增强胶原蛋白沉积和抗拉强度在EP处理标本。然而,尽管这些明显矛盾的结果,HMGB1似乎占据了一个重要角色在当地的中介和系统性应对多样化的刺激和可能承担的诊断和治疗的潜力。HMGB1的适用性/ sRAGE比率作为诊断工具给疾病进展的证据已经证明在多发性硬化患者,血清和大脑流体测量显示比例的增加,造成sRAGE水平降低患病的患者比健康控制个人(38]。同样,在肿瘤病人增加致病性可能相关的血清水平降低sRAGE作为比例提高间接暗示HMGB1表达(39]。
孟和同事显示HMGB1促进间充质干细胞的迁移和分化成骨细胞的通路和结论HMGB1在骨修复的一个重要的角色17]。在我们的实验中,PDL细胞增殖、迁移和成骨分化也增加了HMGB1,后者对于早期成骨细胞的成熟阶段更为明显,证明了更明显的碱性磷酸酶特定的活动和骨桥蛋白表达增加与骨钙素的生产。根据这些考虑,似乎可以得出合理的结论类似的支持作用HMGB1在牙周再生,因为PDL宿主细胞的不同发展阶段,从干细胞终末分化成纤维细胞,成骨细胞,等等。同样,HMGB1的刺激细胞外基质矿化是一个重要的发现,因为这个参数在牙周再生的成就是至关重要的。结合当前数据与文献报道,很可能涉及多个机制HMGB1驱动控制的先天免疫反应和组织损伤的修复,从PDL的直接刺激成纤维细胞,更间接影响血管生成信号和巨噬细胞生理学19]。总的来说,我们的研究结果加强HMGB1的三条腿的动作,与核HMGB1维持染色质结构和允许不受干扰的转录活动,细胞外HMGB1提醒先天免疫系统组织损伤和调节炎症(17),但也推动组织重塑再生一次中央地方组织的炎症反应已经被克服。未来实验分析HMGB1的交互,PDL细胞,成骨细胞在coculture模型有特殊修改合成细胞外基质的能力方面需要获得进一步深入了解HMGB1蛋白功能牙周改建计划。
总之,目前的数据进一步支持这个想法,hPDL细胞有助于牙周改建计划的编排和再生,例如,在矫正的过程中运动。研究结果证实HMGB1的双重角色的想法,分解和合成代谢属性,后者被证明在这里HMGB1-induced增强扩散,迁移,hPDL细胞的成骨细胞的分化,生物矿化。这些发现将另一块添加到马赛克的更好的理解细胞的牙周重建监管机制。广泛的科学依据是未来发展的关键先决条件的基于免疫的临床应用试图更好地监测牙周组织反应机械干预、支持牙周再生过程,减少不必要的副作用在矫正治疗的风险。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项研究得到了德意志Forschungsgemeinschaft(208年KFO TP8 LO-1181/2-2)和波恩大学的医学院。是高度赞赏Jana Marciniak博士审查的技术援助。