文摘
虽然生物疗法改变了类风湿性关节炎(RA)的过程中,今天的主要的挑战是确定生物标记目标治疗选择的患者团体。循环微(mi) rna代表小说类风湿性关节炎的分子生物标志物的表达改变。我们的研究旨在量化mir - 125 b在RA患者血液和血清样本,比较健康对照组和其他形式的风湿性疾病和关节炎患者,并评估其预测价值作为应对利妥昔单抗的生物标志物。可检测水平的mir - 125 b测定全血和血清样本和RA患者明显升高而骨关节炎的和健康的捐赠者。增加但是还发现在其他形式的慢性炎性关节炎患者。重要的是,高血清mir - 125 b在疾病爆发与良好的临床反应与利妥昔单抗治疗三个月后()。这个预测价值是不限于RA患者中也B淋巴瘤。我们的结果确定循环mir - 125 b小说在RA microrna的过度表达,表明血清mir - 125水平- b是应对利妥昔单抗治疗的潜在预测生物标志物。
1。介绍
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性、全身性炎症性自身免疫性疾病可能影响许多组织和器官,但主要攻击关节。类风湿性关节炎是一种多因素疾病原因不明的和复杂的发病机制,包括至少两个亚型,具有不同的原因和严重程度1,2]。风湿性关节炎的临床病程和预后波动是不可预测的。一个主要问题是,高达70%的患者近期出现RA显示在3年内辐射侵蚀的证据。从长远来看,主要成果包括关节畸形和失调,需要关节置换手术,功能障碍,由于加速动脉粥样硬化性心血管疾病和过早死亡和冠状动脉心脏疾病(3]。大量研究表明,积极的治疗早期RA的结果在更好的临床结果4]。9个生物制剂可用于治疗风湿性关节炎,常常与甲氨蝶呤联合使用。每种类型的目标特定的炎症机制,在很大程度上改善RA的结果在许多病人5,6]。然而生物制剂是规定在反复试验的基础上,甲氨蝶呤独自已经失败,反应是异构的,大约三分之一的病人nonresponders。它可能需要一些时间才能找到最好的药物的患者。考虑生物制剂的高成本和严重的副作用的可能性,预测因子的识别反应生物疗法可以改善病人护理和医疗成本效益。
临床和血清学特征完全不足以预测治疗效果。Anticitrulline肽抗体(ACPA)、c反应蛋白升高,血清EGF水平,MCP-1或TNFR,基因分析提出了确定反应生物制剂(7- - - - - -9]。最近,微rna (mi)已成为一个新的类别的生物标志物和RA患者有明确的microrna的表达的改变10]。守恒在进化,microrna是一个丰富的一类内源性,短的非编码,监管RNA分子,控制基因表达sequence-specific组织针对信使RNA降解或转化镇压。的潜在价值microrna分子生物标志物的诊断、预测疾病的结果,和预测治疗反应是有据可查的癌症(11),而在RA尚缺乏研究[12,13]。自2008年以来,microrna的存在在人类体液已经记录,和一些研究报道直接在血液或血清microrna检测的优化(14,15]。最近,村田等人确认签名7等离子microrna是诊断生物标记特定的RA患者,甚至ACPA-negative [16]。然而,迄今为止没有报告关于microrna的表达预测RA患者的治疗结果。
美罗华是世界上最畅销的抗癌药物,最初开发治疗非霍奇金淋巴瘤(17]。它是一种嵌合单克隆抗体针对B细胞的表面抗原CD20, FDA批准1997年结合使用甲氨蝶呤治疗类风湿性关节炎患者严重活动性疾病和失败的一个或多个anti-TNF药物18]。大型随机对照试验表明在长期疗效RA患者未能应对甲氨蝶呤或anti-TNF药物(19]。尽管有效的循环消耗几乎所有患者的B细胞(20.)和完整解决炎症在某些情况下,只有一半的人然而应对利妥昔单抗治疗。因此,有很多的兴趣识别分子生物标志物预测患者是否会回应或不利妥昔单抗。除了共享一个共同的治疗RA和淋巴瘤相当大一部分份额致病因异常激活NF -炎症反应B信号(21]。自mir - 125 b是一种进化保守microrna的调节炎症信号通路(22],B细胞分化[23,24)、肿瘤坏死因子生产和细胞凋亡(25)生物学途径的淋巴瘤和RA的重要性,我们评估是否mir - 125 b是管制在RA和有用的潜在生物标志物预测利妥昔单抗的回应。
2。材料和方法
2.1。患者和健康对照组
新鲜的外周血和血清样本来自健康的捐赠者()与无自身免疫性疾病史或骨关节炎(OA,患者)和类风湿性关节炎(RA,)完成2010 ACR /欧拉标准(26]。48 RA患者中,我们包含了32的利妥昔单抗治疗的患者。样品也获得receptor-associated周期性综合症患者(陷阱,)和spondyloarthropathies (SpA、)。知情同意提供按照当地人类伦理委员会批准的程序(拉西德保护des人Sud Mediterrannee四:ID 2008 - a01087 RCB - 48)。
RA患者的特点总结表1。患者整体评估疾病活动使用28-joint-count疾病活动得分(DAS28)如前所述27]。病人的标准资格联合甲氨蝶呤(MTX)治疗;DAS28≥4.5;和抵抗疾病至少2修改治疗风湿病的药物(DMARDs) (MTX和anti-TNF包括)。开始前一个月或更多的这项研究中,每个病人稳定剂量的口服糖皮质激素,没有收到任何关节内注射类固醇。患者接受利妥昔单抗(美罗华,罗氏)推荐的制造商和法国制药机构ANSM(静脉注射一次1000毫克每天0和15)。RA患者分开在两个子组根据他们的临床反应利妥昔单抗治疗后3个月(M3) (DAS28 M3-M0),继欧拉标准:对nonresponders (NR) DAS28 > 5.1,比DAS28 M3-M0≤0.6;和中间反应者(R), DAS28 < 3.2或DAS28 > 3.2和DAS28 M3-M0 > 1.2。
分段程序淋巴瘤患者()按照国际建议(28]。临床特点是总结表2。这些患者并发RA。患者仅通过利妥昔单抗治疗4周输液或rituximab-chemotherapy方案在适当的时候。反应是评估4 - 6周后根据国际建议(28,29日]。患者在完全或部分响应分为应答患者和那些稳定的疾病或进步的疾病被列为nonresponder患者。
2.2。使用RT-qPCR血液RNA隔离和microrna的量化
收集血液样本使用EDTA-coated管(BD真空采血管5毫升;双相障碍诊断、法国)按照标准程序。整除的0.5毫升的血液样本被立即转移到1.2毫升的RNA后介质(应用生物系统公司)和存储在−20°C。总RNA提取使用修改后的协议从Ribopure-Blood RNA隔离设备(应用生物系统公司)。简单地说,10μL冰川酸(σ,法国)添加到血细胞溶解产物(800μL,步骤1和2根据制造商的指令)。样本提取酸酚/氯仿,1毫升GuSCN溶菌作用的解决方案(4 M硫氰酸胍盐,25毫米柠檬酸钠,0.5% (w / v)钠N-lauroyl sarcosinate),和0.1 beta-mercaptoethanol和1.25的乙醇添加到水相。样本经过滤芯和洗,先洗方案1 (70% EtOH / 30% GuSCN裂解解决方案)和第二2清洗液(80% EtOH / 50 mM氯化钠)。RNA在100年被筛选了μL洗脱溶液预热到80°C和储存在−20°C。的浓度和完整RNA NanoDrop nd - 1000分光光度法测定(NanoDrop科技,大▽)和由Bioanalyser安捷伦1。
总RNA的microRNA分析10 ng是反向转录使用50 nM人类微茎环结构RT特定引物,50户/μL MultiScribe逆转录酶,10 xrt缓冲区,每个核苷酸100毫米,20个单位/μL核糖核酸酶抑制剂(应用生物系统公司)。反应混合物(15μL)被孵化thermocycler Mastercycler(埃普多夫、法国)30分钟16°C, 30分钟42°C, 5分钟在85°C,然后维持在4°C。实时PCR进行结果使用TaqMan microRNA特定引物互补DNA和TaqMan普遍PCR掌握混合。所有的实验都是根据制造商的协议执行,使用移液机器人平台epMotion 5070(埃普多夫)和LightCycler 480检测系统(罗氏公司、法国)。U6B小核RNA的表达(RNU6B)作为内生控制数据规范化。相对表达式是使用比较阈值计算周期(Ct)的方法。
2.3。使用RT-qPCR微rna提取血清和量化
全血是分为血清和细胞内分数2 h后收集。血清是储存在−20°C。RNA提取400μL血清是由酸性苯酚:氯仿提取和用乙醇沉淀在晚上−20°C (14]。沉淀后,40μL无菌水被添加到RNA隔离。
通常,一个15μ包含6.7 L逆转录酶反应μL纯化的RNA,反转录根据制造商的指示进行。实时PCR进行结果使用TaqMan microRNA特定引物互补DNA和TaqMan普遍PCR掌握混合。因为U6和5 s rRNA退化在血清样本14,15),结果被减去归一化全球miRNA级别在样例(6 microrna的平均Ct hsa - mir - 142 - 3 - p 000464 (ID), hsa - mir - 142 - 5 - p 002248 (ID), hsa-miR-24 000402 (ID), hsa - mir - 181 d (ID 001099), hsa-miR-15b 000390 (ID),和hsa - mir - 125 b为RA血清(ID 000449);4 microrna的平均Ct hsa-miR-16 000391 (ID), hsa-miR-24, Let7-a 000377 (ID),和hsa - mir - 125 B B淋巴瘤血清)的水平Ct mir - 125 B。
2.4。统计分析
病人的参数与非参数分析了Wilcoxon符号秩检验。相关性mir - 125 b表达水平与斯皮尔曼相关测试和量化费舍尔转换应用。所有其他使用Mann-Whitney数据统计分析测试。值小于0.05被认为是具有统计学意义。的力量和精度V3软件(http://www.power-analysis.com/1 -)是用于计算错误的概率不是随机出现)的血清水平的差异mir - 125 b反应者和nonresponders之间。
3所示。结果
3.1。量化的成熟mir - 125 b在RA的血液样本
使用微阵列技术,我们发现mir - 125 b的管制汇集RA患者的血样与健康的捐赠者(未发表的数据)。首先,我们验证这些数据分析mir - 125 b表达个人的血液样本来自16个RA患者有严重疾病和类似的临床特征(表1)。总rna - 0.5毫升的全血中分离的成熟mir - 125 b使用RT-qPCR量化(图形式1(一))。表达水平正常化U6基因表达和表达。成熟mir - 125 b相对成熟的RA患者表达明显高于健康的捐赠者和OA患者样本()。更具体地说,我们发现mir - 125 b在12 16(75%)血液样本(健康的捐赠者中值= 2.22)。
(一)
(b)
在人类中,有两个假字编码相同的成熟mir - 125 b序列。它们分布在两个不同的多顺反子microrna的集群在染色体11日(hsa - mir - 125 b - 1)和21 (hsa - mir - 125 b - 2),窝藏mir - 100 / let-7a-2 mir - 125 - b - 1和mir - 99 a / let-7c / mir - 125 b - 2,分别为(30.]。来决定是否增加成熟mir - 125 b表达相关的观察可以优先的upregulation这两个microrna的集群,我们量化一个microrna的每个集群(图编码1 (b))。尽管只有mir - 100达到统计学意义,mir - 99和mir - 100都同样在RA患者的血液与健康的捐赠者,这表明集群都是同样管制在RA。
3.2。成熟mir - 125 b超表达RA患者的血清样本
由于血清microrna也存在于,我们调查是否mir - 125 b upregulation也可以以RA血清样本。用实时定量PCR (24,31日),发现mir - 125 b被证实与成熟的RA患者血清来自32个(图2(一个))。此外,是否这对RA microrna是特定的,其表达水平是分析OA患者。分析表明,血清mir - 125 b表达水平明显不同RA和OA患者()。评估潜在的血清mir - 125 b作为RA的非侵入性生物标志物,血清样本来自其他风湿性疾病,包括陷阱和水疗也分析(图2 (b))。mir - 125 b的表达水平来衡量RA患者血清中没有不同于其他风湿性疾病测试。虽然还需要进一步的研究,我们的数据表明,血清mir - 125 b的变化不是特定于RA。
(一)
(b)
3.3。高表达RA血清mir - 125 b的预测好应对利妥昔单抗治疗
我们下一个决定是否检测血清mir - 125 b的活性RA患者可以作为生物标志物预测临床反应利妥昔单抗(图3)。治疗前血清样本收集和mir - 125 b表达水平由RT-qPCR量化。当32 RA患者分成两个群体根据他们的临床反应利妥昔单抗治疗3个月后(图3(一个),),结果表明,mir - 125 b的高表达与一个好的回应anti-CD20疗法(,图3 (b))。的确,血清mir - 125 b的起始治疗前高反应良好与nonresponders相比,另外两个microrna也可检测血清中,也就是说,mir - 142 - 3 - p和mir - 142 - 5 - p,并不表示在两组患者明显不同(数字3 (c)和3 (d))。这些数据表明,RA mir - 125 b的低表达患者疾病爆发时显著降低机会来提高临床3个月的利妥昔单抗治疗后,血清mir - 125 b的丰度可以作为预测生物标志物。与平均值急救员(),nonresponders (),分析了1 -值的71%。功率计算估计,手段和SD-values常数之间的区别,在每个治疗组40例将这1 -所需的最小样本量值将接近100%。这意味着一个血清样本的分析成熟mir - 125 b的内容将作为一个很好的预测或临床标记病人对治疗的反应。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。mir - 125 B的预测价值下的B淋巴瘤患者血清利妥昔单抗治疗
评估是否高血清mir - 125 B的表达水平可以预测疾病的治疗结果除了RA与利妥昔单抗治疗,我们测量其表达水平在13 B淋巴瘤患者的血清(图4)。样本启动之前收集的利妥昔单抗治疗和患者分为反应者与nonresponders根据他们的临床反应。虽然不具备统计学意义,有较高的表达水平的趋势mir - 125 b组反应者的利妥昔单抗和nonresponders。一致的结果在RA样本,mir - 125 B是在6 8例(75%)血清样本(中位数nonresponders = 0.01)从反应的病人,表明血清mir - 125 B的浓度是一个潜在的生物标志物的利妥昔单抗反应,预测RA患者的治疗效果和B淋巴瘤。
4所示。讨论
类风湿性关节炎(RA)是一种异构的障碍与波动和不可预知的临床过程。尽管大型面板可用的治疗是临床医生,他们有时失败或产生局部反应,很少实现持续缓解,与系统性并发症有关。最重要的是,长时间的延迟实现足够的疾病控制影响RA患者的生活质量。当前分类的患者根据临床表型和自身抗体生产不是最优的,今天面临的主要挑战是治疗RA患者尽早最适当的治疗。朝着这个目标,识别生物标志物使匹配与特定的子组的患者治疗的主要兴趣。最近,microrna成为一个重要的一类新的blood-based生物标记,可以将具体的表达谱与疾病发展和严重程度,以及对治疗的反应。这是特别好记录在大范围的癌症(32]。检测microrna的可能性,不仅在病变组织,而且在体液,打开大机会这些分子在临床应用方面,14,15,31日,33,34]。尽可能少的出版物表明microrna可以作为生物标志物在RA诊断的影响(16,35),我们认为调查microrna是否也可以预测对治疗的反应。我们发现成熟mir - 125 b是在RA患者血清和血液样本和分化良好健康的捐赠者或者OA患者。然而没有特定的RA我们还发现mir - 125 b水平升高在其他风湿性疾病患者样本包括陷阱和温泉。此外,高表达水平在开始治疗前循环mir - 125 b与利妥昔单抗与良好的临床反应有关。
虽然在RA循环microrna的仍然是一个新的领域,量化的一个出版物相比5 microrna在RA患者的血浆和滑膜组织和显示,microrna在滑膜组织microrna滑液是相似的,但不同于等离子microrna (13]。作者得出的结论是,检测血清microrna游离的RA患者更可能反映不同的成分和激活状态的造血的隔间的关节空间;表明疾病的系统性炎症方面超过风湿性部分可能主要影响血液在RA microrna的模式。这也许可以解释为什么我们发现mir - 125 b高度分化的RA患者风湿性疾病患者从OA个人但不显示一个系统性炎症陷阱和SpA等组件。此外,这是在协议与文学mir - 125 b的microrna属于参与造血作用。强烈表达在正常造血干细胞(HSC)和骨髓和淋巴祖细胞逐渐衰减。其异常超表达在这些人口与淋巴增殖性疾病的发展(36),脊髓发育不良、急性髓系白血病或b细胞急性淋巴白血病(23,37,38]。最近,mir - 125 b超表达一直与CD4的幼稚状态的维护+预防CD4 T细胞+T细胞分化和收购的效应/ CD4细胞表型的内存+T细胞(39]。有趣的是,当李和他的同事们发表的分析数据,mir - 125 b表达显著上调CD4出现+T细胞的RA患者与健康对照组相比(40]。最后,mir - 125 b很高水平提出了抑制分化诱导的早期步骤粒细胞生成(41]。总的来说,这些数据表明,高水平的mir - 125 b在RA患者的血液可能反映出有缺陷的谱系分化和增强扩散,导致异常丰富的早期造血祖细胞阻塞的谱系分化程序,类似于白血病是什么观察恶性肿瘤。
贡献从B lymphocyte-derived mir - 125 B也可能mir - 125 B是上调生发中心(GC)淋巴细胞相比,记忆B细胞(24]。最后,B细胞在RA的发病机制中扮演重要角色B细胞耗竭显示了治疗RA的积极成果。然而,mir - 125 B的表达水平在RA血清3个月的利妥昔单抗治疗后没有改变(数据未显示),进一步表明mir - 125 B的表达在RA患者更可能是由于T淋巴细胞和骨髓的贡献比B淋巴细胞的隔间。检测血清microrna的很意想不到的RNA分子不稳定的循环。研究表明,细胞外的microrna表现出高稳定性在体液循环相关蛋白或膜内囊泡,如液或微粒子(15,33]。除了循环microrna的有用性作为生物标志物,有证据就他们可能在遥远的细胞间通讯功能。的形式和来源的识别细胞外mir - 125 b将澄清其在关节炎中的作用。
尽管血液方便、无创和感兴趣的新的生物标志物的发现,很少有研究报告检测血浆或血清microrna的RA患者(12,31日,42]。直到现在,只有日本村田公司和同事建议microrna作为潜在生物标志物在类风湿性关节炎(13,16]。作者表明,等离子体在RA mir - 132浓度明显低于健康的捐赠者和等离子体水平的miR-16被DAS28与疾病活动评估(28-joint疾病活动的分数),虽然不是专门针对RA以来同样改变等离子体从OA患者。最近,他们发现了一个签名的七个microrna称为ePRAM(估计RA等离子microrna的概率),高架在RA等离子体相对于健康的捐赠者,并允许RA诊断特异性和灵敏度高,即使在ACPA-negative患者(16]。有趣的是,ePRAM签名包括mir - 125 - 5 - p,属于mir - 125家庭,三个同系物组成的人类(hsa - mir - 125 a, hsa - mir - 125 b - 1和hsa - mir - 125 - b - 2),这是从三个不同的转录位点编码不同的成熟种子区域相同的序列,因此可能有类似的功能(43]。在目前的研究中,我们表明,mir - 125 b也可检测,在血液和血清样本,并显著提升在RA患者与健康对照组和OA患者相比,扩展日本村田公司的观察和同事mir - 125家庭成员在RA的潜在生物标志物。然而,我们没有发现与DAS28显著相关,哈克和CRP(数据未显示)。循环mir - 125 b已经报道的一部分blood-based microrna的签名的卵巢癌和前列腺癌15,34]。这里,我们添加mir - 125 b的名单blood-based microrna在RA生物标志物,而且更重要的是首次显示,mir - 125 b可能预测疾病在RA生物疗法成功。
以往的癌症领域的报道表明,microrna可能在预测药物反应发挥重要作用,但在RA直到现在仍然是一无所知。类风湿关节炎患者治疗反应的分子预测仍然是尚未被满足的医疗需求和尤为重要,帮助专家选择最佳疗法对于一个给定的病人,他们受益于一个大型面板的生物药圣俸/风险比不等于取决于病人和疾病持续时间(44]。的利妥昔单抗,更好的临床反应被发现与低水平的干扰素-和b细胞激活因子(金属),Fc三世(Fc受体RIII)基因型和C / g - 174白细胞介素- 6 (il - 6)基因的多态性(45]。此外,最初接受利妥昔单抗取决于循环preplasma细胞数量在基线和不完全耗尽后治疗。最近,一项前瞻性研究表明,良好的临床反应利妥昔单抗与血清B细胞标记的存在,更具体地说与类风湿因子积极性或高anti-CCP抗体积极性和免疫球蛋白水平升高46]。然而,我们没有发现的存在和/或水平之间的相关性anti-CCP抗体和mir - 125 b表达水平(数据没有显示)。我们的数据表明,mir - 125 b可能被认为是一个额外的预测生物标志物对利妥昔单抗治疗作为其表达水平的循环,开始之前,利妥昔单抗治疗,预测治疗的结果。重要的是,这是不仅RA患者的观察,我们发现类似B淋巴瘤患者的趋势,表明一个更广泛的应用。的确,进一步确定需要包括再现性实验使用其他军团和比较与其他对照组患者感染等。此外,RA患者使用在我们的研究中建立了疾病和失败anti-TNF药物。因此不能明确mir - 125 b可以预测反应利妥昔单抗对早期RA患者和那些从未收到任何生物疗法。
5。结论
总之,我们已经确定了mir - 125 b的潜在有用的标记来预测成功的结果利妥昔单抗治疗。这是第一次一个microrna被确定为潜在生物标志物治疗RA疗效和预测个体的靶向治疗。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作由由大学的蒙彼利埃I和II,关节炎基金会COURTIN表示(AO 2007),和欧洲共同体(Autocure合同号。lshb - ct - 2006 - 018661和EUROTRAPS合同号。健康- f2 - 2008 - 200923)。