文摘

CP001四个传统草药混合物与抗炎作用。在这项研究中,我们调查的影响口服CP001乙醇提取物对2,4-dinitrochlorobenzene——(DNCB)诱导小鼠模型。为此,我们观察到的影响口服CP001皮肤炎症细胞浸润,皮肤肥大细胞、血清IgE的生产,和Th2细胞因子mRNA的表达广告DNCB对BALB / c小鼠的皮肤损伤。组织学分析表明CP001减少真皮和表皮增厚以及真皮渗透引起的炎症细胞。此外,CP001降低肥大细胞浸润数以及真皮渗透引起的炎症细胞。在皮肤损伤,mRNA表达白细胞介素- 4 (IL)和IL-13被CP001抑制。CP001也减少了生产鼠标等离子IgE水平。此外,我们调查的影响CP001使用人类肥大细胞在炎症性过敏反应(HMC-1)。在HMC-1、细胞因子的生产和mRNA水平的il - 4, IL-13, il - 6,引发被CP001镇压。综上所述,我们的结果表明,口服CP001施加有益的影响在广告症状,表明CP001可能是一个有用的候选人AD的治疗。

1。介绍

特应性皮炎(AD)是一种常见的慢性炎症性皮肤疾病,影响着世界上大约有1000万人,导致生活质量,显著减少和西化的国家其发病率不断增加1,2]。AD的发病机制尚不清楚,但这种疾病似乎与特异性免疫和炎症机制。广告的一般特征包括过度浸润的炎症细胞如淋巴细胞,巨噬细胞,颗粒肥大细胞在皮肤损伤,外周血嗜伊红血球过多,高水平的血清免疫球蛋白E (IgE) [3]。

肥大细胞是组织的炎症细胞起源于骨髓,天然免疫与适应性免疫响应的信号。他们立即发挥重要作用在过敏性反应,通过高亲和性IgE受体被激活,FcεR (4]。此外,据报道,大量的肥大细胞可以在广告中找到皮肤病变。大多数广告病人血液IgE水平有升高,是肥大细胞介导的激活(5]。肥大细胞激活的IgE释放炎症介质,如组胺、以及细胞因子,包括Th2细胞因子,如il - 4、IL-5, IL-13。因此,cell-bound IgE交联过敏原,是导致广告的发展通过调节激活肥大细胞定位(6]。

激活肥大细胞释放的促炎细胞因子,包括il - 6和引发过敏性炎症中发挥重要作用[7];il - 6介导过敏炎症(8),而引发的中性粒细胞迁移归纳为炎性区域作为一个强有力的趋化细胞因子(9,10]。

CP001是四个东方草药组成的混合物Houttuynia cordata研究,地黄Libosch,树皮桦木属platyphyllavar。粳稻,和悬钩子属植物coreanus进行筛选。Houttuynia cordata研究一直在东方传统医学用于治疗炎症性疾病。另外,一些研究表明,Houttuynia cordata相关研究已经广泛的药理作用,包括抗炎(1],抗病毒[11],和抗癌作用[12]。地黄Libosch历来作为东亚成分的草药医学用于止血的影响,活化血液循环,改善肾脏功能(13]。一些研究表明,地黄Libosch有抗过敏药的效果(14和抗炎作用15- - - - - -17]。桦木属platyphyllavar。粳稻已知有抗氧化、抗炎和抗癌作用[18)和抑制广告的发展数控/ Nga老鼠[19,20.]。悬钩子属植物coreanus进行筛选。是一种红莓,主要生长在韩国、日本和中国。水果,被称为“Bokbunja“在韩国,一直在东方传统医学用于减少疾病,如哮喘和过敏的风险。它也知道悬钩子属植物coreanus进行筛选。有抗炎和抗氧化活动(21- - - - - -23]。这些集体观测表明CP001可能适合控制广告和有益人类变应性疾病的治疗。因此,在我们之前的研究中,我们已经证实,局部应用KM110329 (CP001修改草药混合物)抑制卵白蛋白过敏性皮肤炎,DNCB-induced小鼠模型。

因此,在这项研究中,我们调查是否30%乙醇提取CP001口服抗炎活动2,4-dinitrochlorobenzene - (DNCB)诱导的小鼠模型。此外,我们还研究了30%乙醇提取的CP001是否有抗过敏药效应在人类肥大细胞,抑制细胞因子的生产HMC-1。

2。材料和方法

2.1。制备CP001

CP001是由Hanpoong制药(Jeon-ju、韩国)按照良好生产规范(GMP)过程。CP001 30%乙醇提取棕色粉末,它是组成的Houttuynia cordata研究,地黄Libosch,树皮桦木属platyphyllavar。粳稻,悬钩子属植物coreanus进行筛选。提取的粉末溶解在蒸馏水在活的有机体内和在体外实验。

2.2。动物

六个雄性BALB / c小鼠从东方购买(Sung-nam、韩国)。小鼠随机分为6组(正常、DNCB和25、50、100和200毫克/公斤(CP001)),由5个老鼠。所有的老鼠都保持无菌环境下,允许自由进入饮食和水。所有程序上执行老鼠庆熙大学动物保健中心的批准(批准文号KHUASP (SE), 2012 - 004年)。

2.3。广告诱导皮肤损伤和CP001治疗

广告诱导皮肤损伤过程中所描述的人物1。为此,小鼠皮肤真皮上涂上200年μL 1% DNCB剃须后使用补丁1×1厘米。两周后敏感,皮肤与200年受到挑战μL 0.2%的DNCB每周两次的解决方案。这个过程重复了两周,CP001口头管理结合在一起。在实验的最后,老鼠被公司牺牲2吸入,样本收集。


图1
用于诱导过敏性皮炎在小鼠模型的协议。剃背的老鼠与DNCB敏感区域的解决方案。雄性BALB / c小鼠上皮与200年致敏μl 1%的第一天DNCB解决方案。两周后,皮炎引起了200年μl 0.2%的DNCB解决方案在图中所示的间隔。CP001口头管理从第三周DNCB一起在敏化。
2.4。组织学分析

皮肤活检的一部分固定在4%多聚甲醛(PFA)和嵌入Tissue-Tek光学切削温度(O.C.T.)化合物(Tissue-Tek、樱花、AA Zoeterwoude,荷兰)干冰。皮肤的20μ米被削减和苏木精和伊红染色(H & E)对炎症细胞或与甲苯胺蓝肥大细胞计数和光学显微镜下检查(奥林巴斯)。肥大细胞被数10个地区的大功率领域(高通滤波器)在400 x放大。

2.5。酶联免疫吸附剂测定

最后CP001政府后,全血样品通过心脏穿刺收集测量血液IgE水平。血液被放置在真空采血管管包含EDTA(美国新泽西州BD科学)和血浆分离。总IgE水平等离子夹心ELISA测定使用BD PharMingen鼠标IgE ELISA。简单地说,盘子被涂上一层捕获抗体ELISA涂层缓冲区(Sigma-Aldrich)和孵化一夜之间在4°C。盘子洗了PBS-Tween 20(0.05%)和随后封锁(10%的边后卫在PBS) 1 h 20°C。连续稀释的标准抗原或样品稀释缓冲(10%的边后卫在PBS)被添加到碟子和盘子被孵化2 h在20°C。洗后,biotin-conjugated anti-mouse IgE和SAv-HRP (streptavidin-horseradish过氧化物酶共轭)被添加到碟子和盘子被孵化1 h在20°C。最后,tetramethylbenzidine(三甲)衬底的解决方案是添加到盘子中,15分钟后在黑暗中孵化,2 N H2所以4的解决方案是添加到停止反应。光密度测量在450 nm自动化ELISA读者(Versa马克斯、分子器件、钙、美国)。il - 6和引发水平以HMC-1上层清液通过夹心ELISA使用BD Pharmingen人类ELISA。夹心ELISA程序进行按照上述同样的协议。

2.6。细胞因子通过实时PCR分析

小鼠皮肤立即在液态氮冷冻,保存在−70°C到使用。实时PCR试验,小鼠皮肤是均质Ultra-Turrax T10 (IKA labortechnik,首尔,韩国)和RNA提取进行了使用试剂盒(美国纽约生活表达载体技术)。RNA含量测定用NanoDrop nd - 1000分光光度计(NanoDrop Technologies Inc。)。从每个样本总数的1 g细胞RNA反向转录使用互补脱氧核糖核酸合成装备(豆类、日本)。定量PCR进行使用SYBR绿色iMaster LightCycler 480(瑞士罗氏公司)。

2.7。逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),

细胞被离心收获和颗粒被冰冷的PBS。使用弹出的蓝色从颗粒分离出RNA RNA提取工具包(内含生物技术,韩国)根据制造商的指示。孤立的RNA含量测定用NanoDrop nd - 1000分光光度计(NanoDrop Technologies Inc。)。2μg细胞总RNA从每个样本反向转录使用互补脱氧核糖核酸合成装备(豆类、日本)。PCR进行20μL反应混合物组成的DNA模板,每个gene-specific底漆的10点,10 x Taq缓冲区,2.5毫米核苷酸混合物,1单位Taq DNA聚合酶(豆类、日本)。使用特定的引物进行PCR和引物序列为人类il - 6,引发,GAPDH如表所示1。

表1
2.8。高效液相色谱分析

鞣花酸、槲皮甙水合物和catalpol买来西格玛化学品(圣路易斯,密苏里州)。标准化合物的纯度保证高于95%,高效液相色谱法。高效液相色谱级乙腈、甲醇和甲酸买来j·t·贝克(Phillipsburg NJ)。Catalpol、鞣花酸、槲皮甙被选为标记化合物标准化提取样本。CP001溶解在蒸馏水在100毫克/毫升的浓度和过滤解决方案是0.45μm膜过滤器。一个10μL整除的样品溶液注入高效液相色谱系统(安捷伦科技,帕洛阿尔托,CA)。分析了样本Capcell Pak UG120 C18分析柱(250×4.6毫米,5μm;资生堂、日本)。

2.9。统计分析

统计分析作为平均值±标准平均误差(SEM),分析了使用未配对学生的统计学意义t以及。P值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。口服CP001减少炎症细胞渗透到广告的皮肤病变

确定CP001减少炎症细胞渗透到广告皮肤损伤,我们执行H & E染色CP001口服后在皮肤上。我们观察炎性细胞的渗透到表皮和真皮DNCB组,而CP001减少这样的炎症细胞渗透到皮肤(图2)。此外,CP001(25 - 200毫克/公斤)废除DNCB引起的皮肤增厚(图2)。接下来,我们也表现为肥大细胞甲苯胺蓝染色观察。反复皮肤应用DNCB真皮肥大细胞数量增加。然而,这一特性被CP001显著抑制(图3)。


图2
广告的组织学特征皮肤损伤CP001对待。皮肤部分被苏木精和伊红染色。治疗后炎症细胞浸润到真皮测量与CP001 DNCB的存在。部分使用显微镜进行评估的原始放大400倍。
(一)
(一)
(b)
(b)
图3
肥大细胞数量的测量广告皮肤损伤CP001对待。皮肤部分对肥大细胞甲苯胺蓝染色法染色。部分使用显微镜进行评估的原始放大400倍。数据提出了均值±SD从每组五个动物。 。
3.2。CP001管理会使mRNA Th2细胞因子的表达

Th2型细胞因子在急性阶段很重要的广告而混合Th1 / Th2型炎症是一种慢性阶段特征的广告。确定CP001减少Th2型细胞因子表达,我们进行实时PCR测定il - 4和IL-13水平。我们发现,口服CP001降低il - 4的mRNA表达广告皮肤病变(图4(一))。我们还发现CP001政府减少IL-13 mRNA表达广告皮肤损伤剂量依赖性的方式(图4 (b))。在组织学分析,反复皮肤的应用DNCB真皮肥大细胞数量增加,此功能被抑制CP001口服。激活肥大细胞分泌各种趋化因子和细胞因子il - 6和引发等。确定CP001降低il - 6,并引发细胞因子mRNA水平,我们在广告执行rt - pcr分析皮肤病变。口服CP001并不影响抑制il - 6和引发mRNA表达广告皮肤损伤(数字4 (c)和4 (d))。

(一)
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(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
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图4
CP001对小鼠皮肤组织的细胞因子mRNA的表达。IL-13 il - 4,白细胞介素6、引发mRNA表达测量的实时PCR (a)、(b)和rt - PCR (c), (d)在小鼠皮肤组织。列和误差表示平均数±标准差( 老鼠/组)。 。
3.3。CP001管理会使血清免疫球蛋白e浓度

Hyperproduction IgE是广告的一个重要特点和AD患者经常表现出较高水平的总和过敏原特定IgE抗体的血清(Abs)。进一步测试是否对广告的发展由CP001皮肤损伤与血清IgE水平有关,我们执行总IgE ELISA测定。我们发现总IgE水平在DNCB-treated组较正常组显著升高。然而,增加血清引起的IgE水平DNCB明显减少了CP001治疗(图5)。


图5
等离子体测量IgE水平。总IgE水平由ELISA决定。列和误差代表均值±sem ( 老鼠/组)。 。
3.4。CP001对PMA + A23187-Induced il - 6的影响和引发HMC-1表达式

接下来,我们调查是否在HMC-1 CP001影响il - 6和引发的生产。为此,肥大细胞是用不同浓度的预处理CP001 1 h,然后接受PMA和A23187 24 h。il - 6的水平和引发文化上层清液被ELISA试验测量。我们发现PMA和A23187诱导il - 6分泌显著抑制CP001(数字6(一)和6 (c))。我们还执行rt - pcr测定il - 6和引发HMC-1 mRNA的表达。我们发现,il - 6和引发mRNA PMA和A23187减少CP001(数字6 (b)和6 (d))。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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图6
CP001对PMA + A23187-stimulated HMC-1促炎细胞因子的表达。HMC-1是用不同浓度的预处理CP001 1 h,然后接受PMA和A23187 24 h。il - 6的水平和引发文化上层清液用ELISA测定(a), (c),用rt - pcr检测il - 6和引发mRNA水平(b), (d)。数据代表均值±sem的三个独立的实验。
3.5。CP001对PMA + A23187-Induced HMC-1 Th2细胞因子的表达

CP001政府降低il - 4和IL-13 mRNA表达广告皮肤病变(图7 (b))。因此,我们监管CP001对il - 4的影响特征在HMC-1使用rt - pcr和IL-13 mRNA表达。我们发现IL-13 PMA和A23187诱导表达显著抑制CP001(图7(一))。il - 4表达水平没有增加了PMA和A23187,但它是由CP001抑制(图7(一))。

(一)
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(b)
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图7
CP001对PMA + A23187-stimulated HMC-1 Th2细胞因子的表达。HMC-1是用不同浓度的预处理CP001 1 h,然后接受PMA和A23187 24 h。il - 4和IL-13 mRNA水平衡量rt - pcr (a)、(b)。数据代表均值±sem的三个独立的实验。
3.6。高效液相色谱分析

为了进一步评估CP001提取的有效成分,采用高效液相色谱法分析。为了分析catalpol,水的流动相组成(W)和甲醇(M)和流率为1毫升/分钟。采用梯度洗脱程序如下。97年最初的流动相的组成是:3 (W:米),这是线性改为95:5 (W:米)超过1分钟,91年改为:9 (W: M) 9分钟。在11分钟,流动相的组成回到初始条件,这是维护为列reequilibration 9分钟。色谱是在210 nm紫外线检测(图8)。鞣花酸、槲皮甙0.1%的流动相由甲酸(F)和乙腈(A)和流率为1毫升/分钟。采用梯度洗脱程序如下。90年最初的流动相的组成是:10 (F: A),这是线性改为85:15 (F: A)超过5分钟,改为60:40 (F: A) 35分钟。在41分钟,流动相的组成回到初始条件,这是维护为列reequilibration 9分钟。色谱是在254 nm紫外线检测。的保留时间catalpol、鞣花酸、槲皮甙是6.2,14.4,和18.6分钟分别(数字7(一)和7 (b))。catalpol的浓度、鞣花酸、槲皮甙的提取样品测定用高效液相色谱法分析如上所述。提取catalpol标准化包含1.8%,0.4%鞣花酸、槲皮甙0.3%。

(一)
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(b)
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图8
典型的高效液相色谱色谱(a) catalpol CP001的,(b)鞣花酸、槲皮甙。

4所示。讨论

广告是一种慢性炎性疾病,伴有红斑,水肿,扩展广告皮肤损伤(24]。最近,韩国医学已经增加了其潜在利益的主题在炎症性疾病的治疗,包括过敏性皮炎和气道炎症16,17,25,26]。目前的研究表明口服韩国草药混合物提取物,CP001,抑制DNCB-induced广告。我们观察到CP001减少炎症细胞的渗透到广告皮肤损伤和皮肤肥大细胞数量。

一般来说,使用类固醇治疗AD的治疗,但不能长期管理,因为许多副作用。因此,我们发现一种新药,有效治疗广告没有任何副作用。最近,我们报道,局部应用KM110329 (CP001修改药物)减少卵白蛋白和DNCB-induced过敏性皮肤炎(23]。因此,我们想知道是否CP001口服可以抑制DNCB-induced过敏性皮肤炎。

肥大细胞脱粒可以由招聘、贩运和炎症反应的功能。例如,il - 4和IL-13诱导内皮细胞粘附分子,可以招募白细胞(27- - - - - -29日]。同时,表皮细胞中细胞因子il - 4的生产已经知道为起始的广告的主要因素(30.]。在我们的数据中,我们表明,细胞因子的生产和mRNA水平的il - 4, IL-13, il - 6,引发HMC-1被CP001镇压。同时,定量实时PCR的皮肤损伤还表明,口服CP001减少广告的mRNA水平的il - 4和IL-13皮肤病变。此外,我们发现CP001降低肥大细胞在DNCB-induced广告皮肤病变。似乎抑制肥大细胞的渗透会使分泌il - 4和IL-13细胞因子,它可以抑制招募白细胞。因此,肥大细胞可能抑制Th2细胞因子的主要因素广告皮肤损伤CP001的口服。

IgE肥大细胞激活的中介,我们观察到CP001口服减少血液IgE水平升高引起的重复DNCB敏化。

CP001也抑制il - 6分泌il - 6和引发mRNA表达升高PMA和HMC-1 A23187诱导。似乎减少肥大细胞的渗透与减少脱颗粒的肥大细胞和嗜酸性粒细胞的成熟抑制各种炎性细胞因子的释放。

5。结论

我们目前的研究清楚地表明,CP001抑制DNBC引起的广告的发展。此外,炎症相关细胞因子的生产和mRNA水平的il - 4, IL-13, il - 6,引发被CP001镇压。这表明CP001可能是一个有用的候选人AD的治疗。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

很快金和Han-Seok崔本研究同样起到了推波助澜的作用。

承认

本研究支持格兰特的韩国传统医学R & D项目的健康和福利,大韩民国(B110017和HI12C1889)。