文摘

压力性尿失禁的潜在分子机制(隋)尚不清楚。我们旨在评估后的分子改变小鼠尿道阴道创伤和卵巢切除术(OVX)。24处女女老鼠同样分成四组:noninstrumented控制;阴道扩张(VD)组;OVX组;和VD + OVX组。泄漏点的压力变化(牧民联盟),生殖道形态、身体体重增加,血浆17β雌二醇水平和表达神经元一氧化氮合酶(nNOS),诱导一氧化氮合酶(间接宾语)和雌激素受体(ERs-ERα和ERβ)进行了分析。VD后三个星期,四组在生殖器大小和体重增加。与对照组相比,血浆雌二醇水平明显降低OVX和VD + OVX组,和牧民联盟是在所有三组显著降低。nNOS,进气阀打开,ERα表达式在尿道VD和VD + OVX组显著增加,而ERβ表达只在VD + OVX组显著增加。这些结果表明,隋唐之后阴道创伤和OVX包括尿道upregulations nNOS,进气阀打开,和人,表明没有和ER-mediated信号可能发挥作用在出生创伤和OVX-related隋发病机理的协同效应。

1。介绍

调制平滑肌的收缩反应是重要的病理条件如尿失禁和高血压。这些疾病中也经常遇到老年人人口(1]。炎症和氧化应激是关键特性平滑肌肉疾病的临床表现1,2),包括压力性尿失禁(隋)。隋是一种常见的泌尿疾病定义为过失泄漏的尿液咳嗽和打喷嚏等应力条件下(3]。出生创伤的影响(4)、更年期和老化可能导致隋的发展(5]。

尽管隋的治疗改善了(6),其内在的分子机制尚不清楚。研究出生创伤的影响和更年期的自制机制缺乏,因为限制可用性的人体组织。在这项研究中,我们使用处女雌性老鼠(7,8]分析阴道膨胀的影响(VD;模拟出生创伤)[9,10)和激素缺乏症(这两个因素被认为是重要的在隋)阴道和尿道。VD模拟出生创伤的影响(9)和卵巢切除术(OVX)模拟了绝经后激素缺乏症发生(7]。

从阴道分娩出生创伤可能导致缺血性损伤尿道(11]。缺血诱导一氧化氮合酶(NOS)的表达;这增加没有合成,导致尿道松弛(12- - - - - -14]。雌激素行动是由雌激素受体(人)15,16),这是由两个截然不同的编码genes-ERα和ERβ。虽然治疗17β雌二醇导致增加尿道通过当地抑制NOS表达语气,尿道基调的机理是通过雌激素受体亚型雌二醇增加,也就是说,ERα和ERβ,目前还不清楚。

我们的总体目标是理解相关的分子机制模拟出生创伤和OVX后隋。上述研究结果的基础上(17),我们假设以下:(1)模拟出生创伤和OVX减少泄漏点压力(牧民联盟)和血浆雌二醇水平;(2)模拟出生创伤和OVX诱导尿道萎缩和神经元一氧化氮合酶的表达(nNOS)诱导一氧化氮合酶(间接宾语);(3)ERα和ERβ表达是通过模拟出生创伤和改变OVX小鼠模型的隋。为了测试这些假设,我们设计了本研究使用以下目标:(1)分析牧民联盟,尿道的形态,和C57BL / 6小鼠血浆雌二醇水平VD和/或OVX;(2)确定nNOS和伊诺表达的诱导模拟出生创伤和/或OVX使用免疫荧光染色和免疫印迹分析;和(3)描述的更改在ERα和ERβ表达式由模拟出生创伤和/或OVX使用免疫荧光染色和免疫印迹分析。

2。材料和方法

2.1。动物和实验设计

24维珍雌性老鼠(年龄在6 - 8周,体重批准g)被随机分配到4组:(1)noninstrumented控制;(2)VD(8毫米扩张器,兼容新生小鼠头部的直径);(3)OVX组;和(4)VD + OVX组。虚假的操作或执行OVX小鼠在这四组,2天后VD(第二天)。老鼠接受膀胱耻骨弓上的油管(SPT)放置手术后17天(天19)。牧民联盟评估在这些老鼠聚氨酯[1克/公斤,腹腔内(i.p)]麻醉SPT(21天)后2天。noninstrumented对照组不进行VD但接受SPT位置和垂直距离测量。检查牧民联盟后的动物牺牲,形态学的尿道,尿道和血浆雌二醇水平,被用于免疫荧光染色和免疫印迹分析。所有实验协议是经中国医科大学动物保健和使用委员会制度。

2.2。阴道扩张

老鼠在8毫米VD组和1.5%异氟烷麻醉。为了避免破裂的阴道,阴道扩张器是通过住宿的黑格尔说道顺序插入和删除操作的黑格尔说道的增加规模的扩张器润滑与Surgilube (Fougera,梅尔维尔,纽约)。随后,一个8 mm扩张器润滑和插入阴道18- - - - - -20.]。1 h后,8毫米扩张器取出来的动物被允许唤醒麻醉自发。noninstrumented对照组不进行阴道扩张。

2.3。卵巢切除术或虚假的操作

接受OVX小鼠或虚假的操作和1.5%异氟烷麻醉。在组1和2,中线纵向腹部切口与2 - 0的针脚缝合关闭。组3和4,两个卵巢切除通过中线纵向切口与2 - 0的针脚缝合关闭。卵巢在磷酸盐(PBS)冲洗,固定在4%甲醛/ PBS一夜之间,和加工在石蜡包埋块,根据组织学方法。横截面的最大垂直于轴的结构分析在4 -被削减μ米厚度。部分被苏木精和伊红染色(圆))21,22]。与10 x光显微镜目镜和40 x物镜是用来分析片。

2.4。耻骨弓上的管植入

异氟烷麻醉下手术是根据以前描述的方法(18- - - - - -20.,23]。一个SPT (PE-10油管,粘土亚当斯,日前,新泽西,美国)VD后植入膀胱19天(19天)。操作的要点如下:(1)中线纵向腹部切口是尿道上方0.5厘米;(2)一个小切口在膀胱壁,和PE-10油管带喇叭提示植入膀胱穹顶;和(3)8丝绸是收紧的财政上的缝合皮下注射导管是挖到脖子,退出了皮肤。

2.5。泄漏点压力测量

牧民联盟评估在这些老鼠在氨基甲酸乙酯麻醉下,2天后植入膀胱导管(VD 3周后,天21)。膀胱导管连接注射器泵和压力传感器。压力和测力传感器信号放大和数字化计算机数据收集以每秒10个样本(PowerLab ADInstruments, Bella Vista,澳大利亚)。老鼠被放置在一个仰卧位的0压力当他们的膀胱充满了室温盐水通过膀胱导管1毫升/小时。膀胱是使用的“手动清空操作如果鼠标无效。每只小鼠的平均膀胱容量确定后3 - 5个排尿周期,和牧民联盟测量如前所述[18- - - - - -20.,23]。短暂的、轻微的压力应用1手指鼠标的腹部half-bladder能力达到的时候。压力缓慢上升直到尿液泄露,在这段时间里,外部施加压力立即被移除。膀胱压力峰值作为垂直距离。至少3牧民联盟获得对于每个动物,和平均垂直距离计算24,25]。

2.6。生殖器大小、体重、血浆雌二醇

生殖道的形态和尺寸检查(生殖道长度(厘米)和体重(mg))。前体重VD VD(0)和3周后(21天)评估。血清样本取自之前所有的动物死亡(21天)。血浆雌二醇是提取第一次在乙醚和商用酶联免疫试剂盒测定。

2.7。免疫荧光染色

所有4组的老鼠是牺牲后立即完成垂直距离测量,尿道和收获。中间的1/3部分尿道与免疫荧光染色检查。每个组织样本嵌入Tissue-Tek最佳切削温度(10月)化合物(美国加利福尼亚州托兰斯),然后冻结,和8 -μm低温恒温器部分是nNOS的切割和用于免疫荧光染色,进气阀打开,ERα,ERβ。免疫荧光染色的部分是permeabilized 0.05% Triton x - 100 5分钟和阻塞正常的5%牛血清白蛋白在PBS 1 h在室温下(26,27]。部分是孵化主要抗体(山羊多克隆nNOS, 1: 300稀释,Abcam (ab1376),剑桥,英国;兔多克隆进气阀打开,1:50稀释,Abcam (ab3523);鼠单克隆ERα,1:300稀释,Abcam (ab2746);或兔多克隆ERβ1:180稀释,Abcam (ab3577))在一夜之间在4°C。的部分和PBS洗3次,孵化与荧光素isothiocyanate-conjugated二级抗体(驴抗体免疫球蛋白共轭,1:200稀释,英杰公司(A11055),美国;山羊anti-rabbit免疫球蛋白共轭,1:150稀释,酶(81 - 6111);或山羊anti-mouse免疫球蛋白共轭,1:300稀释,酶(81 - 6511))在室温下1 h,并在荧光显微镜下观察。

2.8。免疫印迹分析

尿道蛋白质样本由均质化细胞组织的提取试剂(美国表达载体)。细胞溶解产物包含100μ克蛋白质受到10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,被转移到聚偏二氟乙烯膜(微孔集团,贝德福德,妈,美国)。细胞膜是沾染了朱红色年代来验证蛋白质和传输的完整性监控所有蛋白质样品的无偏转移。进气阀打开,检测nNOS ERα,ERβ和3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)薄膜进行了电化学发光的工具包(Amersham生命科学公司,阿灵顿高地,,美国)(28- - - - - -30.使用下面的抗体:山羊多克隆nNOS, 1: 300稀释,Abcam (ab1376);兔多克隆进气阀打开,1:200稀释,Abcam (ab3523);鼠单克隆ERα,1:1000稀释,Abcam (ab2746);或兔多克隆ERβ1:500稀释,Abcam (ab3577)。每个乐队的强度量化使用密度计(分子动力学,桑尼维尔CA)。

2.9。统计分析

数据提出了均值的平均值±标准误差(SEM)为每个组。统计差异组由一个决定- - - - - -方差分析(方差分析)随后费舍尔最显著差异(LSD)作为posthoc测试。统计测试都是双向的。一个小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。所有计算进行使用社会科学统计软件包(SPSS为Windows, SPSS Inc .)、芝加哥,美国)。

3所示。结果

3.1。生殖道长度、生殖器的体重和身体体重增加

四组在生殖道显著不同长度,生殖器体重,体重和身体。OVX生殖器大小显著下降()和VD + OVX ()组(数据1(一)- - - - - -1 (c))。OVX体重增幅显著增加()和VD + OVX ()组但减少VD组()(图1 (d))。

3.2。血浆雌二醇水平

在21天血浆雌二醇水平明显降低OVX和VD + OVX组()与对照组(图2)。

3.3。垂直距离值

垂直距离值VD 21天明显下降(),OVX (),VD + OVX ()组与对照组相比(图3)。

3.4。表达nNOS,进气阀打开,ERα,ERβ

nNOS的表达水平和位置,进气阀打开,ERα,ERβ如数据所示4和5,分别。nNOS和伊诺表达式在VD显著增加()和VD + OVX ()组与对照组相比(数字4(一)和4 (b))。VD ERα表达显著增加()和VD + OVX ()组织,而ERβ表达显著增加只在VD + OVX ()集团(数据5(一个)和5 (b))。

4所示。讨论

出生创伤发生直接导致婴儿的头部的比例高于人类的产道。阴道侧壁的压力可以达到240而言不啻₂O高峰期间收缩如果积极劳动维持超过30分钟,这可能导致microcirculatory缺血和骨盆底肌肉的拉伸,pubourethral韧带、神经组织;这些组合事件会导致隋(31日- - - - - -33]。出生创伤和更年期隋的发展中起着重要作用[34]。根据人类尿道组织缺乏可供分析,我们的VD动物模型——OVX-induced隋代表一个合理的代理研究尿道劳动和更年期的影响。

在目前的研究中,牧民联盟在VD明显减少,OVX,和VD + OVX组,表明阴道创伤和OVX引起尿道损伤。这些发现同意的以前的报告(7]。VD和OVX诱导缺血,拉伸损伤,雌激素缺乏,可能会导致改变下尿路的组成和功能(附近地区)组织35]。

NOS表达激活缺血(12,13),号也被发现在尿道和涉及的神经递质参与尿道松弛(36]。目前的研究表明,nNOS /伊诺表达式在尿道是VD的显著增加和OVX组与对照组相比。这些发现表明,NOS可以通过阴道创伤和OVX被激活。伊诺据说超表达的增加没有合成,导致尿道松弛(12,13]。雌激素缺乏增加NOS表达和减少尿道trophicity [37]。西韦特等人发现了大量的nNOS-positive神经的尿道和膀胱颈部平滑肌束实验大鼠(38]。他们的发现的意义尚不清楚,因为没有在尿道松弛仍存在争议的角色39,40]。然而,我们建议OVX后阴道创伤可能会协同诱导隋,NOS upregulation有关。

此外,雌激素缺乏导致潮热,睡眠障碍,泌尿生殖萎缩,体重增加,骨质疏松症,和增加心肌梗死率(41]。雌激素是一个重要的角色在附近地区和雌激素受体的功能在阴道、尿道、膀胱、盆底肌肉组织。此外绝经后雌激素缺乏症发生导致萎缩性改变,可能与附近地区有关的症状。这些也可能与泌尿生殖萎缩的症状共存。流行病学研究已经涉及雌激素缺乏症在附近地区症状的病因与70%的女性尿失禁的发病有关,最后月经期(42]。我们的研究结果显示,生殖器萎缩和体重的增加发生在OVX和VD + OVX组,因此建议OVX可以引起雌激素缺乏症。ER表达水平在尿道VD + OVX组显著增加。雌激素调节ER表达(43和增强应激信号和基因表达41]。因此,这些结果显示人的表达被激活后,OVX阴道创伤导致的压力。

我们的研究有一定的局限性。首先,盆底结构mouse-quadruped腹部wall-differs从松懈的人类女性。因此,结果外推到人体时应特别谨慎。其次,麻醉下的尿动态进行了研究。幸运的是,没有对象在当前研究膀胱不稳定,这意味着没有逼尿肌过度活跃;这给相信我们的解释流体驱逐没有增加隋的膀胱压力作为证据。第三,我们只观察表情的变化nNOS,进气阀打开,人。使用基因芯片和蛋白质组分析将有利于综合评估特定组织的基因表达和其他机制可能揭示VD + OVX-induced尿失禁;因此,未来的研究应该使用这些方法。第四,大多数研究有关动物的出生创伤的影响盆底用怀孕的大鼠(44]。nongravid老鼠相比,怀孕所带来的不同的激素状态与其他相应更改后(45]。骨盆结构影响怀孕激素可能对创伤的反应不同,这项研究反映了阴道创伤,不是出生创伤。

5。结论

本研究的结果表明,隋唐之后阴道创伤和OVX包括尿道upregulation nNOS /伊诺和人。Upregulation号可能发挥作用的协同效应,隋模拟出生创伤和OVX后发病。这些信息可以提供有趣的线索关于隋的发病机制和建议几个途径小说研究和潜在的新疗法。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由中国医科大学医院(dmr - 103 - 063),卡耐基-梅隆的顶尖大学计划的目标下的台湾教育部台湾科学技术部(NSC 101 - 2314 - b - 039 - 018和102 NSC - 2314 - b - 039 - 025),和部分台湾卫生和福利部的临床试验和研究卓越中心(doh102 - td - b - 111 - 004)。