文摘

人参皂苷提取Rg1是一种天然产品人参c.a虽然Rg1保护组织结构和功能通过抑制局部炎症反应,机理仍然知之甚少。在体外,Rg1剂量依赖性抑制核转录因子的受体激活剂——陷阱活动κB配体- (RANKL)诱导破骨细胞和破骨细胞和破骨细胞的数量减少吸收面积。Rg1也显著地抑制信号通路,包括抑制陷阱的表达、组织蛋白酶K,基质金属蛋白酶9 (MMP9)和降钙素受体(CTR)。在活的有机体内,Rg1显著减少关节炎评分在CIA小鼠和有效控制炎症性关节炎的症状。病理分析表明Rg1显著减毒CIA小鼠的病理变化。明显减少滑膜增生和炎症细胞入侵后,CIA小鼠观察Rg1疗法。阿尔新蓝染色结果表明小鼠接受Rg1显著降低关节软骨的破坏。陷阱和组织蛋白酶K染色结果显示显著减少数量的口服避孕药的近端指间关节和踝关节的关节软骨Rg1-treated老鼠。总之,这项研究表明Rg1减少了炎症破坏periarticular骨通过抑制破骨细胞的分化和成熟CIA小鼠。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性疾病的特点是持久的和对称的炎症性多发性关节炎的手腕,手指、膝盖,脚踝,脚关节。没有有效控制炎症,风湿性关节炎可能导致不可逆转的破坏关节。类风湿性关节炎已经成为导致残疾的主要疾病之一,严重威胁人类健康(1,2]。

RA往往导致滑膜炎的病理损伤软骨和软骨下骨。核心病理变化发生在滑膜和组织细胞学与RA包括滑膜内膜的增生(呈和macrophage-like细胞),炎症细胞的浸润滑膜内膜(巨噬细胞,淋巴细胞等),在发炎滑液和血管生成。

炎性关节滑膜细胞和大量的炎症细胞RANKL分泌受体激活,促进破骨细胞(OC)绑定到排名受体分化和成熟;因此,RANKL OC发展是必要的监管机构(3,4]。RANKL水平与破坏的程度成正比的RA患者关节软骨和软骨下骨(5]。因此,RA-related骨和软骨的破坏被认为是主要由口服避孕药。口服避孕药是超大号的多核细胞来源于造血干细胞monocyte-macrophage血统和目前已知只有体细胞微容量(6]。多核细胞与OC表型被布罗姆利首次发现,伍利在RA患者的滑膜组织7]。在随后进行的研究铃木et al ., OC-like细胞与骨吸收活动被确定通过培养巨噬细胞,成纤维细胞,淋巴细胞RA滑膜组织的患者在缺乏外部刺激(8]。研究c-Fos突变小鼠也直接证明,OC执行关键函数在类风湿性关节炎骨破坏。c-Fos突变小鼠完全缺乏功能性破骨细胞,而其他造血血统,包括T细胞,正常发育。同时突变小鼠[c-Fos (−−) hTNFtg]发展TNF-dependent关节炎没有破骨细胞,他们完全防止骨破坏9]。上述研究表明,OC前体细胞,口服避孕药和相关因素促进OC分化和成熟是关键因素诱导的炎症破坏关节软骨和软骨下骨。风湿性关节炎的不利影响主要是与骨破坏,发生在早期RA。因此,防止软骨和软骨下骨的破坏是至关重要的治疗类风湿性关节炎(2,10]。

考虑到口服避孕药是重要的在RA骨破坏的过程,抑制OC分化和成熟已经成为一个重要的治疗目标。RANKL OC发展的关键因素;denosumab, RA的治疗anti-RANKL单克隆抗体,已进入二期临床试验(11]。Sphingosine-1-phosphate (S1P)调节OC前体细胞的分化和成熟,和S1P受体的拮抗剂,FTY720,能够减少绝经后骨质疏松症和骨质疏松通过抑制成熟的商务功能。尽管FTY720可能被应用在RA治疗(12),研究FTY720仍处于相对早期阶段,还需要进一步的临床研究。

草药药物,如人参皂苷Rg1,目前的几大优势,包括一个广泛的药理作用,毒性低,和多目标的治疗效果,尽管他们可能产生畸形的老鼠胚胎的影响(13]。这些药物因此被认为突破治疗RA。人参皂苷Rg1,人参的主要组成部分田七,属于protopanaxatriol家庭和不同的药理作用,包括抗炎镇痛、免疫抑制和细胞增殖,凋亡调节(14,15]。先前的研究已经证实,Rg1是植物的糖皮质激素受体激动剂和植物雌激素(16,17]。最近的报告表明,从人参中提取p .人参,如人参皂苷Rb1,人参皂苷主要代谢物(CK),和一个n丁醇提取的三七(bt - 201)可以抑制炎症反应在RA动物模型(18- - - - - -20.]。Rg1也具有显著的抗炎作用。最近的动物研究表明,Rg1减轻炎症症状小鼠胶原诱导的关节炎(CIA)和代理是一个潜在的治疗类风湿性关节炎(21- - - - - -24]。然而,Rg1抑制炎症反应的机制尚未被定义。本研究探讨Rg1降低炎症症状的疗效与CIA小鼠通过抑制OC分化和成熟在体外和在活的有机体内方法。这项工作的结果提供了理论依据各种炎性关节疾病的治疗,包括RA,通过使用草药药物。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

从国立Rg1购买食品和药物控制(中国,北京)。重组人类受体激活核因子kappa-B配体(RANKL)从Peprotech购买(英国伦敦)。αmem培养基、胎牛血清和胰蛋白酶买来Gibco(美国纽约大岛)。试剂盒购自表达载体(大岛,纽约,美国)。从Sigma-Aldrich TRAP染色设备购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。逆转录工具包购买从豆类(志贺、日本)和荧光定量PCR试剂盒购自应用生物系统公司(美国)。英杰公司的引物合成(美国纽约大岛)。Osteologic光盘买来BD生物科学(美国圣地亚哥,CA)。CCK-8工具包是购自Dojindo实验室(熊本、日本)。PVDF膜(微孔膜的聚乙二烯二氟化物)从罗氏(瑞士)购买。从皮尔斯BCA蛋白质化验设备购买热费希尔Inc .(美国罗克福德,IL)。MAPK, IKB, NF -κBp65、c-Fos c-Jun NFATc1,磷酸化MAPK、磷酸化IKB, NF -κBp65抗体购买从细胞信号(美国贝弗利,MA)。

2.2。细胞培养

RAW264.7小鼠单核巨噬细胞细胞系是从细胞库获得上海细胞生物学研究所中国科学院。MEM培养基对RAW264.7细胞培养是补充10%的边后卫,青霉素(100单位/毫升),和链霉素(100 ug /毫升)。细胞被放置在一个37°C, 5%的公司₂孵化器。RANKL 50 ng / mL的浓度添加到细胞培养诱导OC RAW264.7细胞分化。

2.3。检测细胞增殖

RAW264.7细胞接种到96孔板的密度1×10⁵/每在100毫升(约1000个细胞μL(媒介)。100年6 h的细胞培养μ信用证的一个没有血清饥饿中。无血清培养基所取代αmem含有10%的边后卫有或没有的存在Rg1(1、10和100μg / mL)。中被删除后24、48、72、和96 h的孵化,取而代之的是100年μL CCK8染料无血清培养基的10%。文化是终止后1 h和450海里的吸光度每个测量使用一个微型板块读者。吸光度值表明细胞增殖水平在每个好,和细胞生长曲线相应的被吸引。

2.4。通过膜联蛋白检测细胞凋亡V-FITC / PI双染色

RAW264.7细胞接种在6厘米直径菜1×10的浓度⁵/毫升(约30000个细胞在3毫升的介质)和孵化24小时37°C, 5%的公司₂孵化器。中被移除,新鲜的细胞培养中有或没有的存在Rg1(1、10和100μg / mL)。培养基是取代每2 d。4 d孵化后,胰蛋白酶消化后收集细胞,用冰冷的PBS洗两次。这些细胞被resuspended在100年μL膜联蛋白V绑定缓冲区,和5μ和10 L的膜联蛋白V-FITC解决方案μL (propidium碘(π)染色解决方案然后补充道。在黑暗中混合物在室温下放置15分钟,和400年μL膜联蛋白V绑定缓冲了。所有数据被发现使用流式细胞分析仪(美国BD生物科学)和分析使用CellQuest Pro软件。正常细胞-膜联蛋白V和π染色(左下象限cytograms,),细胞凋亡早期阶段膜联蛋白V染色阳性,但不利于PI染色(右下象限),和细胞凋亡或坏死细胞阶段末是积极的膜联蛋白V和PI染色(右上象限)。每个实验重复三次。

2.5。陷阱染色的细胞

RAW264.7细胞接种到96孔板的密度2×10⁴/每在100毫升(约2000个细胞μL(中)和培养RANKL (50 ng / mL)和不同浓度的有或没有Rg1 (1, 100μg / mL) 6 d。培养基被替换为新的介质包含这些试剂每2 d。所有组的细胞收集4 d孵化后,染色使用TRAP染色设备根据制造商的协议,并使用显微镜观察(100 x的目标)。TRAP-positive多核巨噬细胞有超过三个核算作口服避孕药。OCs的数量在每一个在所有组数,每一组的平均计算。

2.6。骨吸收坑试验

RAW264.7细胞接种到osteologic光盘5×10的密度³/每在100毫升(约500个细胞μL(中)和孵化24小时在37°C, 5%的公司₂孵化器诱导OC RAW264.7细胞的分化。井被分成正常对照组,RANKL-stimulated集团和低收入,中期,和高剂量Rg1组。使用介质被替换为新的每一个2 d。培养10 d后,osteologic光盘从文化中恢复过来,超声波处理以去除剩余的细胞碎片,并使用显微镜拍照(每片五个随机选择的领域)。每张照片分析了使用Image-J软件,再吸收面积的百分比每组相应的测定。

2.7。实时rt - pcr分析

RAW264.7细胞接种到6-well盘子2×10的密度⁴/毫升(约40 000细胞/ 2毫升的介质)和孵化48或96 h 37°C, 5%的公司₂孵化器诱导OC RAW264.7细胞的分化。井被分成正常对照组,RANKL-stimulated集团和低收入,中期,和高剂量Rg1组。使用介质代替新鲜每一个2 d,和4 d细胞被孵化。试剂盒在1毫升/添加,提取细胞总RNA, reverse-transcribed cDNA利用Transcriptor第一链cDNA合成装备。相应的互补基因量化使用SYBR绿色PCR设备根据制造商的指示。使用的引物序列如下:陷阱:转发:5′-CCAATGCCAAAGAGATCGCC-3′和反向:3′-TCTGTGCAGAGACGTTGCCAAG-5′;组织蛋白酶K:转发:5′-GACGCAGCGATGCTAACTAA-3′和反向3′-CCAGCACAGAGTCCACAACT-5′;CTR:转发:5′-ACCGACGAGCAACGCCTACGC-3′和反向3′-GCCTCACAGCCTTCAGGTAC-5′;MMP-9:转发:5′-CTGGACAGCCAGACACTAAAG-3′和反向:3′-CTCGCGGCAAGTCTTCAGAG-5′;NFATc1:转发:5′-CCGTTGCTTCCAGAAAATAACA-3′和反向:3′-TGTGGGATGTGAACTCGGAA-5′; c-Fos: forward: 5′-GCAGAAGGGGCAAAGTAGAG-3′ and reverse: 3′-GTGTATCTGTCAGCTCCCTC-5′; c-Jun: forward: 5′-ACTCGGACCTTCTCACGTCG-3′ and reverse: 3′-TAGACCGGAGGCTCACTGTG-5′. The following PCR program was used: initial denaturation at 95°C for 2 min, 40 cycles of denaturation at 95°C for 1 min, annealing at 55°C for 15 s, and extension at 60°C for 1 min.

2.8。免疫印迹

RAW264.7细胞接种到6厘米直径菜1×10的密度⁵/毫升(约300 000个细胞/ 3毫升的介质)中表示时间有或没有RANKL (50 ng / mL)和/或Rg1(1、10或100μ在37°C g / mL), 5%的公司₂孵化器诱导OC分化。总蛋白提取和免疫印迹。这些细胞被收集和利用prechilled PBS洗了三次。这些细胞被resuspended在100年μL裂解缓冲和孵化15分钟在4°C。细胞溶解产物转移到1.5毫升EP管和离心20分钟的12 000 r / min。上层清液被转移到一个新的EP管和存储在−80°C或检查立即通过BCA细胞蛋白质含量的方法。P38的水平,磷酸化P38 (pP38) ERK1/2,磷酸化ERK (pERK1/2),物,磷酸化物(pJNK)我κBα磷酸化,我κBα(πκBα),NF -κBp65,磷酸化NF -κBp65 (pNF) - - -虽然κBp65)、NFATc1 c-Fos、c-Jun GAPDH确定如下所述。细胞溶解产物含有20μg总蛋白质的分离使用15% SDS-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)凝胶和electrotransferred聚乙二烯二氟化物膜。细胞膜在TBS缓冲区被封锁在5%脱脂牛奶(Tween-20 0.1%;pH值7.6)在室温下1 h和孵化与相应的抗体主要在一夜之间在4°C。与TBS洗涤后,适当的膜被孵化peroxidase-conjugated二级抗体与摇晃1 h在37°C。免疫反应性的蛋白质被发现使用分子成像仪ChemiDoc XRS +成像系统和化学发光(Bio-Rad实验室Inc .)、大力神、钙、美国)。蛋白质乐队的灰色值测量使用图像实验室2.0软件(美国CA Bio-Rad实验室Inc .)。

2.9。CIA小鼠的动物研究

24名健康男性DBA / 1 j小鼠在年龄(6 - 8周g)是随机选择的。男性DBA / 1 j小鼠皮内接种200底部的尾巴μ克牛胶原蛋白II型(美国Chondrex,雷蒙德,佤邦)在100年解散μL 0.05醋酸和混合同等体积的CFA(美国MI Difco)。三周后,这些动物reimmunized 200μg的CII乳化不完全弗氏佐剂(Difco)。老鼠一天两次,随机分为观察胶原蛋白溶剂组和一个Rg1治疗组(12.5毫克/公斤/天)后关节肿胀发达(约28天第一次注射后)。在每组小鼠()有每日腹腔内注射14天。控制老鼠()腹腔注射同等体积的生理盐水。治疗后,小鼠得分基于关节肿胀的程度,关节(0 - 4分)影响。细节描述如下:0点,没有红肿;1点,轻微的红肿的手腕或三个脚趾关节;2点,温和红肿的手腕,脚踝,或者超过3趾关节;3点,严重的炎症反应在手腕或脚踝关节;和点,严重的炎症反应在脚踝,手腕,脚趾关节。一只老鼠的最高分是16。老鼠在43天牺牲了。他们的踝关节和脚趾关节脱钙与8%硝酸溶液16 h其次是传统的脱水,石蜡渗透,嵌入,削减(3μ米)、烘焙和脱蜡。打蜡后,滑膜增生、白细胞浸润和软骨破坏被hematoxylin-eosin评估(他)和阿尔新蓝染色。关节炎评分(0 - 4分)在他染色确定如下:0点,正常的脚踝;1点,轻微的焦渗透;2点,温和渗透;3点,严重的炎性浸润血管生成或软骨损伤;4点,血管生成和严重的入侵在关节软骨和软骨下骨。在阿尔新蓝染色法半定量的分数是基于三点评分系统,其中0意味着没有蛋白聚糖和3表示完整的蛋白聚糖的损失。骨片烤,脱蜡,被陷阱和组织蛋白酶K染色如下所述。部分被沾染了抗酒石酸酸性磷酸酶(陷阱)染色工具包(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。 In a typical procedure, bone slices were digested by 500 ng/mL pepsin for 5–10 min, treated with 3% hydrogen peroxide for 10 min, and washed three times (2 min each) with PBS containing 0.3% Tween (PBST). Bone slices were then incubated with rabbit anti-mouse cathepsin K antibody (1 : 100 dilution) overnight at 4°C, washed three times with PBST, and incubated with 1 : 200 dilution of horseradish peroxidase- (HRP-) labeled goat anti-rabbit secondary antibodies at room temperature for 1 h. Slices were incubated with DAB for 30 s, rinsed with water for 5 min, mounted, and observed under a microscope. TRAP-positive cells and cathepsin K-positive cells were counted in five areas of each ankle.

2.10。统计分析

所有的值被表示为均值±SD,除非另有说明。使用SPSS 13.0软件进行统计分析。由单向方差分析的结果分析了不同群体Dunnett事后测试紧随其后。差异的概率(P)值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Rg1对细胞活力的影响

RAW264.7细胞与不同浓度的Rg1培养。细胞增殖是衡量CCK-8化验后24日,48岁,72和96 h评估Rg1对RAW264.7细胞的细胞毒性。细胞在正常控制、Rg1低剂量、中等剂量,和高剂量组表现出类似的增长曲线,而且没有观察到统计细胞增殖的差异在这些组。如图1(一)、Rg1浓度不大于100μg / mL并未表现出明显的细胞毒性,抑制细胞增殖。96 h后收集细胞孵化有或没有Rg1(1、10和100μg / mL),然后沾膜联蛋白V和propidium碘(π)来确定Rg1在OC分化过程中细胞凋亡的影响。早期和晚期凋亡的速度在正常对照组为2.71%±0.6285%;相比之下,细胞凋亡率Rg1低剂量,中等剂量和高剂量组分别为2.67%±0.106%,2.723%±0.09701%,分别和2.957%±0.231%。这些结果表明,Rg1浓度不大于100μg / mL没有明显影响细胞增殖和细胞凋亡(数字1(b)和1(c))。

3.2。Rg1对OC分化RANKL-Stimulated RAW264.7细胞

表达和分泌的陷阱,分化OCs的标志酶,对OC分化和成熟至关重要。陷阱染色是检测OC的标准技术的形成,和TRAP-positive多核细胞包含三个多核被认为是多核口服避孕药。Rg1的影响在原始264.7 OC分化和成熟细胞是通过陷阱染色检查。虽然没有口服避孕药中形成正常对照组,无数的酒红色多核细胞观察RANKL-stimulated组。264.7当RANKL-stimulated原始细胞培养Rg1(1、10和100μg / mL),口服避孕药观察明显降低剂量依赖性的方式。Rg1 (100μg / mL)显著地抑制OC形成()(数据2(一个)和2 (c))。这些结果表明,Rg1有效抑制OC的形成。

口服避孕药是唯一已知的体细胞与微能力。的数量和面积吸收坑上形成osteologic光盘检查评估Rg1对OC RAW264.7细胞分化的影响。如数据所示2 (b)和2 (d),正常对照组osteologic光盘光滑,不表现出明显的吸收。相比之下,众多大型再吸收区域观察osteologic光盘RANKL-stimulated组。几个吸收坑被发现Rg1组(1、10和100μg / mL),观察到的坑数量减少剂量依赖性的方式。的区域吸收坑使用Image-J软件进行了分析。再吸收区域在Rg1组小于RANKL-stimulated集团和Rg1 (100μg / mL)的面积显著减少吸收坑()(数据2 (b)和2 (d))。总之,高浓度的Rg1显著抑制活动和商务的面积,减少数量的吸收。

3.3。Rg1对OC标记基因的表达在RANKL刺激RAW264.7细胞

几个与OC功能相关的蛋白质,包括陷阱,组织蛋白酶K, Ctr,和MMP-9表示在OC RAW264.7细胞的分化和成熟。的相对表达水平陷阱,组织蛋白酶K, Ctr, MMP-9 Rg1组通过实时定量PCR(图3)。结果表明,Rg1显著抑制这些基因的表达水平浓度的方式。

3.4。影响Rg1 RANKL-Induced表达激活蛋白1和核转录因子的激活T细胞在RANKL-Stimulated RAW264.7细胞

激活蛋白1 (AP-1)和核转录因子的激活T细胞(NFATc1)是至关重要的转录因子调节RANKL-induced OC分化和成熟。c-Fos和c-Jun AP-1转录因子家族的成员。免疫印迹证实Rg1抑制c-Fos的表情,c-Jun, NFATc1与OC开发(用剂量依赖性的方式(数字)4(一)和4 (b))。rt - pcr结果与免疫印迹结果一致。如图4 (c),Rg1产生剂量依赖性抑制作用在信使核糖核酸(mRNA) 48 h后上述基因的表达文化。这些结果表明,Rg1抑制OC分化和成熟通过抑制转录因子的表达,c-Fos c-Jun, NFATc1。

3.5。Rg1对RANKL-Induced MAPKs和NF -κB在RANKL刺激RAW264.7细胞活化

增殖蛋白激酶(MAPK)和NF -κB是RANKL-stimulated OC的关键信号通路在此过程中分化和成熟。MAPK的磷酸化水平,我κBα和NF -κB p65被免疫印迹的影响来评估测量Rg1 MAPK和NF -κB信号通路。磷酸化水平的MAPK和我κBα开始增加20分钟后RANKL感应,达到峰值在40分钟,60分钟后逐渐减少。磷酸化水平的NF -κB p65 RANKL-induced组继续增加在整个60分钟观察期。然而,磷酸化水平的MAPK(物、ERK1/2和P38),我κBα和NF -κB p65 Rg1-treated组远低于那些RANKL-induced组(数字5(一)和5(b));这一发现表明,Rg1抑制NF -的活动κBp65、MAPK、物、ERK1/2和P38在OC分化和成熟。

3.6。抑制作用的Rg1在CIA小鼠关节炎

小鼠腹腔注射Rg1 14 d日第一次免疫后。尽管中情局的关节炎评分和Rg1-treated老鼠开始增加最初,Rg1-treated老鼠的得分显著低于CIA小鼠从33天到42。这个结果表明Rg1抑制CIA小鼠关节炎症反应(,图6)。苏木精和伊红染色的幻灯片显示关节胶囊在正常对照组功能完整的滑膜和纤维膜。关节滑液完全保留在蛀牙,和关节软骨的表面光滑,没有任何增生。相比之下,中央情报局的老鼠的滑液膜被毁,观察炎性细胞的浸润滑液和滑膜组织。水肿发生在组织邻近关节和关节腔消失。

破坏的程度在关节胶囊Rg1-treated老鼠在CIA小鼠比这少得多。与CIA小鼠相比,低程度的炎症细胞的浸润滑液和观察滑膜衬里Rg1-treated老鼠和这个群体的共同蛀牙(图的规模增长7(一))。组织病理学评分Rg1-treated关节的老鼠明显低于那些CIA小鼠()。组织学分析关节与阿尔新蓝染色证明厚在健康小鼠软骨表面光滑,没有任何结构性破坏。与卫生控制相比,CIA小鼠和Rg1-treated小鼠均表现出不同程度的软骨破坏。虽然两组显示粗糙表面的软骨,明显轻病理变化观察Rg1-treated老鼠相比之下,CIA小鼠组;这一发现表明Rg1的抑制作用在关节软骨破坏和炎性反应(图7 (b))。确认的保护作用Rg1进一步对CIA小鼠软骨破坏,我们测量陷阱的表达和组织蛋白酶K在小鼠关节的口服避孕药。同时陷阱和组织蛋白酶K表情中情局和Rg1-treated老鼠高于控制,大大减少陷阱和组织蛋白酶K表示Rg1-treated老鼠与CIA小鼠相比,数据7 (c)和7 (d)),这表明Rg1减少软骨破坏通过抑制CIA小鼠OC分化和成熟。

4所示。讨论

类风湿性关节炎的主要病理特征包括慢性滑膜炎和软骨破坏(1,2,10]。治疗风湿病的治疗的目标是不仅削弱关节炎症的临床症状,但也抑制关节破坏的过程。一些风湿性关节炎药物不能有效控制RA-related骨破坏。例如,长时间使用甲氨蝶呤和地塞米松导致进一步的骨破坏通过促进OC分化和成熟25,26]。理想的治疗风湿性关节炎的药物应该有效地抑制OC分化和成熟并最终控制骨破坏(11,12,27,28]。天然化合物的候选材料探索新药。人参皂苷Rg1,人参的主要活性成分三七,功能结构特点类似于类固醇激素和展览不同的药理作用,包括抗炎、反应力的活动,和免疫调节。在这些影响中,抗炎是最突出的。在体外实验证明Rg1不仅降低TNF -α和il - 6表达(20.),但还能抑制LPS-induced H₂O₂释放和减少CD11b / CD18表达水平(22]。在活的有机体内研究表明,Rg1有效地减少了CIA小鼠急性和慢性炎症反应,而不会导致激素性不良反应(24]。研究表明,Rg1有抗炎作用在活的有机体内和在体外,可能是因为Rg1刚性与糖半个甾族的骨架,这是糖皮质激素受体的功能配体(16,24]。Rg1也有雌激素样的活动可以减少激素性不良反应(17]。这两种效应的基础可能是Rg1各种药物的影响,需要进一步的研究。Rg1也已被证明能够影响骨形成。例如,Rg1能够促进大鼠骨折愈合(29日]。丹参(在中国丹参)用于治疗骨质疏松症,因为其丰富的组件,Rg1,有治疗效果,如抑制骨质疏松和骨形成增加(30.]。然而,抗炎的机制和antiosteoporotic Rg1尚未澄清的效果。当前的研究表明,Rg1减少炎症性骨破坏通过抑制OC分化和成熟。

OC分化和成熟是多步过程,包括细胞增殖、分化、融合、激活。在目前的研究中,我们发现Rg1抑制破骨细胞分化而维持细胞生存能力。OCs源于造血细胞与单核巨噬细胞细胞谱系(6)和蛋白质的表达,如陷阱,CTR, MMP9,和组织蛋白酶K,标志着成熟的大型商务与骨再吸收的能力(多核的31日- - - - - -34]。Rg1剂量依赖性降低RANKL-induced表达式的陷阱,CTR, MMP-9,啧啧,减少骨破坏活动通过抑制陷阱OC数字。因此,Rg1不仅显著抑制破骨细胞前体成TRAP-positive单核细胞的分化,但也防止其融合形成多核破骨细胞活跃。

RANKL是破骨细胞的分化和激活所必需的一个至关重要的因素。RANKL-deficient老鼠展示完全没有破骨细胞和骨硬化病(3,4]。RANKL的信号机制已被广泛的研究。绑定的RANKL受体激活TRAF蛋白质家族,这进一步引发几个信号通路,如NF -κB MAPK AP1, NFATcl。

NF -κB转录因子RANKL-induced OC发展至关重要。经典的NF -κB信号通路包括我的激活κB激酶(IKK)复杂,磷酸化κBα和目标为ubiquitin-dependent退化(35]。先前的研究表明,p65-deficient老鼠表现出高水平的表达嵌合小鼠胚胎死亡而p65设法生存下来;这些小鼠口服避孕药较少表现出显著减少骨吸收后注入RANKL与控制老鼠。PDTC,特定的NF -抑制剂κB,显著减少RANKL-induced陷阱活动RAW264.7细胞(36]。可用的研究表明NF -κB信号通路对OC分化和成熟是至关重要的。杜等人报道,Rg1抑制LPS-induced RAW264.7细胞炎症事件负调节炎症介质和NF -κB激活(24]。我们的数据表明,Rg1抑制NF -激活和核易位κ我通过抑制κB降解。这些结果表明,抑制NF -κB-dependent通路的机制参与antiosteoclastogenic Rg1的效果。

除了NF -κB, RANKL也激活一系列重大胞内信号转导途径,其中包括物、ERK, p38和转录因子,如AP-1 NFATc1。RANKL调节OC分化通过促进MAP激酶家族的三种蛋白质的活动,包括细胞外signal-regulated激酶(ERK) c-Jun n端激酶(物),和p38-MAPK37,38]。这些激酶也扮演关键角色在破骨细胞的发展和被视为关键分子靶点治疗应用在炎症性骨破坏39- - - - - -43]。在目前的研究中,我们评估的影响Rg1激活这些MAPKs,发现Rg1抑制磷酸化。这些结果说明磷酸化Rg1 MAPKs有助于antiosteoclastogenic效应的RANKL-stimulated RAW264.7细胞。

NFATc1,一个关键因素影响OC分化,调节OC标记基因的表达,如组织蛋白酶k,陷阱,MMP9,降钙素受体(44- - - - - -46]。AP-1由Fga (c-Fos, FosB、Fra-I Gra-2)和小君(c-Jun、JunB和JunD)。c-Fos和c-Jun报道NFATc1转录激活的关键在RANKL-induced osteoclastogenesis [47- - - - - -50]。因此,我们建议,抑制RANKL-induced c-Fos Rg1和c-Jun表达的一个相关因素影响NFATc1下游信号通路的抑制。NFATc1的差别的结果对这些基因的表达,NFATc1-mediated osteoclastogenic基因,如陷阱,MMP9, CTR,组织蛋白酶K [46,47,51),与此同时Rg1所抑制。从这些数据来看,我们假定Rg1授予抑制活性的差别通过抑制osteoclastogenesis对这些RANKL-induced NFATc1表达式。

在当前的动物实验中,关节炎评分在CIA小鼠腹腔内注射后开始明显降低Rg1 6 d。组织病理学的近端指间关节和踝关节沾阿尔新蓝说明减少破坏软骨的CIA小鼠Rg1治疗后。陷阱和组织蛋白酶K的滑膜组织染色CIA小鼠表现出极大地降低了商务Rg1治疗后的数量。结果从两个在体外和在活的有机体内实验表明,Rg1抑制NF - OC发展产生的不利影响κB信号通路、NFATc1表达式和MAPK活性,最终抑制炎症反应和软骨破坏CIA小鼠。

我们的数据表明,Rg1明显抑制RANKL-induced破骨细胞形成RAW264.7细胞在体外。然而,我们只是检查了直接影响破骨细胞祖细胞使用RAW264.7细胞不需要支持细胞。因此,破骨细胞形成coculture系统可能通过直接作用于破骨细胞祖细胞或影响间接影响支持破骨细胞祖细胞的分化成骨细胞表达和分泌RANKL和csf (48]。因此,我们在进一步的研究将验证这些间接影响使用cocultured主骨髓巨噬细胞和成骨细胞。地塞米松增加破骨细胞形成和腔隙- csf和RANKL吸收在体外(49];相反,Rg1,糖皮质激素受体的功能配体(16,24),抑制osteoclastogenesis RANKL-induced RAW264.7细胞。这可能是因为Rg1具有雌激素样效应导致的减少osteoclastogenesis [17,50]。进一步研究无疑是必需的。

同时控制炎症和软骨破坏需要积极治疗类风湿性关节炎的1]。先前的研究表明,Rg1能够抑制炎症反应在CIA小鼠关节。在当前的研究中,不仅Rg1 RA-related减少炎症反应,还抑制resorption-induced软骨破坏通过抑制OC分化。在一起,我们的数据可能会解释可能的分子机制,由Rg1可以缓和CIA-evoked骨破坏,而且可能会使Rg1小说一个潜在的治疗类风湿性关节炎和骨质疏松症等骨骼疾病微调RANKL-induced破骨细胞分化和功能。

利益冲突

作者没有财务利益冲突。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(81271988)、江苏省自然科学基金(BK2012876),中国国家自然科学基金(批准号81271986),江苏省自然科学基金(批准号BK2011843)。