文摘
抗菌肽的溶菌酶是一个重要因素,先天免疫和施加高抗菌活性的潜力。在目前的研究中,我们评估多个受伤患者的血清中溶菌酶的表达,随后分析了其可能的来源和信号通路。溶菌酶的表达在血液样本检查多个创伤患者创伤后从创伤的一天到14天ELISA。对溶菌酶的主要来源,其表达和调控血清样本,不同的血液细胞,ELISA和实时PCR组织样本进行分析。中性粒细胞和肝细胞与细胞因子和上层的刺激金黄色葡萄球菌。目前的研究表明血清中溶菌酶的诱导和释放多个受伤的病人。最高的溶菌酶表达的细胞和组织中检测出中性粒细胞进行测试。如白细胞介素- 6和刺激与创伤相关因素金黄色葡萄球菌溶菌酶诱导表达。肝组织样本无创伤的患者显示小溶菌酶表达相比,中性粒细胞。与细菌碎片刺激后,溶菌酶的表达显著肝细胞是调节。toll样受体2,革兰氏阳性细菌的经典受体蛋白质,发现了一个可能的溶菌酶诱导的目标。
1。介绍
多个创伤是第三个最丰富的死亡原因为所有年龄、心脏病和癌症。通常多个创伤导致的复杂的病理生理和免疫反应。到目前为止的分子机制尚未完全了解。各种免疫变化称为创伤后炎症反应取决于个人损伤模式和损伤后的时间1]。在创伤后炎症反应由各种细胞释放多种细胞因子(2]。il - 6最近被证明是优秀的临床利益,现在可以被用作临床标记在脓毒症预后3]。伤口和多个创伤骨折后,可以作为总体感染率非常低(4]。似乎在免疫系统机制防止外伤病人感染。
在炎症反应一些防御机制被激活。抗菌肽(AMP)属于宿主防御肽(黄芪丹参滴丸)和先天免疫的关键元素,提供第一个障碍在许多上皮细胞对抗入侵的微生物。尽管开放性骨折以及伤口可以引起局部感染和败血症,AMP监管创伤后几乎没有被检查。
在前面的调查我们验证,把受伤的患者的血清抗菌能力明显高于血清健康的捐赠者。进一步观察结果支持假设小黄芪丹参滴丸负责抗菌的效果。尽可能的介质,我们发现人类的感应beta-defensins 2和3 (hBD-2和hBD-3)和繁殖受伤患者的血清中抗菌肽LL-37 [5]。虽然这些黄芪丹参滴丸显著调节后创伤,创伤血清的高抗菌能力的来源无法完全澄清。
溶菌酶是第一个描述宿主防御肽(6)和协同运作hBD-2 hBD-3, LL-37 [7]。这是一个先天免疫系统的重要组成部分和杀死细菌的催化水解细胞壁肽聚糖,但它也展示catalysis-independent抗菌性(8,9]。属于宿主防御肽,它还控制宿主的生理功能,如炎症、血管再生和伤口愈合10]。另外血溶菌酶水平的评价临床意义在结节病等慢性病的诊断,风湿性关节炎,或节段性回肠炎。
然而宿主防御肽表达,特别是溶菌酶,尚未完全阐明炎症反应。
在这项研究中,我们分析了创伤患者的血清溶菌酶诱导抗菌效果和调查可能的细胞来源。我们检查了可能的诱导和刺激对溶菌酶的表达途径。
2。方法
2.1。患者人群
32个成人与多个损伤的病人(16 - 65岁)前瞻性研究。入选标准是一个损伤严重度评分(ISS) 16分或更高版本不存在严重的创伤性脑损伤(尽管缩写损伤尺度为头部受伤被包含在ISS)和主进入我们的机构。AIS的头部损伤分三个或更多被认为是严重的创伤性脑损伤。排除标准是穿透性损伤,严重的创伤性脑损伤,患者创伤事件后没有直接承认我们的机构。所有程序都一致的修订版本赫尔辛基宣言(第41届大会于1989年在香港)。当地伦理委员会批准了这项研究。一级亲属签署知情同意包含病人的研究中,病人插管和麻醉。
2.2。管理和治疗的患者
一个标准化的临床检查之后,腹部和骨盆的聚焦超声。图中显示所有患者接受创伤的头部,胸部,腹部、骨盆和脊柱。分析的结果是放射科医生和一个参加创伤外科医生。时进入重症监护室(ICU),临床检查和集中评估包括超声被重复。尽快稳定骨折通过明确的内固定或临时外部稳定。如果病人需要剖腹手术,之后稳定骨折了。
2.3。对照组
一群6健康志愿者(3女性和男性)在18岁到65岁被随机选中的正常基线值的确定所有参数评估。志愿者们以前从未受到任何损伤或急性或慢性健康问题。
2.4。收集的血液
静脉EDTA-blood(9毫升Monovette Sarstedt,德国)收集每日早上7点从创伤患者在14天内等离子体的准备。入院后的第一个样品是直接去医院。血液离心10分钟2000 g在室温内30分钟。浮在表面的血清是储存在−80°C。
2.5。溶菌酶ELISA
溶菌酶ELISA进行描述的Varoga et al。11]。溶菌酶捕获抗体和检测抗体是由北欧免疫学实验室,荷兰。
2.6。实时聚合酶链反应
实时聚合酶链反应(PCR),从人工培养的肝细胞RNA分离(HepG2) RNeasy-Total RNA工具包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的指示。RNA的全血样品净化用受伤的患者和健康志愿者进行QIAamp RNA血液迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。总RNA (1000 ng)是用于逆转录和随后与gene-specific实时PCR引物。实时PCR进行描述的Varoga et al。11]。感兴趣的基因检测使用TaqMan探针:Hs01548808_m1(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。
2.7。招聘的组织
表皮是来自患者发生骨折后骨缝术。后皮肤切口一块50×2毫米的表皮被进一步检查。从患者肝组织肝切除。10毫克的宏观健康组织降低了进一步检查。部门的所有操作进行创伤外科和内脏手术石勒苏益格-荷尔斯泰因州大学医学中心,基尔校园。当地伦理委员会批准了这项研究。
2.8。隔离与Polymorph-Prep中性粒细胞
9毫升的静脉血标本从健康志愿者EDTA Monovette的使用。中性粒细胞是孤立的使用Polymorph-Prep从全血(挪威Axis-Shield)根据制造商的指示。5毫升的血仔细分层Polymorph-Prep 5毫升。离心法在500 g×30分钟后在室温下单核细胞和多形核的细胞分离和resuspended 0.45%氯化钠。
2.9。中性粒细胞的培养和刺激
实验孤立的细胞摄取的RPMI 1640 -细胞培养基与7%胎牛血清,1%的谷酰胺(2毫米),和1%的青霉素和链霉素(5000 U /毫升/ 5000μg / mL)。中性粒细胞是应用于6-well 1.5板·106在每个细胞和刺激50 ng / mL白介素(il - 6) (Tebu,奥芬巴赫,德国)和SA(浮层1:100;组装所描述的格拉泽et al。12在37°C]) 24 h。溶菌酶的浓度在上层清液由ELISA测定。每个实验进行了三次,结果相比,如果细胞。
2.10。隔离的单核细胞
9毫升的静脉血标本从健康志愿者EDTA Monovette的使用。单核细胞位于相间使用Polymorph-Prep被摄入后在30毫升冰磷酸缓冲盐和磷酸盐缓冲盐水洗了5次,30毫升300×g。单核细胞摄取在冰中无血清和统计计数室调整细胞浓度的107细胞/毫升。与此同时自体血清获得密度梯度离心法离心机,分别在720和1600××g g。培养皿和无血清thrombocytes孵化15分钟。洗后5毫升磷酸盐缓冲剂的培养皿,盐水胎牛血清添加单核细胞,以便集中生成3%胎牛血清的培养基。所有的菜都满5毫升细胞悬液和孵化的45分钟在标准条件下(37°C, 5%有限公司2,21%的人啊2,98%的湿度)。相应的不依从细胞与温暖的磷酸缓冲盐水冲洗。菜肴和5毫升冰覆盖着剩余的贴壁细胞无血清培养基和孵化冰1 h。1 h范围后单核细胞引起的冷刺激通过透射光显微镜可以看到这些细胞可以与冰磷酸盐缓冲盐水冲洗,使用1000年μL吸管。单核细胞在10毫升收集管和洗冰磷酸缓冲盐600×g。颗粒在RPMI resuspended介质。使用计数室的细胞数量和活力的仔细检查悬挂在锥虫蓝。活力一直超过95%。
2.11。肝细胞的培养和刺激
永生化肝细胞的实验,HepG2(细胞系服务,德国)。这些细胞代表组织学和差异化的实质肝细胞的生物学特性13]。
细胞培养中所述分配器的指示。种植800000个细胞都变成一个25厘米2细胞培养瓶2毫升的细胞中。细胞被刺激50 ng / mL il - 6和1:100 SA的上层清液。阻断实验,细胞被孵化10μg / mL TLR2抗体(美国圣地亚哥eBioscience) 1 h和刺激。孵化了37°C的环境湿度5%股份有限公司2在一个孵化器。每个实验完成了三次,结果相比,如果细胞。
2.12。统计分析
数据表示为测试样本的平均数±标准差。统计学意义是评估用单向方差分析Bonferroni调整。统计学意义是假定的概率值小于0.05。斯皮尔曼的线性回归分析进行评估蛋白血清浓度的相关性。
3所示。结果
3.1。把受伤的病人的血清溶菌酶含量升高
探讨血清中溶菌酶是否诱导创伤之后,我们分析了创伤患者的血清(ISS > 16)在一段时间内的14天,相比他们健康的对照组。第一周内溶菌酶浓度增加了一倍,后来下降(图1)。最大水平测量6天(μg / mL)。溶菌酶浓度的重要海拔可能证明第四天至第七天相比,健康对照组(μg / mL)。
3.2。溶菌酶的诱导表达在白细胞增加受伤的病人
把受伤的病人检测血清中溶菌酶后,我们试图找出几个来源肽。在感染后宿主防御的upregulation肽已被证实对皮肤之前,肝脏和血液细胞,尤其是对单核细胞和多形核白细胞(中性粒细胞)14]。因此我们关注这些细胞系在目前的研究。作为可能的来源的血清水平,分析了全血白细胞来自相乘受伤的病人。确凿的血清中的蛋白质含量、实时PCR显示显著增加溶菌酶基因表达在7天(而控制(图2))。
3.3。在中性粒细胞和单核细胞溶菌酶表达
大量的黄芪丹参滴丸存储在中性粒细胞的颗粒,使高达50%的颗粒内容。我们测试了中性粒细胞和单核细胞重要的创伤后炎症细胞介质血清反应检查他们是否表达类似的溶菌酶的浓度(图3(一个))。中性粒细胞含有更高浓度的溶菌酶(μ在100000个细胞g / mL)比单核细胞(μ在100000个细胞g / mL)。
(一)
(b)
3.4。体外刺激中性粒细胞
il - 6是一个著名的细胞因子,调节多种创伤之后,与多器官功能障碍综合征的风险(插件)多发性创伤后15]。主要原因为hyperinflammation和全身炎症反应综合征(SIRS)可能导致插件是入侵金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌的上下文中)广泛的软组织损伤。检查是否溶菌酶是典型的创伤后炎症刺激引起的,中性粒细胞与il - 6和孵化金黄色葡萄球菌。兴奋剂都增加了溶菌酶的浓度显著如图3 (b):il - 6 (μ在100000个细胞g / mL),金黄色葡萄球菌(μ在100000个细胞g / mL)。
3.5。溶菌酶表达中性粒细胞、肝脏和表皮
关于进一步溶菌酶表达的来源,我们分析了样品相比,肝脏没有严重的伤害和表皮,井调查了溶菌酶的来源。与湿重,最高的储存大量细胞溶菌酶测定中性粒细胞(7.4±1.1μg / mg湿重)。肝脏含有近似的样品溶菌酶作为表皮样本(μg / mg和μ(图g / mg湿重)4)。
3.6。诱导培养肝细胞的溶菌酶
大量的溶菌酶在肝组织让我们进一步分析归纳。肝脏,尤其是肝细胞发挥重要作用肽表达在创伤后炎症16]。我们培养永生化肝细胞(HepG2)和il - 6和刺激他们金黄色葡萄球菌(图5(一个))。溶菌酶表达增加刺激与兴奋剂但只有刺激后金黄色葡萄球菌(8.0μ100000年g / mL细胞±0.3)显示控制(4.1相比显著增加μ100000细胞±0.4 g / mL)。可能的转录诱导溶菌酶被实时PCR检测。像预期的那样从蛋白质化验,都在HepG2提高溶菌酶的基因表达,但只有金黄色葡萄球菌显示明显的感应控制(图进行比较5 (b))。
(一)
(b)
3.7。TLR2溶菌酶诱导的途径
检查是否TLR2在溶菌酶表达过程中发挥作用,我们对HepG2细胞进行刺激金黄色葡萄球菌,结合TLR2的抑制性抗体(图6)。治疗HepG2细胞TLR2抑制性抗体本身并不导致溶菌酶表达的变化。HepG2细胞的刺激金黄色葡萄球菌诱导的upregulation溶菌酶浓度(8.0μg / 100 000个细胞±1.4)。相比HepG2细胞的刺激金黄色葡萄球菌独自一人,刺激金黄色葡萄球菌结合TLR2抑制性抗体明显下降的溶菌酶浓度(5.9μg / 100 000个细胞±1.4),这表明监管过程中TLR2的主要角色。
4所示。讨论
AMP是先天免疫的效应分子,作为内源性抗生素通过直接杀死细菌、病毒和真菌。由于越来越多的抗多种抗菌素的感染,这些肽的研究在过去的十年中迅速增加。特别是把受伤的伤口和开放性骨折患者面临的入侵的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的多样性。在之前的调查我们发现创伤患者的血清揭示了一个增强的抗菌效果相比健康志愿者血清(5]。在这项研究中,我们记录显著诱导血清溶菌酶的增加受伤的病人。hBD-2和hBD-3相比,溶菌酶表达调节8倍相比,其最小有效剂量的抗菌蛋白表达在血清(1μg / mL) (8]。另外众所周知进一步协同作用与AMP hBD-3一样,也是在创伤血清诱导5,7]。溶菌酶细菌的多糖链墙裂缝,因此hBD渗透容易(17]。
延长病人的血清溶菌酶调控的理解,我们研究了溶菌酶的可能来源。溶菌酶表达的是既定的炎症细胞如单核细胞和中性粒细胞(18]。尤其是中性粒细胞中扮演重要角色的防御受伤组织从第一个10分钟,直到3天后创伤。宿主防御肽等炎症介质诱导一直[19,20.]。严重伤害生成激活不同的炎症细胞如粒细胞、单核细胞和巨噬细胞21]而尤其是单核细胞和中性粒细胞是众所周知的溶菌酶表达(22]。溶菌酶是存储在人类中性粒细胞的颗粒(23),创伤后立即被激活(24]。在这项研究中我们能够记录溶菌酶的诱导多发性创伤患者的白细胞可比发展为血清浓度。溶菌酶在不同细胞系诱导已经报道了金黄色葡萄球菌和许多细胞因子il - 6、干扰素-γ,IL-17 [16,25,26]。尤其是il - 6在创伤后炎症反应中起着重要作用[27];因此,我们测试了关键球员因其在中性粒细胞对溶菌酶表达的影响。如图所示在细菌似乎是一个强大的溶菌酶的诱导物。对开放骨折、创伤和深层组织挫伤,细菌构成创伤后全身感染的主要原因。我们的体外数据显示il - 6和金黄色葡萄球菌在中性粒细胞产生溶菌酶。
有关系统性炎症和休克综合征、肝构成关键人物介质的规定。标记的急性期反应物通常起源于肝,激活细胞因子(28严重受伤后,调节先天防御(29日]。同样有趣的是我们发现了大量的溶菌酶在肝组织和皮肤,它以巨大的溶菌酶表达(30.]。因此,我们研究了肝细胞的溶菌酶和确定的监管upregulation引发了il - 6和革兰氏阳性细菌。把受伤的病人枯氏细胞移除病原体入侵的伤口通过吞噬作用。这些细胞溶菌酶在杀死细菌的作用还没有完全被阐明。另外肝脏像中央器官的细胞因子活动;尤其是肝脏枯否细胞释放多种细胞因子。这些细胞因子可能刺激肝细胞表达溶菌酶。
让一个一步理解溶菌酶的规定,我们认为肝细胞信号通路之一。TLR2 AMP(感应的扮演着重要的角色31日]。如图所示,AMP的感应是由toll样受体(31日,32)由细胞因子激活和细菌碎片(25,32]。这些受体与核factor-kappa (NF - B的感应κB)和抗菌肽的感应33]。NF -κB定义绑定到NF -κb的溶菌酶启动子序列和诱导溶菌酶表达在巨噬细胞和中性粒细胞(34]。因此我们集中在溶菌酶诱导肝细胞在目前的研究中,文档的封锁TLR2在刺激肝细胞表达下调对溶菌酶表达的影响。我们假设TLR2还参与了溶菌酶的调控不仅在中性粒细胞,而且在肝细胞。
5。结论
我们这个研究表明高抗菌活性和溶菌酶的重要upregulation首次创伤相关介质引起的。关于放大器的应用在多个创伤后全身感染的,这些结果带给我们更近一步的理解将受伤的病人的免疫系统。考虑到这个问题的复杂性,溶菌酶将需要进一步的关注。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
蒂姆悬疑类和斯蒂芬妮Fitschen-Oestern贡献同样这项工作。
承认
这项工作是由证期局617年,A22 (Rolf Mentlein博士教授戴克Varoga博士,教授,博士和教授托马斯·Pufe)。本研究在一定程度上支持的德国联邦政府和州政府的卓越计划。