文摘
矩阵metalloproteinase-14 (MMP-14)促进易损斑形态在老鼠身上,而组织抑制剂metalloproteinases-3 (TIMP-3)过度保护。 兔子泡沫细胞侵入性和更容易发生细胞凋亡 细胞。我们调查了这些发现对人类动脉粥样硬化的影响。在体外生成巨噬细胞、泡沫细胞巨噬细胞与动脉粥样硬化斑块特征不稳定或稳定,检查表达式MMP-14, TIMP-3和炎症标记物。促炎的刺激增加MMP-14和减少TIMP-3 mRNA和蛋白表达在人类巨噬细胞。然而,转换与氧化低密度脂蛋白增加MMP-14和减少泡沫细胞TIMP-3蛋白质,独立于炎症介质和部分通过转录后的机制。在泡沫细胞在动脉粥样硬化斑块,MMP-14突出赞成或抗炎巨噬细胞标记,而TIMP-3存在于泡沫状巨噬细胞较少,colocalised CD206。MMP-14阳性巨噬细胞更丰富而TIMP-3积极巨噬细胞不太丰富的斑块组织学检查指定为容易破裂。我们得出这样的结论:泡沫细胞的特点是高MMP-14和低TIMP-3表达式rupture-prone动脉粥样硬化斑块中十分普遍,独立于赞成或抗炎活性。因此减少MMP-14活动和增加TIMP-3可能有效的治疗方法,以减少斑块破裂和心肌梗死。
1。介绍
斑块破裂占四分之三的心肌梗死(1]。削弱的纤维帽由于净降解细胞外基质被认为发挥重要作用在斑块破裂2]。泡沫细胞巨噬细胞(fcm)是一个丰富的几个来源基质金属蛋白酶(MMPs)在人类斑块(3,4]。保护某些基质金属蛋白酶对平滑肌的迁移和扩散的影响从实验研究已确定,但高水平的MMP的生产,特别是从fcm,涉及斑块进展和破裂2]。MMP-14最近一直是关注的焦点,这是一个激活膜型MMP和基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-3),这与细胞外基质结合。考虑到这些属性,MMP-14和TIMP-3可能会扮演重要的角色在调节巨噬细胞pericellular蛋白水解作用。过继转移白细胞缺乏MMP-14到老鼠ldl受体空斑块胶原蛋白含量增加,这意味着有害collagen-depleting MMP-14在斑块稳定性的作用5]。相反,转基因超表达的TIMP-3老鼠巨噬细胞减少动脉粥样硬化斑块稳定性的形成和提高标记(6]。一个 分组人口兔子fcm的蛋白水解能力更强,入侵的能力通过合成细胞外基质(ECM),和更大的倾向进行细胞凋亡,所有这些都将有利于斑块破裂(7]。 确定了fcm在人类动脉粥样硬化斑块(7但负责生成的机制 fcm和他们关系斑块易损性的人若不是之前调查。
巨噬细胞可以表达谱不同的激活状态依赖于支持和抗炎信号(8,9),虽然对MMP-14和TIMP-3表达的影响还没有完全记录。例如,通过toll样受体激活受体激动剂(10)和其他炎性细胞因子通过核因子-代理κB (NF -κB)上调了基质金属蛋白酶(11]。这种激活的巨噬细胞与不稳定斑块形态有关,而停用或者激活的巨噬细胞与斑块稳定性增加大多数(12- - - - - -14],尽管不是全部,研究[15]。表型造成氧化磷脂(16)或由血红素的作用在网站的血栓形成和intraplaque出血也最近杰出(17- - - - - -19]。
澄清的性质和作用 fcm我们调查他们的激活在体外赞成和抗炎分子。然后我们调查了巨噬细胞的数量是否与反对表达MMP-14 TIMP-3 colocalise标记的巨噬细胞激活和与组织学的标志易受人类颈动脉粥样硬化斑块破裂。
2。材料和方法
2.1。颈动脉标本
颈动脉内膜切除手术标本来自AtheroExpress生物库,已详细描述其他的细节(20.- - - - - -22]。简而言之,病人人口包括心血管危险因素,以前的药物的使用和表现症状都被记录下来。动脉粥样硬化斑块是解剖通过一个专门的技术人员为5μ米厚的横截面段。组织学染色(苏木精和伊红(他),Picrosirius红(PS))进行所谓的罪犯病变与最大斑块面积(段)。所占据的区域参数得分后半定量的如前所述[20.- - - - - -22]:粉瘤核心(他、PS),钙化,(他),胶原蛋白(PS),平滑肌细胞(αSM-ctin;M0851;Dako)和巨噬细胞(CD68;M0814;Dako)(表1)。平滑肌细胞和巨噬细胞被使用显微镜定量得分也配备了数码相机和使用分析3.2软件(软成像系统GmbH,明斯特,德国)。微血管的数量被使用一个量化anti-CD34抗体;一直在前面描述的细节(20.- - - - - -22]。作为AtheroExpress中指定的协议,组织学部分是根据整体外观分为:“动脉粥样硬化病变”含有大量脂质核心斑块面积(> 40%),高平滑肌细胞和胶原蛋白含量较低的巨噬细胞浸润,纤维损伤小(< 40%)或缺席的脂质核心,巨噬细胞含量低和平滑肌细胞和胶原蛋白含量高,和“fibrous-atheromatous病变”作为两个表型之间的中间。这个分类的国米,intraobserver可变性一直在前面描述的(23]。相邻的部分然后被这里的组织学分析报告,由2额外的执行和分析运营商被蒙蔽的病变分类。
2.2。免疫组织化学
部分在Clearene脱蜡和水化绝对酒精。在蒸馏水冲洗后,幻灯片受到燥热引起抗原检索孵化的柠檬酸缓冲(10毫米的柠檬酸1 x PBS, pH值6.0),在全功率微波10分钟。幻灯片被允许冷却30分钟,然后用PBS (分钟)。brightfield或荧光包含IHC, 50μL 1%的牛血清白蛋白或图像,FX信号增强器(表达载体,生活技术,佩斯利,英国),分别放置在室温下部分和孵化了30分钟。然后解决方案是利用幻灯片和50名中删除μL的适用主要抗体(如详细表1)添加到样品和孵化一夜之间在4°C或室温1小时。部分被洗在PBS (分钟)和孵化所需的二次抗体的详细表1。为荧光标签,部分在黑暗中孵化了1小时在室温下。部分被洗在PBS (分钟)和安装延长黄金不变色试剂包含DAPI(表达载体,生活技术,佩斯利,英国)来识别核。消极的控制主要抗体是替换相关的物种在同一稀释总是包括免疫球蛋白和细胞计数放大领域。阳性细胞数,表示为一个百分比的总有核细胞。CD68阳性巨噬细胞的百分比也积极为其他感兴趣的蛋白质染色后通过比较连续计算部分或dual-immunohistochemistry如果抗体是合适的,由独立的观察者(精利控股,NPJ免签国家)和平均结果,如前所述[24]。
双重荧光,主要使用了不同物种的抗体和孵化。随后,种特异的荧光团共轭二次抗体被用来产生一个红色荧光产品网站的抗原(AlexaFluor 594)或绿色荧光产品网站的抗原(AlexaFluor 488)。部分被安装在延长黄金不变色试剂和4′,6-diamidino-2-phenylindole(生活技术,佩斯利,英国;p - 36931)荧光标记细胞核蓝色。的特异性immunolabeling展示了包含负控制使用isotype-specific多发地血清或免疫球蛋白。从荧光显微镜获得的图像使用ImageProPlus图像分析软件(媒体控制论)和合并之前如果需要进一步分析。MMP-14阳性巨噬细胞的比例,其他蛋白质染色是统计在每个病变和总MMP-14阳性巨噬细胞的百分数表示。
2.3。研究孤立主要人类巨噬细胞
外周血单核细胞被差速离心分离从全血的健康的捐赠者,收集在西南4 09 / H0107/22研究伦理委员会参考。每捐赠血液(24 mL)稀释了杜尔贝科的磷酸缓冲盐(PBS)没有钙和镁(Lonza) 1 x(比1:1)。稀释样品受到在聚蔗糖密度梯度分离Paque +(比1:1)(通用电气医疗集团生命科学,白金汉郡,英国)和离心机。离心分离PBMC层收集和清洗后在汉克的平衡盐钠(哈佛商学院)和酚红没有钙和镁(Lonza)。单核细胞被坚持孤立的外周血单核细胞组织培养塑料的浓度为2小时细胞/毫升。单核细胞培养在RPMI媒体2毫米谷酰胺,青霉素100单位/毫升,100年μg / mL链霉素,10%胎牛血清(的边后卫;Lonzaσ),和20 ng / mL重组人类巨噬细胞集落刺激因子(R & D系统)。中包括85μ克/毫升的完全氧化低密度脂蛋白,oxLDL (Intracel)第五天当泡沫细胞巨噬细胞(FCM)生成的。在第七天,介质被删除,取而代之的是RPMI媒体补充FCS为5%。重组人干扰素-γ(10 ng / mL R & D系统)和lipopolysaccharide-LPS (200 ng / mL,大肠杆菌026:B6, Sigma-Aldrich)添加了24小时生成经典激活巨噬细胞(M1) [25]或重组人类interleukin-4 (20 ng / mL R & D系统)来获得或者激活的巨噬细胞(M2) (26]。
2.4。逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),
巨噬细胞的RNA样本收集使用RLT解决方案(试剂盒)β巯基乙醇(β加;1:100稀释)。总RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒)根据制造商的指示。RNA是量化使用Nanodrop分光光度计和cDNA生成使用QuantiTect逆转录工具包(100 - 200 ng RNA /反应试剂盒)。实时定量PCR在罗氏光周期计1.5执行量化RNA的稳态浓度使用QuantiTect SYBR绿色PCR工具包和引物详细表2。3.6 - -7.3 ng RNA和0.5包含的反应μ引物。变性15分钟在95°C是紧随其后的是60变性的周期在95°C(15秒),退火20秒钟,和扩展为25秒72°C。副本数量的mRNA计算使用标准曲线构造从琼脂糖凝胶使用各自的PCR产品筛选了。所有片段测序确认身份(英国Takeley Cogenics)。引物及其退火温度在表使用2。
2.5。西方墨点法
贴壁细胞与PBS洗冰,然后用冰冷的细胞溶解1% SDS裂解缓冲。Bicinchoninic酸(BCA)工具包(皮尔斯)被用来估计蛋白质浓度(一式两份)的细胞溶解产物根据设备的协议。蛋白质浓度在560 nm读Multiskan上升(热电子公司)板读者。NuPAGE Novex Bis-Tris迷你凝胶系统(表达载体,生活技术,佩斯利,英国)用于免疫印迹实验。10μg总蛋白质的加载在4 - 12% Bis-Tris-HCl缓冲(pH值6.4)聚丙烯酰胺预制凝胶(表达载体,生活技术,佩斯利,英国)和运行在MES-SDS运行缓冲1 x(表达载体,生活技术,佩斯利,英国)根据制造商的指示。电泳后,凝胶被转移到0.45μm硝化纤维膜在NOVEX NuPAGE传输缓冲区1 x + 5%甲醇(v / v)。转让后,5%的硝化纤维膜被牛奶溶液三羟甲基氨基甲烷缓冲液解决方案包含渐变(TBS-T)(200毫米三,2%渐变20,pH值7.6)。膜被孵化一夜之间在4°C使用抗体表中描述1稀释2毫升SignalBoost解决方案1(英国诺丁汉Calbiochem-Novabiochem有限公司)。第二天膜在TBS-T孵化与5%牛奶溶液,然后与适用的辣根过氧化物酶(HPR)标记二次抗体(Dako,多塞特郡,英国)稀释1:1000年SignalBoost解决方案2(英国诺丁汉Calbiochem-Novabiochem有限公司)。孵化后膜在TBS-T洗。检测peroxidise标记蛋白,增强化学发光(ECL)检测系统(通用电气医疗集团生命科学,白金汉郡,英国)使用。与ECL试剂混合膜是孵化(解决方案和解决方案B的比例1:1)和暴露在x射线胶片所需的时间长度。0.5加载控制μ克/毫升的反β肌动蛋白抗体(A2228σ)或anti-GAPDH抗体(MAB374,微孔)使用。发现乐队量化使用Bio-Rad gs - 690扫描密度计(Bio-Rad,赫默尔亨普斯特德,英国)和被相关的正常化β肌动蛋白或GAPDH值。
2.6。统计方法
histomorphometry,分类和连续变量之间的差异进行分析通过使用一个独立的学生以及正态分布的数据,和一个Mann-Whitney测试的不是正态分布的数据。序数和连续数据之间的差异进行分析利用克鲁斯卡尔-沃利斯测试,不是正态分布的数据。二分和分类数据之间的差异进行分析采用卡方检验。2连续变量之间的差异进行分析和斯皮尔曼相关测试的不是正态分布的数据。在所有情况下被认为是显著的。所有与SPSS统计分析进行版本17(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。定量rt - pcr结果正常化18 s RNA的值被转换为对数和分析方差分析学生的紧随其后以及与Bonferroni调整。
3所示。结果
3.1。MMP-14人类初级巨噬细胞和fcm和TIMP-3 mRNA表达在体外
人类monocyte-derived巨噬细胞分化与csf (MMs)和一些从每个批处理氧化低密度脂蛋白生成泡沫细胞巨噬细胞(fcm),正如前面确认在我们的实验室27]。转换的MMs fcm并不影响MMP-14或TIMP-3(图的mRNA表达1(一))或cox - 2和我κBα促炎激活的标志,或CD206基因存在既定的但调节通过抗炎激活(12,13)(图1(一))。促炎与LPS激活和干扰素γ(称为M1条件(26])显著增加表达MMP-14的4.5 - 7.3倍,我κBα信使rna (NF的替代标记κB信号(28])的7.5和6.7倍,cox - 2 mRNA的146 - 187倍,在巨噬细胞(MM1)和fcm (FCM1),分别为(图1(一))。相比之下,促炎激活TIMP-3 mRNA水平降低了74%和89%,在巨噬细胞或fcm CD206 81%和86%,分别为(图1(一))。抗炎激活与il - 4(称为M2条件(26对MMP-14])没有作用,cox - 2或我κBαmRNA水平显著增加但TIMP-3 mRNA表达由1.9 - 2.6倍和CD206表达式7.5——9.9倍MMs(平方毫米)和fcm (FCM2),分别为(图1(一))。
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3.2。在巨噬细胞和fcm MMP-14 TIMP-3蛋白质表达式在体外
与mRNA的数据一致,促炎激活的蛋白质含量显著升高MMP-14 cox - 2和显著降低TIMP-3和CD206 nonfoamy巨噬细胞(数字1 (b)和1 (c))。抗炎(平方毫米)也增加巨噬细胞激活TIMP-3 CD206蛋白质水平(数字1 (b)和1 (d)),与mRNA的数据一致。我们得出这样的结论:炎性巨噬细胞 而未激活的和抗炎刺激巨噬细胞比较 。泡沫细胞形成显著增加蛋白质的表达MMP-14和减少TIMP-3水平(数字1 (e)和1 (f)),尽管没有改变mRNA水平,同意我们之前发现在兔子巨噬细胞泡沫细胞的形成(7]。这些结果可以解释的更多参与转录后的机制,如监管由微rna (miR)。事实上,我们最近在nonfoamy巨噬细胞显示,高水平的miR-24限制巨噬细胞MMP-14蛋白表达(29日]。我们观察到miR-24水平下降70%相比,fcm MMs(图1 (g)),符合MMP-14蛋白质含量增加。有趣的是,与mRNA表达,赞成或抗炎激活fcm并不影响MMP-14蛋白表达(图1 (h)),这表明米尔是占主导地位的影响。赞成或抗炎激活fcm并不影响TIMP-3要么蛋白表达相比,未激活的fcm(图1(我))。TIMP-3蛋白表达也可能受到米尔监管但尚未在巨噬细胞。总之,我们的研究结果暗示nonfoamy巨噬细胞 当经典而fcm是激活 不论他们的激活状态的蛋白质水平。
3.3。本地化的MMP-14和TIMP-3人类颈动脉粥样硬化斑块
巨噬细胞和fcm中确定斑块使用CD68免疫组织化学。CD68阳性细胞在形态学差异很大很大,高泡沫细胞与很少或没有脂质包体。我们清点所有细胞无论形态。MMP-14阳性巨噬细胞/ fcm主要被发现在颈动脉粥样硬化斑块的肩部区域(SR)(数据2(一个)- - - - - -2 (c)),而TIMP-3阳性巨噬细胞/ fcm主要发生在和周围的纤维粥样斑块纤维帽(FC)(数据2 (d)- - - - - -2 (e))。的特异性抗体用于显示在图2。符合我们之前的结果(7斑块),地区往往是MMP-14积极和TIMP-3负(图2 (g)对比图2 (h))或MMP-14负和TIMP-3正(图2(我)对比图2 (j))。双重免疫组织化学(如前所述24])透露,在斑块丰富的地区CD68阳性fcm, MMP-14 colocalised nuclear-localised NF -κB p65单元,一个公认的促炎激活的标志。当统计,大约有80%的MMP-14积极fcm也nuclear-localised NFκB(数据3(一)-3(d)),这意味着促炎的激活与MMP-14 upregulation巨噬细胞/ fcm在斑块。获得更深的见解,我们采用arginase-1,抗炎小鼠巨噬细胞的标志(30.),是人类族群的表达下调fcm在先进的斑块31日]。Arginase-1和MMP-14 coexpressed在超过50%的intraplaque巨噬细胞的数量/ fcm和Arginase-1 MMP-14积极巨噬细胞相关先进的斑块(;,图4)。这些结果与我们的是一致的在体外数据显示高MMP-14 fcm无论M1蛋白水平(图/ M2的激活状态4)。相反MMP-14,不到1%的TIMP-3阳性巨噬细胞/ fcm证明nuclear-localised NF -κB p65(图5),这意味着一些经典激活。大约80%的巨噬细胞/ fcm TIMP-3积极也为CD206染色,我们显示,未激活的表达(毫米)和(平方毫米)巨噬细胞(或者激活数据3(f) -3(我))。因此,我们得出结论,CD206 TIMP-3积极巨噬细胞/ fcm斑块可能是未激活的或il - 4激活。
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3.4。关系MMP-14 TIMP-3染色和斑块的组织学特征稳定和颈动脉粥样硬化斑块的发生的症状
我们下一个调查MMP-14 TIMP-3染色和斑块组成之间的关系。颈动脉斑块进入AtheroExpress给出一个初始分类为动脉粥样硬化,fibrous-atheromatous,或纤维斑块基于大量脂质核心,大量的巨噬细胞高,低丰度的平滑肌细胞(smc)和胶原蛋白含量(20.,21,32)(表3)。值得注意的是,男性和老年患者所占比例与动脉粥样硬化斑块组(表4)。与这些相比以前的作业我们发现MMP-14的百分比(图6(一))和cox - 2(图6 (b))积极的巨噬细胞/ fcm相比明显更大的动脉粥样硬化或fibrous-atheromatous纤维斑块。相比之下,TIMP-3比例(图6(一))和CD206(图6 (b))积极的巨噬细胞/ fcm相比,纤维增加fibrous-atheromatous和颈动脉粥样硬化斑块。尽管少量的无症状患者在我们的群体中,明显高于MMP-14积极性被发现在斑块症状而无症状的患者(图6 (c))。也有降低的趋势TIMP-3积极性从有症状的患者(图斑6 (c))。
(一)
(b)
(c)
放大整体斑块的关系,我们发现一个更高比例的MMP-14阳性巨噬细胞/ fcm与高脂质斑块显示和巨噬细胞相关内容或SMC数量减少,斑块不稳定有关,而反过来观察TIMP-3积极fcm(图7)。TIMP-3阳性巨噬细胞/ fcm也显著增加胶原蛋白含量,减少斑块neovascularisation(图7),其他标记的斑块的稳定性。此外,MMP-14阳性巨噬细胞的百分比/ fcm在所有相关的部分强烈与巨噬细胞数量和总消极SMC(表数量5)。积极性MMP-14和cox - 2的百分比也相互关联(表5)。相反,TIMP-3阳性巨噬细胞的百分比/ fcm与巨噬细胞数量紧密相关的负面和积极SMC(表数量5)。积极与MMP-14 TIMP-3直接与CD206和负相关(表5)。其他特点包括钙化的存在,intraplaque出血和血栓形成也被记录下来。积极性MMP-14或TIMP-3无关斑块钙化(数据没有显示)。然而,斑块intraplaque出血有更高比例的MMP-14阳性巨噬细胞/ fcm和倾向于较低的百分比TIMP-3积极fcm(表6)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
4所示。讨论
我们主要的新发现与促炎症刺激或泡沫细胞,巨噬细胞激活巨噬细胞(fcm)无论炎症激活 而如果(csf分化;毫米)或抗炎(il - 4激活;平方毫米)巨噬细胞。此外,MMP-14积极fcm更加丰富和TIMP-3积极fcm更丰富与脆弱的斑块,而不是稳定的特点。
多个巨噬细胞和FCM表型之前描述(33,34]。经典巨噬细胞活化在体外与炎性刺激物的特点是NF -κB-dependent upregulation各种额外的促炎介质和酶系统,包括cox - 2。相比之下,在体外激活与抗炎症刺激如il - 4或IL-13介导的转录组响应依赖STAT-6磷酸化(26,33]。我们的结果证明著名的古典激活对MMP-14 mRNA表达的影响在巨噬细胞和FCM (35人类单核细胞[],与以前的工作相一致36和巨噬细胞35]表明NF -κB激活促进MMP-14表达式。形成泡沫细胞本身并不导致赞成或抗炎巨噬细胞激活(图1),与以前的研究一致16,37]。然而,转换FCM MMP-14蛋白表达增加,无论促炎的激活。fcm出现耐药狭义货币供应量M1及广义货币供应量M2 cytokine-stimulation但采用转录后的通路调节MMP-14蛋白表达和后续活动。事实上我们最近发现的参与微rna, miR-24,巨噬细胞的直接监管MMP-14蛋白表达(29日]。进一步证明了小说在调节通路FCM MMP-14蛋白表达是由我们提供的证明MMP-14阳性巨噬细胞/ FCM斑块与经典激活标记,cox - 2和nuclear-localised NF -κB,和常见的替代激活标记,arginase-1。因此泡沫细胞的形成,而不是M1和M2巨噬细胞分化出现负责fcm检测到先进的人类动脉粥样硬化斑块。
相比之下MMP-14, TIMP-3 mRNA期间减少促炎激活巨噬细胞或在泡沫细胞的形成。这些因素可能占的组合种群斑块。TIMP-3阳性巨噬细胞/ fcm相关和colocalised甘露糖受体(MR), CD206。在协议与其他先前的研究38),我们发现CD206和TIMP-3高度表达- csf(毫米)和调节巨噬细胞分化的il - 4(平方毫米)。然而,TIMP-3表达il - 4治疗后(图只是翻了一番1),因此在这两种表型。先生积极巨噬细胞/ fcm以前报道主要位于远离的脂质核心斑块(12,13),符合TIMP-3阳性巨噬细胞的位置/ fcm在我们的研究中。虽然不知道TIMP-3转录的规定(39),在蛋白表达显著减少我们观察到在泡沫细胞形成与先前的观察是一致的,转录后的机制可以调节TIMP的表达在巨噬细胞发育(40]。研究超出了目前的范围在我们的实验室调查这种可能性。
MMP-14有害的作用和保护作用的TIMP-3已从动物研究建议(见介绍)。符合这些建议,我们发现MMP-14积极FCM亚种群在颈动脉斑块与斑块的组织学特征相关的脆弱性主要基于关联定量斑块特征源于无论组织学外观(表的所有部分4)。颈动脉粥样硬化斑块的结论也证实了之前瞎了基于整体转让病变组织学外观(数字6和7)。第二个分析可以被批评,因为它是基于主观的视觉观察,尽管我们先前已经表明,有很好的intraobserver协议(23]。同样明显的是,有一个性别失衡不同斑块之间的表型可能充当的可变性来源统计分析。尽管如此,集体结果证明MMP-14积极fcm与斑块易损性。而TIMP-3积极的巨噬细胞与斑块稳定性。
在总结我们的研究结果表明,在脆弱的动脉粥样硬化斑块fcm可以表现出增加MMP-14和减少TIMP-3蛋白表达。这导致加剧入侵能力,增加扩散,增强对细胞凋亡的敏感性,我们以前了7]。因此我们的工作表明,减少MMP-14活动和增加TIMP-3可能有效的治疗方法,以减少斑块破裂和心肌梗死。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
杰森·l·约翰逊和尼古拉斯·p·詹金斯这项研究同样起到了推波助澜的作用。杰森·l·约翰逊和安德鲁·c·纽比设计的研究。杰森·l·约翰逊,黄Wei-Chun卡琳娜Di Gregoli,著b Sala-Newby进行细胞培养研究和qPCR分析。杰森·l·约翰逊和文森特·p·w·尼古拉斯·p·詹金斯目前进行了免疫组织化学染色和分析。杰森·l·约翰逊,尼古拉斯·p·詹金斯文森特·w·目前Frans l·摩尔和杰拉德Pasterkamp参与了收集病人的细节,处理人体组织,病理评价和表现型。杰森·l·约翰逊,尼古拉斯·p·詹金斯和安德鲁·c·纽比写论文。所有作者阅读和批准了期末论文。
确认
作者承认米歇尔·萨默维尔女士的熟练的技术援助和夫人劳拉·贝文。作者的工作是由英国心脏基金会(CH95/001 RG04/009, FS / 07/053/24069)和美国国家卫生研究所(英国)布里斯托尔在心血管医学生物医学研究单位。含水量黄举行奖学金从日元tj凌医学基金会和医学基金会的记忆Deh-Lin程博士,台湾。