文摘

原降钙素(PCT)是最好的诊断和预后标志物在临床实践中,广泛用于评估细菌感染的进化。虽然主要是由甲状腺,脓毒症过程中几乎所有的外围组织参与PCT生产。薄壁组织的细胞被认为是PCT表达的主要来源;然而巨噬细胞的作用还不清楚。为了应对环境因素,组织巨噬细胞获得不同的功能表型,从促炎(M1)抗炎(M2)表型。在母婴界面显示影响巨噬细胞免疫抑制M2-like活动所需的维护怀孕期间免疫内稳态。本研究旨在阐明完全分化的能力合成PCT (M0)、极化(M1 / M2)巨噬细胞和培养在妊娠前三个月妊娠血清的存在(GS)或怀孕荷尔蒙。我们发现M1巨噬细胞表达上调PCT LPS刺激后而M0和M2。GS会使PCT在巨噬细胞表达,扭曲他们M2-like表型。这种效应似乎只是部分激素介导的环境。我们的发现加强巨噬细胞的关键作用抵消孕期炎症刺激,建议PCT M1-like巨噬细胞作为一个可能的新标志。

1。介绍

原降钙素(PCT)的激素原降钙素(CT)和由116个氨基酸分子质量约14 kDa [1]。PCT通常从神经内分泌细胞释放到循环的甲状腺(parafollicular或C细胞)2)和肺细胞(K) (3),达到生理浓度低于0.05μg / L在健康人的血浆4]。在炎症状态,PCT源自几乎所有类型的细胞和组织,包括单核细胞和薄壁组织的组织,使其upregulation较少依赖一种类型的细胞,组织或器官(5- - - - - -8]。PCT的合成主要是通过细菌刺激引起内毒素脂多糖(LPS) [9),并在较小的程度上,从促炎细胞因子il - 1β、il - 6和TNFα(10,11]。其水平不过减毒干扰素的释放γ为了应对病毒感染(12]。PCT现在普遍接受作为一个良好的预后和诊断细菌感染的标志,由于其高血清稳定性及其对炎症刺激反应能力更快比其他感染的实验室参数,如c反应蛋白(CRP)和肿瘤坏死因子α,使它特别适合常规实验室分析(13]。巨噬细胞是先天免疫的重要组成部分,发挥核心作用在炎症和宿主防御14,15]。为了应对环境线索,单核吞噬细胞获得不同的功能表型,从“古典”促炎/抗血管新生(M1)”或者“抗炎/ proangiogenic (M2)表型,代表极端的连续体在宇宙不同的激活状态(16,17]。多样性、适应性和灵活性特征monocytes-macrophages细胞谱系,在生理或病理条件下。因此,巨噬细胞的功能扭曲是最好的机制来调节全身和局部免疫(18]。巨噬细胞发挥关键作用在抗击炎症怀孕期间(19]。这种状态代表了一个有趣的免疫状况,免疫系统的免疫监视和镇压共存,由于母亲是能够容忍胎儿的存在和快速应对当地和系统性炎症刺激20.]。到目前为止,有一些研究在文献中显示新孤立的人类单核细胞表达PCT (8,11,21];另一方面,完全分化的贡献和在PCT极化巨噬细胞表达还不知道。在这项研究中,我们调查的参与主要人类巨噬细胞PCT生产、评估PCT的调制表达在这些免疫细胞在正常和炎症条件;除此之外,我们的目标是展示如果这个激素原的合成可以调节巨噬细胞极化期间对M1和M2表型。此外,基于抵消炎症的重要性在妊娠期间,我们的研究检查怀孕的前三个月的人类血清(GS)调节PCT完全分化和极化巨噬细胞表达,分析其功能扭曲他们的表型在体外。第一次,我们表明,PCT在基因和蛋白质表达水平完全分化的巨噬细胞,它是调节在那些与M1表型在刺激炎性刺激有限合伙人。此外,GS有能力表达下调PCT在人类巨噬细胞表达在体外,扭曲成一个M2-like表型。

2。材料和方法

2.1。试剂和抗体

人类的细胞因子il - 4和干扰素γ从ImmunoTools GmbH购买(Friesoythe、德国)和il - 10 PeproTech电子商务有限公司(DBA意大利S.r。l,意大利米兰)。超纯脂多糖(LPS)大肠杆菌0111:B4的压力是来自InvivoGen (Labogen开发。意大利米兰)。多克隆兔反PCT是购自Abcam (ProdottiGianni、米兰、意大利)。CD68 (Macrosialin、鼠标反人类单克隆抗体和克隆EMB11)和CD206(巨噬细胞甘露糖受体1鼠标反人类单克隆抗体和克隆MCA2155)抗体购买,分别从Dako(意大利米兰)和AbD Serotec(意大利米兰)。二次山羊anti-mouse-Cy3和链霉亲和素Cy2-conjugated买来杰克逊ImmunoResearch (LiStarFish、米兰、意大利);生物素化的猪anti-rabbit免疫球蛋白来自Dako。妊娠前三个月妊娠血清(GS)获得了在妊娠12周(正常孕妇)。池的新鲜血清从健康献血者作为正常的人类血清(NHS)。血清heat-inactivated在56°C 30分钟前使用。知情同意是获得所有女性参与这项研究。这项研究是生命伦理委员会批准IRCCS, Burlo Garofolo,意大利的里雅斯特。 All the samples were immediately centrifuged, aliquoted, and frozen at −80°C.

2.2。隔离和人类外周单核细胞分化成巨噬细胞和他们的在体外极化

外周血单核细胞(PBMCs)从健康献血者隔绝匿名淡黄色的外套,请提供由当地血库(Immunotransfusional部门,马焦雷湖医院,意大利的里雅斯特)使用Ficoll-Paque +密度梯度(通用电气医疗集团Euroclone、米兰、意大利)。剩余的T细胞和B细胞被塑料坚持从单核细胞分数,孵化后2小时37°C和5%的公司2rpmi - 1640年GlutaMAX(生活技术,意大利米兰)补充10%的国民健康保险制度和1%青霉素和链霉素(Sigma-Aldrich)。完全分化和M1——M2-polarized巨噬细胞培养获得的106单核细胞/毫升37°C和5% 7天有限公司2与上面的相同介质描述和取代每周两次。M1细胞极化一夜之间通过刺激(O / N)与有限合伙人(100 ng / mL) (InvivoGen)和干扰素γ(500 U /毫升)(ImmunoTools),而M2巨噬细胞极化通过刺激与il - 4 O / N (20 ng / mL) (ImmunoTools)和il - 10 (50 ng / mL) (PeproTech) [22,23]。

2.3。刺激巨噬细胞与前三个月妊娠血清

为了避免细胞碎片的存在,妊娠前三个月妊娠血清(GS)在10.000 g离心5分钟在室温下(RT)然后过滤合演旋转x离心管过滤器,0.22μ米孔CA膜(康宁、都灵、意大利)。完全分化的巨噬细胞在孵化24小时37°C和5%的公司2rpmi - 1640年GlutaMAX(生命技术)补充10%的GS和1%青霉素和链霉素(Sigma-Aldrich)。细胞被刺激3小时37°C和5%的公司2培养基的10%的国民健康保险制度和有限合伙人的最终浓度100 ng / mL,诱导PCT的基因表达。

2.4。与孕激素刺激巨噬细胞,17岁β雌二醇和人体绒毛膜促性腺激素(hCG)

完全分化的巨噬细胞在孵化24小时37°C和5%的公司2rpmi - 1640年GlutaMAX(生命技术)补充10%的国民健康保险制度和1%青霉素和链霉素(Sigma-Aldrich)在100 nM的孕酮(PG)、10 nM的17β雌二醇(E2)和20 U /毫升的人体绒毛膜促性腺激素(hCG),激素,单独使用或结合在一起。细胞被刺激3小时37°C和5%的公司2培养基的10%国民健康保险制度和100 ng / mL的有限合伙人。怀孕荷尔蒙的浓度与血清中达成的女性在怀孕12周。

2.5。可行性分析

细胞生存能力评估通过台盼蓝染料排斥(Sigma-Aldrich)测试。没有观察到的差异之前和之后完成实验。

2.6。RNA隔离,互补脱氧核糖核酸的合成,实时定量PCR (qPCR)

RNA在细胞纯化与EuroGOLD trifast (Euroclone)根据制造商的指示。总RNA提取和reverse-transcribed如前所述[24]。实时定量PCR (qPCR)进行了Rotor-Gene 6000 (Corbett、试剂盒、安科纳、意大利)使用智商SYBR绿色Supermix (Bio-Rad、米兰、意大利)。表1显示了底漆用于qPCR列表。融化曲线记录55°C和99°C之间举行每2 s。基因的相对数量生产在每个样本由比较量化(CQ)方法作为转子的一部分基因提供1.7软件(Corbett研究)25]。每个基因的相对数量与18岁规范化和表达为任意单元(AU)考虑1 AU获得完全分化的巨噬细胞作为校准器。

表1
底漆用于qPCR分析。
2.7。免疫荧光

获得如前所述,孤立PBMCs镀48小时37°C和5%的公司2rpmi - 1640年GlutaMAX(生命技术)补充10%的国民健康保险制度和1%青霉素和链霉素(Sigma-Aldrich) 8-chamber文化幻灯片(BD生物科学发现实验室的器具,意大利米兰)允许单核细胞的粘附,并区分为7天以上报道。细胞培养24小时37°C和5%股份有限公司2rpmi - 1640年GlutaMAX(生命技术)补充10%的GS和1%青霉素和链霉素(Sigma-Aldrich),随后与LPS刺激3小时(100 ng / mL) (8]。巨噬细胞被固定和修复细胞&烫透化作用permeabilized工具包(公司Italiana Chimici,罗马,意大利)根据制造商的指示,然后封锁与人类血清(1:60)在rt, 30分钟之后,细胞被孵化与主要马伯anti-CD68 (1: 40) (Dako), mAb anti-CD206 (1: 50) (Sigma-Aldrich),或兔子反PCT (Abcam) O在4°C / N。CD68的绑定和CD206抗体显示了山羊anti-mouse Cy3-conjugated二级抗体(1:300),而生物素化的猪anti-rabbit(1: 50)随后streptavidin-Cy2(1: 200)检测anti-PCT polyAb, 45分钟在黑暗中在RT,紧随其后的是4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI Sigma-Aldrich)染色。幻灯片准备了安装解决方案(Dako)。图像获取与徕卡DM3000显微镜(徕卡,位于德国)和图片收集使用徕卡DFC320数码相机(莱卡)。

2.8。量化的PCT在巨噬细胞的培养基

巨噬细胞的培养基是无菌条件下在150年最后一卷μ信用证样本,离心机在12.000 g 2分钟+ 4°C,避免细胞碎片的存在,在−80°C到分析和维护。PCT的培养基中巨噬细胞的数量由模块化自动量化分析E170模块(罗氏诊断、米兰、意大利)使用勃拉姆斯PCT试剂(罗氏,曼海姆,德国)。

3所示。统计分析

执行统计分析与微软Office Excel 2003(美国微软公司,微软,CA)。数据报告为均值±S.E.M. Mann-Whitney测试是用来比较两组数据 值< 0.05被认为是显著的。

4所示。结果

4.1。描述生产的PCT M0、M1和M2巨噬细胞极化

我们最初调查的能力不极化人类巨噬细胞(M0)分泌PCT在上层的文化。人类巨噬细胞的纯度确认与免疫荧光染色法对经典标记CD68(图1(一))。PCT水平测定收获上层清液中巨噬细胞24小时后的文化。如图1 (b),如果巨噬细胞产生大约20个pg / mL PCT和没有区别的上层清液中可观察到的细胞与LPS刺激。

(一)
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(b)
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(c)
(c)
(d)
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图1
人类巨噬细胞表达PCT在信使rna和蛋白质水平。(一)免疫荧光分析从PBMCs人类巨噬细胞的分化。细胞被马伯反CD68熏黄了。DAPI核染色蓝色所示。原始放大63倍。PCT水平(b)分泌细胞上清液中巨噬细胞培养24小时后与LPS刺激。5独立实验显示和数据之间没有统计学意义已经发现处理和未经处理的细胞。(c) RNA由人类巨噬细胞完全分化,未经处理或与LPS刺激3和24小时,被qPCR量化PCT和18 s表达式。5个独立的实验数据显示,代表均值±S.E.M. (Mann-Whitney测试)。(d)的双重免疫荧光分析人类巨噬细胞PCT(绿色)和CD68(红色)表达式。覆盖图像显示在细胞质中PCT本地化。DAPI核染色蓝色所示。原来放大20 x(上面板)和63(低板)。图像与徕卡显微镜DM3000收购。

PCT的生产还证实了巨噬细胞记录的相应的mRNA表达qPCR(图1 (c))。信使rna表达分析显示记录的存在对PCT,证实了这种蛋白质的合成。此外,细胞与LPS刺激3小时没有透露任何调制mRNA的表达。意外,24小时的刺激与LPS诱导的差别明显对这些PCT的成绩单。进一步揭示人类巨噬细胞中PCT的存在,三与DAPI染色和抗体PCT和CD68评估在巨噬细胞培养在8-chamber文化幻灯片。PCT是清晰可见,局部整个细胞质如图1 (d)。

细胞被极化成完全分化M1和M2巨噬细胞亚型和特征的表达一些两个亚种群特征标记(26]。如图2(一个)M1巨噬细胞显示,调节基因表达的促炎细胞因子il - 1β和细胞表面标记CD80,而M2巨噬细胞,与M1极化或如果巨噬细胞(M0),增加抗炎细胞因子il - 10的表达和甘露糖受体C 1型(CD206)。

(一)
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(b)
(b)
图2
M1极化巨噬细胞显著上调PCT的表达与M0和M2巨噬细胞与LPS刺激下。(一)PMBCs分化在文化与有限合伙人和极化O 7天/ N (100 ng / mL)和干扰素γ(500 U /毫升)或il - 4 (20 ng / mL)和il - 10 (50 ng / mL) M1 / M2极化。信使rna表达水平CD80和il - 1β(M1标记)和CD206和il - 10 (M2标记)是衡量qPCR和规范化的人类看家基因18岁。(b) RNA从M0、M1和M2巨噬细胞被qPCR量化PCT和18 s表达式。PCT的相对数量的mRNA规范化参照18 s值。结果表示为来自,1非盟代表获得的价值与未经处理的巨噬细胞作为一个积极的控制。酒吧代表均值±S.E.M.至少三个独立的实验。 和 (Mann-Whitney测试)。

评估如果单核吞噬细胞的极化导致的不同生产PCT,巨噬细胞被偏向M1和M2表型与LPS刺激3小时评估调制qPCR PCT的基因表达。PCT的合成相当nonstimulated巨噬细胞极化对他们的支持和抗炎之间比M0巨噬细胞表型。事实上,合成显著增加与M1巨噬细胞表型与LPS刺激,M0和M2巨噬细胞刺激相比,相同浓度的刺激(图2 (b))。M1巨噬细胞也显示出明显上调(从4.8到6 pg / 106细胞)PCT的生产与LPS刺激后24小时,相比如果相同的表型。

4.2。妊娠血清(GS)诱发M2-Like培养的巨噬细胞的表型

我们假设怀孕的荷尔蒙变化开始时可以调节巨噬细胞的表型。确定妊娠前三个月妊娠的影响血清(GS)对巨噬细胞活化我们评估一些支持和抗炎标记的基因表达,在巨噬细胞的极化调制。如图3培养24小时,我们发现巨噬细胞显著的GS过表达CD206标记基因和蛋白质水平。在相同的实验条件下,il - 10、il - 1的表达β分别是显著调节和表达下调,意味着GS有能力通过抗炎斜巨噬细胞表型。有趣的是,我们表明,巨噬细胞保持了反应能力促炎与GS刺激条件时,调节il - 1的表达β和肿瘤坏死因子α细胞因子的刺激与LPS 3小时(数据没有显示)。

(一)
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图3
人类巨噬细胞条件与妊娠24小时血清(GS)下调il - 1的表达β和移植il - 10。增加CD206被观察到在基因和蛋白质的表达水平。(一)mRNA表达il - 1的含量β测量、il - 10和CD206 qPCR和规范化的人类看家基因18岁。结果表示为来自,1非盟代表与巨噬细胞培养在NHS中获取的值作为一个积极的控制。CD206阳性巨噬细胞的数量是评估通过计算标记细胞使用ImageJ(国家卫生研究院、美国),考虑的阳性细胞百分比至少5个不同的领域。酒吧代表均值±S.E.M.至少三个独立的实验。 和 (Mann-Whitney测试)。(b)免疫荧光显示表达式的upregulation CD206蛋白(红色)在人类巨噬细胞培养24小时在GS的存在。DAPI核染色蓝色所示。图像与徕卡显微镜DM3000收购。原来放大20 x。
4.3。在体外GS和妊娠激素对PCT在培养的巨噬细胞表达

基于能力的GS极化单核吞噬细胞通过一个M2-like表型,我们评估其影响PCT的表达。巨噬细胞培养24小时的GS,随后与LPS刺激3小时显示,PCT表达显著减少,相比培养在NHS(图4)。值得注意的是,GS本身能够表达下调PCT在24小时内巨噬细胞的表达文化,与细胞培养在NHS相比,虽然并没有显著的差异。


图4
PCT负调控的表达在人类巨噬细胞条件与妊娠24小时血清(GS),达到意义与100 ng / mL的LPS刺激后3小时。这些蛋白质测定的信使rna表达水平qPCR和规范化的人类看家基因18岁。结果表示为来自,1非盟代表与巨噬细胞培养在NHS中获取的值作为一个积极的控制。酒吧代表均值±S.E.M.至少三个独立的实验。 (Mann-Whitney测试)。

此外,激素环境GS的考虑,试图了解是否可以参与巨噬细胞的极化,如果它能够调节PCT和CD206表达在这些细胞。出乎意料,孕激素的刺激(PG)诱导PCT的差别明显对这些基因的表达,当我们观察到17的一个相反的效果β雌二醇(E2)。没有观察到的调制PCT的表达与促巨噬细胞刺激。有趣的是,三个一起激素无法调节PCT在巨噬细胞表达,可能对PG和E2(图的相反的效果5 (b))。注意,所有这些激素共享通过M2-like极化巨噬细胞表型的能力,就是明证的upregulation CD206表达式(图5(一个))。

(一)
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(b)
(b)
图5
CD206表达式和PCT在人类巨噬细胞条件与PG 24小时,E2、hCG或三种激素组合在一起。(一)CD206的信使rna表达水平是衡量qPCR和规范化的人类看家基因18岁。结果表示为来自,1非盟代表与巨噬细胞培养在NHS中获取的值作为一个积极的控制。(b) PCT褶皱增加表达比率mRNA水平的LPS刺激和有限合伙人未经处理的细胞。酒吧代表均值±S.E.M.至少三个独立的实验。 (Mann-Whitney测试)。

5。讨论

这是第一个详细研究PCT的生产由人类巨噬细胞,一个强大的生物标志物的早期准确诊断细菌感染(1]。

巨噬细胞PCT表达和分泌的贡献还不清楚。唯一的生产研究PCT在文化是由人类巨噬细胞Linscheid et al。8),这表明,巨噬细胞在第五天的文化没有表达降钙素和降钙素相关基因肽(CGRP怎样)-我mRNA在基底条件下或在刺激炎症介质。研究表明PBMCs分泌PCT的能力只有在坚持内皮细胞或塑料表面。感应瞬态,它不是可检测经过18个小时的文化。一些研究调查了生产PBMCs PCT的对比结果(1]。PCT的存在已经被滑雪和同事(以前观察到的11在新鲜分离PBMCs在转录和翻译水平。Herget-Rosenthal et al。27)也表明,PCT PBMCs发布的,独立于控制和先进的慢性肾脏疾病患者,描述了PCT从PBMCs释放之间的相关性和PCT在血液的浓度。此外,Balog et al。10)表明,革兰氏阳性细菌有TNF-inducing能力提升PCT在人类单核细胞的细胞内的内容,虽然他们猜测其他细菌组件可以直接诱导PCT。穆勒et al。5),在一个类似人体脓毒症的动物模型,发现CT-mRNA是无所不在地在多个组织和统一表示全身败血症,包括腹膜巨噬细胞。

我们的研究表明人工培养的巨噬细胞产生的能力PCT经过7天的文化。此外,我们研究了有限合伙人的影响巨噬细胞PCT的生产。我们的数据表明,人类巨噬细胞结构上产生PCT在基底条件下,但无法应对有限合伙人的PCT表达式和生产。的主要和小说发现本研究是提高生产能力的PCT LPS刺激后获得当巨噬细胞已经偏向M1表型。相反,没有观察到调制PCT表达M2巨噬细胞刺激与相同数量的有限合伙人。这些数据非常有趣,因为M1巨噬细胞通常被认为是负责抵抗细胞内病原体和与急性细菌感染和脓毒症(18]。此外,根据它的结构,它最近表明,PCT可以与细菌LPS诱导减少促炎作用[21]。这些数据表明,M1生产PCT的特有的能力可能是与国防的生理功能。

我们研究的其他重要的观察是,巨噬细胞培养在GS,获得女性在怀孕的前三个月,偏向M2-like表型,因此,当与LPS刺激时,显著降低了PCT的mRNA水平。为了确定因素出现在GS血清,能够调节PCT在人类巨噬细胞的表达,我们评估PG的影响,E2和hCG。我们的数据表明,促性没有影响,而PG会使和E2 LPS刺激后增加了PCT表达式。刺激相结合的三个激素并不影响调制PCT的表达表明,额外的因素存在于GS,例如,细胞因子il - 10等(28),扮演一个角色在调节巨噬细胞的这种蛋白质的生产。我们可以推测,所有组织巨噬细胞改变其表型在怀孕期间接触血清派生因素。考虑在GS placental-derived组件更集中在胎盘环境,我们可以假设在我们的试验中获得的巨噬细胞的表型类似更多在场母婴界面的影响。

最近的数据Koldehoff et al。29日]证明了基因的单核细胞在妊娠前三个月孕期不同于单核细胞与非孕女性之一。根据这些数据,我们可以假设循环单核细胞可能通过GS因素,尽管这个问题需要进一步的分析。

怀孕与一个独特的免疫状态有关,特点是蜕膜,以及外围免疫反应适应,为了保证孕产妇宽容胎儿(30.]。它已经表明,蜕膜巨噬细胞表达标记替代激活,包括CD206和il - 10 (23]。此外,它已被先前表明,可溶性循环因素,存在于孕妇的血清,诱导树突状细胞(DC)不完整的激活,降低直流allostimulatory能力(31日]。在这项研究中我们证明了在人类生理妊娠巨噬细胞,在回应人类怀孕的血清,也深刻变化,可能反映了孕产妇系统对胎儿的反应。我们的数据也表明,PCT的合成强烈表达下调与这个特定的巨噬细胞表型,虽然响应有限合伙人是守恒的促炎细胞因子il - 1的生产β(数据没有显示)。这些数据与铁道部语句(协议30.),这表明,免疫系统在植入网站不是压抑,而是功能和仔细控制。事实上,PCT的表达下调可能表明它可能有有害影响胎儿发育和怀孕进展。

6。结论

总之,我们的结果表明,PCT LPS刺激后的表达和合成M1的巨噬细胞是一种特殊的能力。此外,我们发现巨噬细胞培养在妊娠前三个月GS收购一个M2-like表型,不允许他们LPS刺激后产生PCT。基于这些数据,我们可以推测,孕妇可能有效地减少败血症产仔的女性而言,约减少50%的PCT在巨噬细胞表达。我们的数据,虽然他们只获得一个在体外人工培养的巨噬细胞,模型表明,PCT合成的放缓可能影响这个实验室的使用标记分析炎症状态的孕妇在脓毒症和自身免疫和炎性疾病。

最重要的是,这些数据支持这一概念由铁道部和Cardenas30.],怀孕是一个独特的条件,调节免疫系统,但不抑制,对细菌感染,导致微分反应还不完全知道。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Oriano Radillo和罗伯塔大疱分享资深作者。

确认

作者感谢Luca Mascaretti博士,Centro Trasfusionale Ospedale马焦雷di的里雅斯特(意大利的里雅斯特),提供从健康献血者和淡黄色的外套会Guzzetti为她帮助修改论文的。这项工作是支持的科研补助金卫生部(Ricerca Finalizzata RC 34/11),资助来自欧洲的卓越网络“EMBIC”在FP6(合同编号。lshnct - 2004 - 512040),意大利癌症研究协会(现),意大利的大学和研究(主要MFXE7L),地区Friuli-Venezia会(LINFONET和AITT艺术项目。23 legge regionale 26/2005),基金会Casali-Trieste (Roberta垂饰)。