文摘

这种前瞻性队列研究来验证假设的平衡Th17和Treg细胞频率末梢循环的干扰不同程度的结缔组织相关疾病患者肺动脉高血压(CTD-aPAH)和证明Th17 / Treg失衡对预后的影响。我们发现了频率和绝对项Th17和Treg细胞及相关血清细胞因子的分泌和表达的关键转录因子在117年患者结缔组织病(CTD), 53 CTD-aPAH患者和48名健康志愿者。此外,中值根据Th17水平/ Treg比率CTD-aPAH患者被选为集团部门生存分析的基础。CTD-aPAH病人显示显著增加外围Th17细胞,Th17-related细胞因子和RORγt mRNA水平。他们还提出了Treg细胞显著减少,Treg-related细胞因子,Foxp3 mRNA水平与CTD患者和健康对照组相比。更重要的是,Th17 / Treg比率明显CTD-aPAH的严重程度和预后有关。本研究表明,Th17 / Treg轴紊乱在CTD-aPAH中起着至关重要的作用。此外,Th17之间的动态平衡和Treg细胞可能影响CTD-aPAH患者的预后。

1。介绍

肺动脉高压(PAH)是一种常见的并发症等结缔组织病(CTD)系统性硬化症(SSc)、系统性红斑狼疮(SLE),混合性结缔组织病(MCTD),类风湿性关节炎(RA)和原发性干燥综合征(pSS)。在肺动脉高压的临床分类更新(1),这种类型的肺动脉高压(PH)定义如下:多环芳烃与结缔组织疾病属于第一组。大多数CTD-associated PAH (CTD-aPAH)出现的类型SSc-associated PAH (SSc-aPAH)。PAH患者的患病率SSc,条件是诊断是基于正确的心脏导管插入术评估充填压力,约为8 - 14% (2,3]。不仅CTD-aPAH的患病率高于特发性肺动脉高压(IPAH),而且它的预后比IPAH [4,5]。

Th17细胞表达视黄acid-related孤儿受体γt (RORγt)是最近发现CD4的子集+T细胞。与此同时,这个细胞子集,生产能力强大的促炎细胞因子包括IL-17a (IL-17) IL-17F, IL-21,和il - 22生成时,可能会发挥重要作用在自身免疫6,7),而CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)细胞表达forkhead /翼螺旋转录因子(Foxp3)能够调节效应T细胞的功能,维持免疫内稳态,防止自身免疫(8,9]。然而,检测特定表面标记染色(CD4细胞亚群的+CD25+CD127−)最近的研究也广泛使用10,11]。很好的平衡效应T细胞和Treg细胞调节免疫内稳态。Th17之间的动态平衡和Treg细胞参与CTD受损的发病机制(12- - - - - -15]。

承认,一个可能的角色Th17 / Treg轴CTD-aPAH从未被阐明。此外,相关研究的预后影响Th17 / Treg轴紊乱患者的致病因素CTD-aPAH仍有待发现。我们假设不平衡循环Th17 / Treg细胞也可能出现CTD-aPAH患者,与发病机制相关CTD-aPAH和重要的预后。因此,这个前瞻性群组研究的目的是验证假设的平衡Th17和Treg细胞绝对计数频率和末梢循环的干扰患者不同程度的CTD-aPAH和证明Th17 / Treg失衡对预后的影响。的等离子体水平Th17, Treg-related细胞因子和相关转录因子(ROR mRNA的表达γt和Foxp3)外周血单核细胞(PBMCs)进行评估和Th17 / Treg细胞失衡的潜在相关性的严重程度和预后CTD-aPAH也探索。氨基端probrain利钠肽(中位数水平以上病人),作为一个敏感的心血管疾病的标志,是独立与死亡率相关IPAH和SSc-aPAH16,17]。因此,潜在的相关性Th17 / Treg失衡与血清中位数水平以上病人CTD-aPAH水平探索。

2。材料和方法

2.1。患者选择

307例CTD患者前瞻性研究了从2010年1月至2012年10月。已挤分为亚型如SSc,系统性红斑狼疮,MCTD, RA和pSS根据美国风湿病学院的标准。所有患者评估肾、心脏、肝和肺功能。胸部高分辨率计算机断层扫描(HRCT)是用于检测肺栓塞或肺间质疾病的存在。患者符合以下条件被排除在本研究之外。18岁以下或75岁以上的年;与连续油管在活跃的阶段;史的慢性感染或最近的(< 1个月)感染临床上重要的或炎症条件包括创伤、疫苗接种,任何侵入性医疗检查或手术(< 3个月);与心脏功能属于世界卫生组织功能四级;与其他并发症,如严重的肝或肾功能衰竭、肺纤维化、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,癌症,不受控制的高血压、糖尿病、肥胖(体重指数(BMI) > 30公斤/米2)、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、炎症性肠病,和怀孕;接受治疗皮质类固醇或其他免疫抑制剂在去年三个月。其余的潜在受试者没有符合排除标准与血液动力学检查。收缩期肺动脉压(sPAP) > 40毫米汞柱,估计echocardiograph,用作导管插入术筛选阈值。病人被侵入性测试操作的心脏导管插入术的右侧。证实了多环芳烃被定义为平均肺动脉压(肺动脉平均)≥25毫米汞柱,与肺毛细血管楔压≤15毫米汞柱静息状态通过使用导管的方法。53 PAH患者,其主要原因被排除在外,如先天疾病,药物,和感染,导管检查,检查的录取CTD-aPAH组。主题与CTD-aPAH分为两组根据他们的收缩期肺动脉压力,轻度至中度CTD-aPAH (40 < sPAP≤70毫米汞柱, )和严重CTD-aPAH (sPAP > 70毫米汞柱, )。剩余的117 CTD患者的肺动脉压力处于正常状态,被承认为连续油管组。6分钟步行试验和世界卫生组织功能类两组的统计数据都被记录下来。病人被总结在表的主要特点1。48个健康志愿者与性别和年龄匹配的特点(39岁女性,9男性, 岁)被招募进组。本研究机构审查委员会批准的复旦大学。所有患者把他们的知情同意。

表1
研究对象的基线临床特征。
2.2。血液样品制备

外周血单核细胞(PBMCs)隔绝肝素化周围静脉血通过Ficoll-Hypaque lymphoprep (Nyegaard、挪威)密度离心的流式细胞仪分析和实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)。等离子体得到离心和存储后−80°C的测定细胞因子和中位数水平以上病人。

2.3。流仪Treg和Th17细胞的分析

分析Treg细胞,PBMCs surface-labeled CD4-PE / Cy5, CD25-PE其次是固定和透化作用和细胞沾Foxp3-Alexa Fluro488或与CD4-PE surface-labeled / Cy5, CD25-PE, CD127-FITC(美国eBioscience)。

对Th17细胞分析,PBMCs是悬浮在完全培养基(RPMI1640 heat-inactivated补充10%胎牛血清,(美国Gibco BRL))。文化刺激了1小时使用50 ng / mL十四烷酸佛波醇酯(PMA)和1μg / mL ionomycin(美国Sigma-Aldrich),然后使用500 ng / mL莫能菌素刺激(Alexis生化药剂,美国)3小时37°C的环境 有限公司2。细胞被洗在PBS和surface-labeled CD4-PE / Cy5(美国eBioscience)。表面染色后,细胞被固定和permeabilized使用固定/透化作用缓冲(美国eBioscience),然后沾IL-17a-PE(美国eBioscience)。标记细胞被洗和流式细胞仪分析了石中剑流式细胞分析仪(美国becton dickinson)使用FlowJo(树明星,美国)v7.6.1软件。在每种情况下,适当的染色与标记同形像控制抗体。

2.4。转录因子表达由实时定量PCR

总RNA提取个人PBMCs准备用试剂盒试剂(美国表达载体)。总RNA提取的互补脱氧核糖核酸制备通过逆转录益生元(dT)。使用以下引物配对:Foxp3: F: 5′-CACGCATGTTTGCCTTCTTCAGA-3′;R: 5′-GTAGGGTTGGAACACCT GCTGGG-3′;和RORγt: F: 5′-GCAATGGAAGTGGTGCTGGTT-3′;R: 5′-AGGATGCTTTGGCGATGAGTC-3′。实时定量PCR Foxp3 RORγt 7900年ABI棱镜进行序列检测系统(美国应用生物系统公司)SYBR绿色主人混合工具(豆类,中国)。Foxp3和RORγt表达数据,归一化相对于glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)。

2.5。检测血浆细胞因子和中位数水平以上病人

的等离子体水平IL-17a,白介素、干扰素-γ2,TGF -β和肿瘤坏死因子-β测量等方法利用未及工具包(NIBT,中国),遵守协议核医学部门的华山医院,复旦大学。所有的样品都在重复测量。

如前所述(17),中位数水平以上病人的浓度决定的方法Elecsys中位数水平以上病人三明治Elecsys免疫测定的2010仪器(瑞士罗氏诊断)。分析范围从20 pg / mL - 35000 pg / mL。

2.6。统计分析

连续变量表示为平均值±标准偏差。二分变量表示为百分比。比较组间是用学生t以及和皮尔逊卡方检验。多个组之间的差异进行了分析与方差分析矫正测试紧随其后。斯皮尔曼等级和测试被用来分析相关系数。Nonparameter分析通过使用Kolmogorov-Smirnov(钴)测试分析分布。生存分析是通过使用kaplan meier方法准备的。生存率较被用来比较不同。 值< 0.05被认为是显著的差异。统计分析采用SPSS17.0统计软件包(SPSS Inc .)、美国)。

3所示。结果

3.1。Treg百分比,Th17细胞CTD患者的外周血或CTD-aPAH

我们比较了歧视检测CD4细胞的亚群+CD25+Foxp3+T细胞和CD4+CD25+CD127−T细胞但不能检测两种方法之间的显著差异,利用CTD患者在18个,23 CTD-aPAH患者和20名健康对照组( (如图)1(一)和1 (b))。我们利用CD4、CD25和Foxp3的标记来检测Treg细胞在这项研究中。的患病率Treg细胞表达CD4的比率+CD25+Foxp3+/ CD4+T细胞绝对计数。

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图1
频率和循环的绝对计数Treg Th17细胞的比例以及Th17 / Treg CTD和CTD-aPAH患者和健康对照组。PBMCs从研究受试者沾贴上反抗体节中描述2。流式细胞术dot-plots表明控制策略被用于识别Treg CD4(封闭的+细胞CD4检测+CD25+Foxp3+和CD4+CD25+CD127−细胞)和Th17细胞(CD4的大门+细胞CD4检测+IL-17+细胞)。(一)dot-plots显示循环CD4的控制策略+CD25+Foxp3+Treg, CD4+CD25+CD127−Treg和Th17细胞控制,连续油管和CTD-aPAH组。(b)统计分析揭示了CD4的频率+CD25+Foxp3+Treg和CD4+CD25+CD127−Treg人口CD4之一+在健康对照组T细胞( )和CTD患者( )或CTD-aPAH ( )。(c)频率(左)和绝对计数循环Treg细胞(CD4(右)+CD25+Foxp3+)控制、连续油管和CTD-aPAH组。(d)(左)和频率的循环Th17细胞绝对计数(右)控制、连续油管和CTD-aPAH组。(e)的比率Th17 / Treg控制、连续油管和CTD-aPAH组。(f) Th17 Treg细胞频率和比率Th17 / Treg子组的轻度至中度CTD-aPAH和严重CTD-aPAH。 与对照组相比, ; 与连续油管组相比, 。

如图1 (c)的频率和绝对数量Treg细胞明显减少患者的外周血CTD ( ; 细胞/μL)和CTD-aPAH ( ; 细胞/μ与健康对照组(L)相比 , , ; 细胞/μl , )。循环Treg细胞百分比和绝对数量CTD患者明显高于那些CTD-aPAH患者( 与 , ; 细胞/μL与 细胞/μl )。此外,患者之间的百分比被发现显著差异严重CTD-aPAH和轻度至中度患者CTD-aPAH ( 与 , (如图)1 (f))。

如数据所示1(一)和1 (d),Th17细胞的患病率是CD4的表达为一个比+IL-17+T细胞CD4 /+T细胞绝对计数。Th17细胞的频率和绝对数量显然是增加患者的外周血CTD ( ; 细胞/μL)和CTD-aPAH ( ; 细胞/μ比正常对照组(左) , , ; 细胞/μl , )。显著差异的百分比和绝对数量也发现CTD-aPAH和CTD集团( 与 , ; 细胞/μL与 细胞/μl )。此外,Th17细胞的百分比明显高于患者严重CTD-aPAH比子群与轻度至中度CTD-aPAH ( 与 , (如图)1 (f))。

3.2。不平衡的循环Th17 / CTD患者Treg细胞或CTD-aPAH

的重要性增加Th17细胞和减少Treg细胞进一步探讨了计算Th17 / CTD-aPAH Treg细胞百分比比例的患者,仪,和健康对照人群(如图1 (e))。我们证明了Th17 Treg细胞比最高CTD-aPAH患者( ),在那些CTD患者(低 )和对照组(最低受试者 )。因此,Th17 / Treg细胞比率显著增加患者CTD-aPAH相比CTD患者和对照组( 与 , ; 与 , )。CTD-aPAH组,类似的显著差异也提出了两个子组之间严重CTD-aPAH和轻度至中度CTD-aPAH ( 与 , (如图)1 (f))。

3.3。ROR的表达γt和Foxp3 mRNA PBMCs CTD患者或CTD-aPAH

特定转录因子的T CTD-aPAH子集,仪,和对照组进行评估确认细胞学观察。RORγt是一个重要的转录因子对Th17细胞的分化,而具体主Treg细胞转录因子。这些转录因子的水平对Th17和Treg细胞被RT-qPCR PBMCs从包括主题分析。如图2(一个)ROR的水平γt表达调节CTD组( )和CTD-aPAH ( 比健康对照组() ; , ),而前两组之间有显著差异( )。相比之下,Foxp3的表达明显低于CTD患者( )和CTD-aPAH ( )与对照组患者相比( ; , )。此外,CTD-aPAH患者表达显著低于CTD患者( (如图)2 (b))。此外,RORγt和Foxp3水平轻度至中度CTD-aPAH子群( ; )是显著不同的子群与严重CTD-aPAH ( , ; , (如图)2 (c))。这些结果符合流仪分析Th17 Treg细胞。

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图2
ROR的表达γt和Foxp3 mRNA在CTD和CTD-aPAH患者和健康对照组。PBMCs mRNA表达的研究对象是通过实时定量聚合酶链反应来衡量的。结果是相对于GAPDH规范化。(一)ROR的表达γt mRNA在连续油管、CTD-aPAH和对照组。(b) mRNA的表达Foxp3在仪,CTD-aPAH和对照组。(c) ROR的表达γt和Foxp3 mRNA的子组轻度至中度CTD-aPAH和严重CTD-aPAH。 与对照组相比, ; 与连续油管组相比, 。
3.4。Th17——Treg-Related从CTD患者血清细胞因子和中位数水平以上病人或CTD-aPAH

辅助和调节性T cells-related病人血清中细胞因子和中位数水平以上病人在CTD和CTD-aPAH和健康对照组测定放射免疫检定法或Elecsys中位数水平以上病人三明治免疫测定。如表所示2,CTD患者表现出更高水平的血清IL-17a和中位数水平以上病人比健康对照组患者( ),但低于CTD-aPAH患者( )。与此同时,TGF -的表达β在对照组的受试者最高,降低CTD患者,CTD-aPAH患者最低。患者在连续油管和CTD-aPAH组有更高的血清il - 6水平,干扰素-γ2,TNF -α与健康对照组患者相比( ),而无显著差异之间观察到的CTD和CTD-aPAH集团( )。子组、轻度到中度CTD-aPAH组之间有明显的区别和严重CTD-aPAH组血清IL-17a TGF -β和中位数水平以上病人( )。

表2
血清细胞因子的浓度和中位数水平以上病人由未及Elecsys中位数水平以上病人三明治免疫测定(pg / mL)。
3.5。Th17 / Treg比率与相关细胞因子的相关性,ROR的表情γt和Foxp3 mRNA, CTD-aPAH患者的疾病严重程度的标志

Th17之间有显著相关性,Treg细胞的末梢循环CTD-aPAH集团( , (如图)3(一个))。Th17 / Treg IL-17a比率与血清浓度呈正相关( , )和ROR的表情γt mRNA ( , (如图)3 (b)和3 (c))PBMCs与血清浓度的TGF -负相关β( , )和Foxp3 mRNA的表达( , (如图)3 (d)和3 (e)在PBMCs)。Th17 / Treg比率之间的关系和血清il - 6的水平,干扰素-γ2,TNF -αCTD-aPAH患者也被研究,但是没有确定相关性( )。

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图3
Th17 / Treg比率和相关细胞因子之间的相关性;ROR的表达γt和Foxp3 mRNA和CTD-aPAH患者的疾病严重程度的标志。(a)的比值Treg CD4细胞+与比率的Th17 CD4细胞负相关+细胞。(b)的比率Th17 / Treg积极与IL-17浓度。(c)比值Th17 / Treg ROR的积极与表达γ信使rna。(d)的比值Th17 / Treg TGF -负相关β浓度。(e)的比率Th17 / Treg消极与Foxp3 mRNA的表达。(f)的比率Th17 / Treg积极与sPAP水平。(g)的比率Th17 / Treg积极与NT-pro BNP浓度。

sPAP和血清水平的中位数水平以上病人被用作标记CTD-aPAH患者疾病的严重程度。CTD-aPAH组,sPAP和中位数水平以上病人的血清水平都是呈正相关的比率Th17 / Treg ( , ; , (如图)3 (f)和3 (g))。

3.6。生存分析

评估Th17和Treg轴与临床结果,Th17 / Treg比率被认为是一个分类变量。钴试验表明,Th17 / Treg比CTD-aPAH患者表现出偏态分布( )。因此,中值(1.474),这是按照比例Th17 / Treg 53名患者的研究中,被选为小组划分标准。26患者CTD-aPAH Th17 / Treg比率小于1.474的低Th17 / Treg录取比例组。相比之下,患者27 CTD-aPAH的Th17 / Treg比率等于或超过1.474高Th17 / Treg录取比例。评估期间定义的日期CTD-aPAH患者承认上述两个子组,直到2012年10月。患者幸存逾期观察期的最后期限被视为审查。

所有53名患者的总生存时间CTD-aPAH 个月。患者在低Th17 / Treg比率集团总体生存时间 个月。患者高Th17 / Treg比率集团总体生存时间 个月。所有患者的整体存活率 、41.51%和16.98%,1、2、3年,分别。患者在低Th17 / Treg比率集团整体存活率分别为76.92%,53.85%,和23.08%,1,2,和3年。患者高Th17 / Treg比率集团整体存活率分别为66.67%,29.63%,和11.11%,1,2,3年,分别(如图4)。两组之间有显著性差异( , )。


图4
kaplan meier CTD-aPAH患者的生存分析。曲线显示CTD-aPAH患者总生存时间较低或高Th17 / Treg比率。

4所示。讨论

在稳定状态,Th17和Treg细胞可能保持动态平衡。这种平衡是毁于自身免疫性疾病如CTD。尽管在血流动力学扰动的相似性,CTD-associated PAH患者预后明显的区别于其他形式的多环芳烃。这种类型的多环芳烃包含固有属性CTD的基础上。先前的研究已经证实,IL-17浓度和Th17细胞升高CTD患者(15,18,19]。大多数报告表明,Treg削弱的患病率在PBMCs舱仪,虽然一些研究报道正常或Treg水平升高(20.- - - - - -23]。然而,人们普遍认为Treg CTD患者减少免疫抑制能力(24- - - - - -29日]。这些差异可能与病人的系列的可变性不同研究中有关疾病的类型和阶段以及实施治疗。

CTD患者尽管PAH的频率很高,研究对Th17 / Treg轴CTD-aPAH非常罕见。Tamosiuniene等人表明,血管内皮生长因子受体2 (VEGFR-2)封锁诱导显著肺内皮细胞凋亡T cell-deficient老鼠而不是老鼠免疫重组(IR)。红外与CD4+CD25+前T细胞子集血管损伤减毒的发展多环芳烃(30.]。此外,使内皮细胞后,Treg细胞移植的表面表达编程死亡1 (PD-1)受体以及分泌il - 10和TGF -β促进血管舒张,其反应(31日),而更直接的证据表明,PH值条件也与异常Treg细胞数量有关,CD4活动或简单地减少+T细胞数(30.,32]。总之,这些研究表明,Treg细胞功能通常是限制血管损伤,可能对多环芳烃的发展起到保护作用。缺乏相关的研究在这一领域对Th17细胞,炎症和自身免疫性疾病密切相关,以及counter-interacting Treg细胞子集。在我们的研究中,Th17 / Treg轴紊乱CTD-aPAH和效率的不同阶段Th17 / Treg失衡作为预测患者预后的生物标志物CTD-aPAH进行了探讨。

目前统计数据的频率和绝对数量提供直接证据Treg细胞和Foxp3 mRNA的表达显著降低患者相比CTD-aPAH CTD患者或健康对照组。与此同时,我们发现CTD-aPAH患者表现出显著增加外围Th17数字,Th17-related细胞因子和RORγt mRNA水平CTD患者或健康对照组相比,尽管CTD-aPAH患者,Th17 / Treg细胞的频率,Th17-related细胞因子和RORγt / Foxp3 mRNA水平显示显著区别轻度至中度CTD-aPAH子群和严重CTD-aPAH子群。此外,Th17 / Treg细胞的比例与CTD-aPAH线性正相关程度由sPAP表示,中位数水平以上病人。这些结果表明,Th17 / Treg CTD-aPAH动态平衡参与发病。因此,Th17 / Treg比率可能是一个重要的工具在检测和描述各种CTD-aPAH患者免疫状况。

细胞因子环境扮演关键的角色从天真的CD4细胞分化+T细胞Treg或Th17细胞(33- - - - - -35]。在目前的研究中,结果表明,il - 6的浓度和IL-17,这两种炎症升高,都明显高于CTD患者和CTD-aPAH IL-17浓度呈正相关,Th17 / Treg比率。

几个大型的前瞻性研究表明,sPAP和中位数水平以上病人的严重程度和预后的独立预测指标IPAH CTD-aPAH。之间存在高度相关关系的比率Th17 / Treg和sPAP或血清NT-pro BNP水平已经证明了在这个研究。这些间接证据表明,Th17的比率/ Treg已经有效地评估CTD-aPAH的严重程度和预测预后的CTD-aPAH患者。患者的流行病学研究Th17 / Treg比率CTD-aPAH还很少。Th17 / Treg比率的分布频率通过钴试验患者CTD-aPAH显示偏态分布。我们选择中间值根据Th17水平/ Treg比率CTD-aPAH患者组部门生存分析的基础。生存分析显示,患者CTD-aPAH, Th17 / Treg比率较低,患者有更好的生存往往比Th17 / Treg比率较高。这些发现直接建议Th17之间的动态平衡和Treg细胞可能影响患者的预后CTD-aPAH和评估CTD-aPAH患者预后预测因素。

5。结论

我们的研究表明,Th17 / Treg存在失衡的患者的外周血CTD-aPAH。我们还证实,Th17 / Treg比不仅与炎症标记物有关,还与CTD-aPAH的严重程度和预后。所有这些建议的潜在作用Th17 / Treg失衡CTD-aPAH的发病和进展。

上述结果证明需要在更大的群体。此外,进一步的研究可以用来观察的变化Th17 / Treg轴CTD-aPAH患者处于活跃阶段和调查的影响皮质类固醇或免疫抑制剂治疗Th17 / Treg平衡CTD-aPAH患者。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Saren Gaowa和Wenyong周贡献本文同样。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金的资助。81270339也没有。81300182,武汉科技研究项目的资助。201306060201010271,来自湖北省自然科学基金。2013 cfb302,资助基础研究基金的中央大学。2042012 kf1099,没有。2042014 kf0110,没有。2012302020206。本文已经阅读和批准所有作者和作者的要求已经满足。每个作者认为本文代表诚实的工作。 The authors thank the patients for donation of samples to the study, as well as the hospital staff who made this study possible.