文摘
背景。巨噬细胞和滑膜成纤维细胞(SF)是涉及两个主要的细胞在类风湿性关节炎(RA)的发病机制。科幻小说可以是一个来源的细胞因子和生长因子激活巨噬细胞生存和开车。在这里,我们研究了科幻单核细胞生存能力和表型的影响。方法。科幻滑膜组织的RA患者中分离的从外周血CD14 +细胞健康的捐赠者。科幻的媒体24小时后收集文化有或没有与肿瘤坏死因子的刺激α或il - 1β。巨噬细胞分化通过流式细胞术进行了研究。结果。条件培养基从科幻小说相比显著增加单核细胞生存能力60% CD14 +细胞培养介质。这种效应是增强il - 1使用的媒体β和肿瘤坏死因子α刺激的科幻小说。gm - csf但不是csf和IL34阻止抗体能够显著减少单核细胞生存能力30%时加入il - 1的条件媒体β和肿瘤坏死因子α刺激的科幻小说。最后,单核细胞培养在科幻的M1和M2的媒体没有表现出一个特定的表型。结论。总的来说,类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞和促炎细胞因子(il - 1刺激β和肿瘤坏死因子α通过gm - csf)促进单核细胞生存能力但不引起特定的巨噬细胞极化。
1。介绍
类风湿性关节炎是一种自身免疫性疾病,其特征是一种慢性的炎症导致关节滑膜的破坏。炎症和居民细胞滑膜组织中发挥重要作用在疾病的发病机理的生产范围广泛的促炎细胞因子和生长因子。滑膜成纤维细胞(SF)和巨噬细胞两种细胞类型组合正常滑膜衬里层的组织。他们也是主要的细胞中发现的类风湿性关节炎患者滑膜发炎。在RA,科幻小说获得pseudotumoral表型特点是更高的增殖率,侵袭性和抗细胞凋亡导致粘膜肥大层(1,2]。这些细胞通过产生细胞因子(il - 6和发挥了关键作用受体激活核因子κB配体(RANKL)),使炎症和诱导骨破坏和metalloproteases导致软骨损伤。除了他们的贡献软骨和骨破坏,科幻小说似乎扮演着重要的角色在归航,增长,或其他细胞类型的函数,如炎症细胞(3]。例如,科幻是趋化因子的来源以及造血生长因子如单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)、巨噬细胞集落刺激因子(csf) IL-34,或者能够支持单核细胞集落刺激因子(gm - csf)迁移和滑膜巨噬细胞激活。
巨噬细胞中也主要细胞参与炎症性关节炎的发病机制。这些细胞的发炎滑膜组织和他们的数量在滑膜亚系层与疾病活动和对治疗的反应4,5]。也强调其重要性针对macrophage-derived细胞因子(TNF治疗的疗效α或il - 1β)在类风湿性关节炎(6]。这些细胞可以从循环单核细胞在滑膜组织招募或从巨噬细胞前体细胞的分化已经出现在关节。它已经表明,单核细胞/巨噬细胞存活率的主要因素如csf, IL-34或gm - csf表达在RA患者的滑液和膜7- - - - - -9]。这些因素的参与炎症和破坏的关节已经证明在RA动物模型。因此,op / op老鼠缺乏功能- csf是防止抗原诱导关节炎(10]。此外,gm - csf加剧关节炎动物疾病,同时gm - csf缺陷小鼠保护胶原诱导的关节炎(11,12]。这些研究表明,csf和gm - csf能加剧炎症反应和支持的角色单核细胞/巨噬细胞在类风湿性关节炎的发病机制。
越来越清楚的是,巨噬细胞是一种异构的人口,他们应该分类根据其表型和功能(13]。巨噬细胞可以划分为两类:经典激活巨噬细胞(M1),通过分泌的促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α,il - 1β,il - 12和或者激活巨噬细胞(M2)具有抗炎功能(分泌il - 10、IL-1RA和转化生长因子-β),促进组织修复14]。滑膜巨噬细胞的表型是异构相伴的表达所显示标记M1和M2 (15]。巨噬细胞极化可能取决于疾病活动或糖皮质激素等治疗,众所周知,促进M2极化(16]。还假设职业之间的不平衡,抗炎巨噬细胞可能参与了慢性炎症。
科幻小说和滑膜巨噬细胞在密切接触。随着科幻来源的细胞因子和生长因子,它被假定这些细胞可以调节的生存和激活单核细胞/巨噬细胞在滑膜组织。然而,尚不清楚什么因素(csf、IL-34或gm - csf)参与促进单核细胞在类风湿性滑膜生存。这个问题很重要,因为新的治疗策略目标- csf和gm - csf在发展。此外,目前尚不清楚科幻能够影响巨噬细胞极化。在这项工作中,我们已经表明,RA科幻小说能促进单核细胞通过分泌csf的gm - csf和不可行性或IL-34。il - 1β是主要的细胞因子诱导生产gm - csf的科幻小说。最后,科幻小说不能诱导M1和M2特定表型。
2。材料和方法
2.1。人类的样本
所有的病人登记给他们正式的同意。这项研究是经当地伦理委员会批准,由法国研究部门(N 2008 - 402°)按照《赫尔辛基宣言》。
2.1.1。CD14 +单核细胞隔离
从“获得血样Etablissement法语杜唱“。CD14 +单核细胞、外周血单核细胞从10个不同的捐赠者被离心分离聚蔗糖梯度(美国Sigma-Aldrich)。CD14 +细胞磁贴上CD14微和积极选择mac技术(Miltenyi研究,德国)。CD14 +细胞CD3−通过流式细胞术(纯度≥95%)和进一步的实验前被冻结了。
2.1.2。滑膜成纤维细胞和滑膜液体
滑膜活检获得手术时从类风湿性关节炎或关节滑膜切除关节置换手术的病人。总的来说,活检从9不同患者用于我们的实验。科幻小说在孵化后从滑膜组织在胶原酶(1毫克/毫升)(Sigma-Aldrich) 2小时。过滤后70μm细胞过滤器,在RPMI 1640培养基培养细胞(Lonza、比利时)补充10%的胎牛血清(美国ThermoScientific)和1%的抗生素(青霉素、链霉素(Lonza))。不依从细胞被洗杜尔贝科的磷酸缓冲盐(DPBS) (Lonza) 24 h。流式细胞仪分析显示表达式的CD90超过90%的孤立的细胞。细胞之间使用通道3和8。
滑膜液得到的风湿病学部门南特大学医院。细胞被离心(3600 rpm, 15分钟)和液体存储立即−80°C。滑膜液从14获得骨关节炎(OA)和31 RA患者在疾病的爆发。患者患有风湿性关节炎为188个月(±140)。类风湿因子和anti-CCP抗体阳性,71%和76%的病人,分别和62%的患者都是积极的。百分之六十七的患者骨侵蚀。
2.2。滑膜成纤维细胞条件媒体
科幻的媒体则来自RA科幻或培养RPMI 2%的12小时的边后卫和治疗与否(CT) 25 ng / mL的TNFα或il - 1β(研发系统)为24小时。的刺激,条件媒体离心液(5分钟,1600 rpm)去除细胞和碎片,整除,储存在−80°C。条件媒体OA患者也没有刺激产生的细胞因子。
2.3。RNA隔离和实时PCR
RA科幻总RNA提取使用试剂盒试剂(表达载体、法国)。合成第一链cDNA从1μ使用极大值H - g总RNA合成第一链cDNA工具包(ThermoScientific)。实时PCR进行使用SYBRGreen Supermix (Bio-Rad、法国)。定量PCR (qPCRs)进行CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)。分析使用人类hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase(产生HPRT)作为不变量控制。
2.4。WST-1可行性分析
解冻后,CD14 +单核细胞数和resuspendedαMEM培养基补充20%的边后卫。在96孔板中,我们添加了50μL在每个细胞(45000细胞/)然后50μL (csf、IL-34和gm - csf(所有从研发系统)稀释2% RPMI获得25个,50岁和10 ng / mL最终浓度,分别或50μL (RA科幻的媒体。介质(50μL;2%的边后卫)没有任何细胞因子作为控制条件(CT)。3天后,细胞生存能力评估WST-1细胞增殖试剂(罗氏公司、法国)通过添加10μL /。获得的甲瓒染料从WST-1乳沟线粒体脱氢酶是由一个微型板块阅读读者Wallac 1420维克多2(美国珀金埃尔默)在420年和480 nm孵化后4小时37°C。抗体用于识别细胞因子与单核细胞生存能力如下:反- csf(研发系统),anti-IL-34 (Diaclone INSERM UMR957),和anti-GM-CSF(研发系统)在2和5μ分别g / mL。我们以前测试不同的抗体浓度来确定最合适的浓度。
2.5。量化的滑膜液和细胞因子水平的媒体
gm - csf水平测定RA科幻的媒体通过ELISA测定(人类gm - csf DuoSet ELISA开发工具包,研发系统)。在滑膜液,gm - csf、il - 1β,肿瘤坏死因子α水平测量使用Luminex技术(从Bio-Rad Bio-Plex Pro化验)和csf水平用ELISA测定(人类- csf Duoset、研发系统)。
2.6。流式细胞术
确定分化细胞的表型获得在RA科幻的媒体,我们使用流式细胞仪。CD14 +单核细胞培养4天αMEM补充10%的边后卫单独或与干扰素γ(50 ng / mL;M1)或il - 4 (50 ng / mL;M2a)和il - 10 (50 ng / mL;M2c)或RA科幻的媒体稀释1/2。收集细胞使用StemPro Accutase(生命技术)DPBS清洗和孵化1小时以下抗体:anti-CD14 / 605年灿烂的紫,anti-CD16 / 421年灿烂的紫,anti-CD64 / Alexa萤石488,anti-CD163 / Alexa萤石647和anti-CD200R / Phycoerythrine (PE)(美国从BioLegend)。细胞分析与BD LSR二流式细胞分析仪(BD生物科学)使用BD FACSDiva软件(BD生物科学)。值表示为平均荧光强度的比值(MFI)刺激细胞的标记在MFI如果细胞(CD14 +单核细胞培养4天α与10%的边后卫只有MEM补充)。
2.7。统计数据
我们使用Kruskall-Wallis测试多组比较。Mann-Whitney测试被用来比较每组。滑膜液中细胞因子浓度之间的相关性进行了研究使用非参数的斯皮尔曼等级次序测试。被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。滑膜条件媒体增加单核细胞生存能力
首先,我们调查了科幻小说产生的可溶性因子是否能促进单核细胞生存能力。CD14 +细胞与健康的捐赠者是培养3天从RA科幻在媒体的存在条件。细胞生存条件媒体评估的每个条件比色测定(WST-1)和csf引起的生存能力相比,IL-34或gm - csf。引起的结果表示在比例的可行性- csf (100%)。如图1,单核细胞生存能力显著增加的媒体相比,控制细胞。这种效应与csf相当于观察,gm - csf,或者从nonstimulated科幻IL-34当使用条件培养基。相比之下,使用条件时这种效应更大媒体与il - 1科幻prestimulated 24小时β或肿瘤坏死因子α。在这些条件下,单核细胞生存能力独自csf相比显著增加(+ 29% ()+ 52% (),肿瘤坏死因子α和il - 1β的媒体,职责)。OA科幻条件培养基诱导显著增加单核细胞生存能力独自CD14相比),但这种影响是低于- csf或RA诱导的科幻的媒体()。
3.2。滑膜成纤维细胞表达的主要单核细胞生存因素- csf, IL-34, gm - csf和这个表达式是增加了肿瘤坏死因子α或il - 1β刺激
科幻的媒体能够促进单核细胞生存,然后我们研究了科幻小说的主要单核细胞生存因素的表达(csf、IL-34和gm - csf)及其监管的促炎细胞因子il - 1β和肿瘤坏死因子α。24小时后的文化有或没有TNFα(25 ng / mL)或il - 1β(25 ng / mL), synoviocytes RNA被qPCR收获和基因表达研究。如图2,如果科幻表达- csf和IL-34而gm - csf弱表达,没有表情的一些科幻小说。肿瘤坏死因子α刺激显著增加- csf、IL-34和gm - csf表达科幻。相比之下,il - 1β刺激对csf和IL-34表达但没有显著影响gm - csf表达能够增加450±233倍,而如果细胞。我们确认这些结果ELISA测定蛋白质含量:il - 1β刺激浓度显著增加gm - csf (285 pg / mL(±141)相比,肿瘤坏死因子α刺激(45 pg / mL(±30)),如果细胞(7 pg / mL (±3) (和对肿瘤坏死因子α和il - 1β、职责))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。Anti-GM-CSF抗体但不是csf或IL-34抗体抑制单核细胞生存条件引起的媒体从科幻Prestimulated il - 1β和肿瘤坏死因子α
然后我们想确定哪些因素- csf, IL-34或gm - csf参与维护科幻单核细胞生存能力的媒体。新孤立CD14 +细胞培养3天与科幻的媒体的csf, IL-34或gm - csf阻止抗体。如图3,没有抗体能够抑制的影响如果科幻的媒体。只有gm - csf阻止抗体抑制30%的条件媒体il - 1的影响β或肿瘤坏死因子αprestimulated科幻。此外,阻止抗体针对白介素家族(anti-gp130和anti-IL-6)没有生物效应(数据没有显示)。因此,gm - csf的细胞因子参与了科幻小说对单核细胞生存的影响,但只有在细胞促炎细胞因子的刺激。
3.4。巨噬细胞引起滑膜成纤维细胞条件媒体不表现出特定的表型
巨噬细胞可以细分具体分成两组:经典活化的巨噬细胞(M1)促炎,或者激活巨噬细胞(M2)具有抗炎和组织修复功能。确定引起巨噬细胞的表型科幻的媒体,我们进行了流式细胞仪分析细胞表面标记的古典(CD14)模(CD16) M1 (CD64) M2a (CD200R)和M2c (CD163)巨噬细胞(图4)。结果表示为平均荧光强度的比值(MFI)如果在MFI标记的细胞。正如所预料的那样,刺激INF-gamma、il - 4和il - 10 CD64的增加(18.3±3.4倍),CD200R(5.6±2.9倍),和CD163(5±2.4倍)表达式,分别。相比之下,我们没有发现任何监管的细胞表面标记细胞分化与如果科幻的媒体。轻微但不显著增加CD14和肿瘤坏死因子单核细胞培养中观察到α和il - 1β刺激的科幻的媒体和与il - 1 CD163的培养β刺激的科幻的媒体。总的来说,我们的数据表明,尽管科幻的媒体增加单核细胞生存能力和扩散,他们不能诱导M1和M2巨噬细胞标记。
3.5。gm - csf在风湿性关节炎患者滑膜液浓度增加,与肿瘤坏死因子相关α和il - 1β浓度
细胞因子在滑膜微环境中还发现的类风湿性关节炎患者滑液。我们已经表明,IL-34高架在RA滑膜液体相比,骨关节炎(OA) [7]。因此,我们下一个评估的浓度- csf, gm - csf、il - 1β,肿瘤坏死因子α滑膜液(图5)。我们发现显著增加的水平相比,这些细胞因子在RA OA。的意思是- csf含量5.2 pg / mL(±0.75)和12个pg / mL (±2.7) (14)而gm - csf的意思是浓度(±2.7)pg / mL和75.8 (±23.3)pg / mL (分别在OA和RA组。正如所料,肿瘤坏死因子α浓度是在RA高于OA滑膜液(9.2 (±4.5)pg / mL和231(168±))和il - 1β(1.2±0.37)pg / mL和15.8 (±6.2)pg / mL OA和RA患者,职责)。积极和重大的gm - csf浓度之间的相关性被发现,这些2细胞因子浓度(和与肿瘤坏死因子α和il - 1β、职责;)。这些结果表明,单核细胞生存能力的三个主要因素是增加相比,风湿性关节炎患者滑膜液OA患者。il - 1之间存在正相关关系β和肿瘤坏死因子α浓度和gm - csf水平。因此,在炎症条件下,gm - csf联合浓度增加,可以扮演一个角色在RA患者单核细胞的生存能力。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4所示。讨论
巨噬细胞是关键细胞参与了RA的生理病理学。这些细胞丰富的滑膜和肿瘤坏死因子等促炎细胞因子的主要来源α或il - 1β。机制导致滑膜组织中巨噬细胞的积累并不完全清楚。使用标签自体单核细胞,Thurlings等人表明,在RA,只有少量的外围单核细胞迁移到滑液舱,表明的营业额滑膜巨噬细胞从循环单核细胞缓慢17]。此外,研究表明巨噬细胞凋亡减少滑膜组织(5]。这表明有生存能力的增加巨噬细胞前体的炎症和目标因素促进这种生存能力可以在RA治疗方法。在这项研究中,我们发现RA科幻能够促进单核细胞生存能力和gm - csf,主要由il - 1诱导β和肿瘤坏死因子α,导致这种效果。
滑膜细胞是由居民如科幻小说能够与炎症细胞存在于组织中。例如,它已被证明,科幻小说可以促进B细胞生存能力在体外通过IL-15表达式(18]。这些细胞也可以促进CD4 T细胞和中性粒细胞生存但并不是他们的扩散19]。Coculture科幻的U937细胞促进软骨退化通过科幻增加基质金属蛋白酶的表达,表明炎症细胞可以反过来调节科幻活动(20.]。在这里,我们表明,科幻的媒体可以促进单核细胞生存能力与csf相同的功效,IL-34或gm - csf。此外,prestimulation与TNF synoviocytes的24小时α或il - 1β进一步加强了这一效果。有趣的是,从il - 1条件媒体β科幻诱导刺激最大的效果,显示出显著增加单核细胞生存能力相比,csf。在巨噬细胞il - 1的主要来源之一β滑膜,我们可以推测,他们可能反过来激活科幻小说产生影响因素自身的生存能力。
识别哪些因素参与了科幻小说对单核细胞的影响,我们下一个评估表达式的科幻小说三大单核细胞生存因素(IL34、csf和gm - csf)并使用阻塞抗体抑制的影响。csf是第一个被孤立的造血生长因子(21]。已经表明,科幻小说能够产生csf,这个表达式被增加了地塞米松或类维生素a和减少了吲哚美辛8,22,23]。因此有人猜测csf是主要的科幻衍生因子参与了RA的增加单核细胞的生存。然而,据我们所知,没有研究这种效应的直接证据。在这里,我们证实,csf表达synoviocytes和监管促炎细胞因子。然而,我们已经表明,csf阻止抗体无法防止proviability科幻效果的媒体。符合这个结果,迪克森等人最近表明,科幻的媒体可以促进osteoclastogenesis但培养基中添加- csf被要求观察这种效应(24]。因此,如果csf表达的是科幻小说,其生物活性需要进一步探讨。
IL-34是一种新发现的细胞因子,可以代替csf诱导单核细胞生存和osteoclastogenesis [25]。我们是第一个表明RA科幻小说产生IL-34,这个表达式是增加了肿瘤坏死因子α刺激(7]。在这里,我们表明,阻止IL-34没有影响单核细胞生存能力科幻条件引起的媒体。黄等人最近研究的角色IL-34科幻osteoclastogenesis和人类产生的PBMC的迁移26]。他们表明,添加一个阻塞抗体IL-34科幻的媒体减少人类单核细胞的迁移方式存在剂量依赖的相关性。此外,添加anti-IL-34抗体也显著降低破骨细胞的形成。然而,这些作者使用PBMC破骨细胞的来源。作为IL-34已被证明诱导IL-17表达式PBMC的[27),目前尚不清楚是否观察到的效果直接影响有关IL-34或其他细胞如淋巴细胞产生的因素。
在这项研究中,我们确定了gm - csf作为生长因子参与单核细胞生存能力科幻条件引起的媒体。有趣的是,这种效果只是观察il - 1使用的媒体β或肿瘤坏死因子αprestimulated科幻。这可以解释为低水平的表达gm - csf的科幻没有细胞因子刺激。我们发现,il - 1β是比TNF更强大吗α诱导gm - csf生产。这些结果与以前的研究一致表明il - 1的重要性β在科幻小说(生长因子表达的调控28,29日]。这种影响不仅限于这种类型的细胞和被描述,例如,与人类肺成纤维细胞。其生产的gm - csf也增加对il - 1的回应β刺激(30.]。在活的有机体内,il - 1β全身的关节炎是不太严重的gm - csf−−/老鼠显示il - 1的一部分β效果是由gm - csf (31日]。最后,gm - csf的影响并不局限于单核细胞谱系,因为它也能增加中性粒细胞和科幻的生存32,33]。然而,即使重要,我们表明,anti-GM-CSF抗体抑制单核细胞生存能力在一定程度上表明,约30%的其他因素能够调节单核细胞生存存在于圣条件培养基。然而,这些结果证实,gm - csf可能是一个有趣的目标治疗RA。这是符合mavrilimumab的有前途的影响,一个单克隆抗体针对的α亚基GM-CSFR,实际上在临床二期研究(34]。
巨噬细胞在RA患者的滑膜发炎组织代表组成的异质群体支持和抗炎细胞亚型(35]。其特定的极化状态可能会改变这种疾病的过程中,必须行列式在表型和疾病的严重程度。此外,高可塑性是这些细胞群的特征之一。这种可塑性是受支持的平衡和抗炎信号(36]。Ambarus等人通过免疫组织化学方法研究了巨噬细胞的表型在RA滑膜组织和SPA患者(15]。他们确认这个异质性的大多数细胞M1和M2 coexpressed标记。使用古典和验证M1和M2巨噬细胞的标记,我们研究在体外科幻的媒体巨噬细胞极化的影响通过流式细胞仪。尽管M2a古典M1的标志和M2c诱导干扰素γ,IL4, IL10,没有特定的标记分别调节巨噬细胞分化在科幻的媒体的存在。的媒体代表的混合不同的细胞因子和生长因子,细胞在同一时间。gm - csf区分巨噬细胞M1表型(37]。另一方面,csf和IL-34已知极化巨噬细胞对免疫抑制的(38]。有趣的是,分公司等人表明,gm - csf防止IL-34[引起的免疫抑制巨噬细胞的生成39]。这表明最终的两极分化的细胞的细胞因子和生长因子之间复杂的相互作用的结果。如果科幻小说不能诱导特定的表型,这些细胞可以简单地采取行动维护生存能力,增加成熟单核细胞的半衰期,极化被其他细胞因子分泌的结果出现在炎性微环境(B细胞、T细胞和肥大细胞)。
总的来说,科幻小说产生的因素,增强单核细胞生存能力。有趣的是,在缺乏肿瘤坏死因子α或il - 1β刺激,经典的单核细胞生存因素(csf、gm - csf或IL-34)没有出现在这种效果发挥重要作用。这表明,未知的细胞因子和生长因子作用于单核细胞可能参与了战争,仍然被发现。此外,针对一个细胞因子可能是不够的,因为科幻的媒体是一个混合的细胞因子和生长因子交互控制单核细胞的生存能力。我们还表明,il - 1β是单核细胞生存的主要动力之一通过科幻gm - csf生产的感应。众所周知,il - 1β是一种主要细胞因子参与晶体诱导关节炎和巨噬细胞也在这些疾病中发挥核心作用。考虑,针对gm - csf也可以承诺在痛风或焦磷酸钙沉积病(CPPD)。最后,如果科幻的媒体没有引起任何的古典巨噬细胞表型,这些细胞可以促进未成熟单核细胞的生存能力,可以有针对性的滑膜内微环境的其他炎症细胞产生的细胞因子。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Christelle Darrieutort-Laffite构想的研究理念,导致实验设计,进行实验,参与论文的编写和数据解释。Mathias Chatelais Marie-Astrid Boutet,瑞吉斯·布导致实验设计和实验程序执行。Benoit勒高夫,弗雷德里克·布兰查德和多米尼克·海曼协助概念研究的理念和参与其设计和数据分析和论文的写作。
确认
本研究从法国风湿病学学会(提供资助法国法国Rhumatologie)。作者承认席琳Cozic博士和博士格雷戈勒Cormier参与滑液样本集合。