文摘

内脏利什曼病(重要的)流行地区,少数感染者疾病进展,因为他们中的大多数发展保护性免疫。因此,我们调查的风险标记六世多发地部门内部。分析受感染的症状和无症状,未感染人,六世患者提出降低高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c),高架三酰甘油(标签),和极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)水平升高。一种脂蛋白脂肪酶(LPL)基因的多态性分析使用HindIII限制消化(N= 156个样本)(H + =存在和H−=的缺失突变)显示了调整后的优势比(或六世)和H + / H +时未感染的个体相比,H−−/ H基因型(OR = 21.3;95%可信区间= 2.32 - -3335.3;P= 0.003)。H + / H + H +基因型和等位基因与VLDL-C和标记水平升高有关(P< 0.05),高密度脂蛋白胆固醇水平降低(P< 0.05)。分析L162V多态性的过氧物酶体proliferator-activated受体α(PPARα)基因(n= 248)显示低浓缩铀/ Val时调整或增加较低浓缩铀/低浓缩铀基因型(OR = 8.77;95%可信区间= 1.41 - -78.70;P= 0.014)。高标记(P= 0.021)和VLDL-C (P= 0.023)水平对六世有关,而低高密度脂蛋白(P= 0.006)水平与抵抗感染。突变LPL和PPARα列伊/ Val基因型可能被认为风险发展的重要标志。

1。介绍

内脏利什曼病(六世)是一种全身性疾病,流行于热带和亚热带地区。重要的是由不同物种属内的原生动物利什曼虫和杜氏利什曼虫复杂的,包括婴儿利什曼虫(以前称为l . chagasi),在新世界(1]。VL-endemic区域,大多数感染者保持无症状。患者感染可能会出现轻微的症状,少数感染者,约10 - 20%,进步活动严重疾病,特点是发热、肝脾肿大、全血细胞减少症,hypergammaglobulinemia,体重严重下降2,3]。然而,与对感染的易感性相关进展的因素并不是众所周知的。

免疫系统已被先前的研究,评估了风险的自然焦点标记为重要的发展。大多数研究都集中在基因与免疫系统有关。在研究方法主要基于家庭组重要的感染,在SLC11A1(以前称为自然resistance-associated巨噬细胞蛋白1,NRamp-1)基因在染色体2 q35 [4,5),interleukin-4 / interleukin-9 [6),TNF轨迹(7],22号染色体一轨迹q12 [8,9,地震10],IL-1beta [11)多态性与重要的感染有关。然而,在2009年审查(12],布莱克威尔等人认为,大多数这些多态性有边际影响感染恶化。最近,il - 10 819 C / T基因型与易感性有关伊朗重要的发展(13]。在well-powered人群为基础的研究中,CXCR2基因(14)和DLL1编码delta-like 1,等级3的配体(15),与易感性有关重要的发展但不是SLC11A1在印度(16]。最近,另一个well-powered以人群为基础的研究显示一致的贡献HLA-DRB1-HLA-DQA1 HLA二类地区重要的易感性在印度次大陆和巴西(17]。然而,这些遗传因素的作用在这些研究没有解决重要的发病机制。

在l . infantum感染,保护性免疫的发展大多数人居住在VL-endemic地区(2]。在活动性疾病,免疫发生错乱;然而,免疫系统仍高度激活(3]。因此,非特异性因素可能由寄生虫感染中起着重要作用,可以有效地规避有效的免疫反应。此外,一项研究表明,因素与获得细胞介导免疫可以解释的发展六世(18]。因此,在这项研究中,我们关注多发地,脂质代谢。

几项研究已经报道了脂质改变人类重要的情况下(19- - - - - -22]。在这项研究中,我们首先分析血清脂概要文件在大量患者临床表现六世。我们发现高三酰甘油(标签)的水平,高水平极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)和低高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c)水平在感染症状的人。这些变化可能会造成炎症感染过程;然而,我们调查了这些脂蛋白分数的易感性可能的作用l . infantum感染,因为以前的结果表明,无鞭毛体在很大程度上依赖于宿主细胞内蛋白质和脂质作为能源(23]。除了脂蛋白分数变化的分析,我们研究分析的因素,调节标签和高密度脂蛋白水平。这些额外的因素包括脂蛋白脂肪酶(LPL)水解标签从TAG-rich脂蛋白颗粒在等离子体24)和减少TAG-rich人工乳液的吸收25)、载脂蛋白E (apoE)受体介导脂蛋白颗粒的绑定在肝脏,调节他们的间隙26,过氧物酶体proliferator-activated受体α(PPARα),参与脂类代谢,包括角色在氧化途径,脂肪酸的吸收和运输,和脂蛋白的合成路线27]。因此,我们关注LPL、载脂蛋白e和PPARα基因多态性的遗传风险的候选人标记疾病发展l . infantum感染。LPL基因多态性是搜索使用HindIII和PVuII限制性内切酶被揭示突变基因与标记水平变化和前还与高密度脂蛋白水平的变化(28,29日]。我们发现H + / H +基因型和H +等位基因,并确定使用HindIII限制LPL基因,更频繁的在感染症状的个人,特别是与高水平的VLDL-C,标签,和高密度脂蛋白胆固醇。apoE基因提出了三个主要的亚型(apoE2、apoE3 apoE4)编码的三种常见等位基因(E2、E3和E4) [26]。我们发现E3的E3 / E3基因型和等位基因被更频繁的感染比未感染个体感染无症状或症状的人,和这些因素与高水平的VLDL胆固醇和标签。我们发现低浓缩铀/ Val Val等位基因的基因型和PPARαL162V多态性的基因更频繁的感染症状的个体比无症状感染或未感染的个体,而是与改变脂蛋白水平无明显联系。

我们假设某些脂质分数可能的发展中发挥作用l . infantum感染。在这项研究中,我们发现高水平的甘油三酯和VLDL和低水平的高密度脂蛋白活动性疾病的发展。因此,我们建议相关的脂蛋白脂肪酶和载脂蛋白E基因型,导致这些脂蛋白水平以及改变的存在PPARαL162V等位基因可能是易感因素和重要发展的标志。

2。材料和方法

2.1。研究设计和主题

人包括在这项研究来自特雷西纳,Piaui州,巴西东北部。入选标准如下:无关个体呈现活跃六世(称为感染症状),健康的人被感染l . infantum由积极的反利什曼虫(黑山)dth皮肤试验和/或反的存在利什曼虫抗体(称为无症状感染),和健康的人没有现在或以前感染的证据l . infantum由消极的黑山皮肤试验和缺乏特定的抗体。本研究的主题和材料是类似于前面的阿隆索等人的研究。30.]在哪个种族和环境偏差进行了分析,认为不混杂因素。

2.2。道德声明

本研究通过参与机构的伦理委员会(Comissao de Etica em尽管达大学联邦Piaui和Comissao Etica para中de Projetos德尽管da Diretoria我们做医院das丹尼e da Faculdade药物da圣保罗)。书面知情同意了所有的参与者或他们的父母或监护人。另外,样品和数据匿名处理。

2.3。生化参数分析

后12小时禁食,静脉血样来自81人来衡量脂质参数。总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白),高密度脂蛋白胆固醇,并使用自动标记浓度测量方法(罗氏诊断公司,印第安纳波利斯,美国),和VLDL-C浓度计算(标记浓度/ 5)使用Friedewald方程。

2.4。LPL多态性的遗传分析

DNA提取外周血白细胞使用GFX血液基因组DNA净化设备(美国通用电气医疗集团,皮斯卡塔韦,新泽西),通过聚合酶链反应(PCR)扩增DNA热循环使用Bio-Rad实验室(美国大力神,CA)。

变化被证实使用限制片段长度多态性(RFLP)分析的扩增产品156年被HindIII消化菌进行个人或由PvuII为130人。由于可用性,并不是所有的样本进行了分析使用的酶。一组引物被用来放大HindIII限制站点周围的序列在基因内区8(正向引物5′-TTTAGGCCTGAAGTTTCCAC-3′,和反向引物5′-CTCCCTAGAACAGAAGATC-3′) (31日]。放大的片段是1.3 kb大小。另一组引物是获得的DNA序列在PvuII限制站点在基因内区6(正向引物5′-TAGAGGTTGAGGCACCTGTGC-3′,和反向引物5′-GTGGGTGAATCACCTGAGGTC-3′) (32]。放大的片段长858个基点。放大的区域,在HindIII站点进行33周期在95°C, 1分钟,2分钟60°C, 72°C 2分钟。序列的扩增,包围了PvuII网站进行了32个周期在95°C, 1分钟,2分钟68°C, 72°C 2分钟。HindIII或PvuII扩增产品菌进行消化。HindIII产生碎片,是600个基点和700个基点,和PvuII产生碎片,266个基点和592个基点(28]。

2.5。载脂蛋白e多态性的遗传分析

使用中提取DNA,经变化的单核苷酸多态性(SNP)检测扩增产品进行了分析使用快照菌进行多路复用设备(美国应用生物系统公司,培育城市,CA) 115人。我们使用一套引物,来自apoE基因外显子4,和PCR用于放大地区244个基点,E2、E3和E4等位网站(正向引物5′-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3′,和反向引物5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3′) (26]。放大的apoE网站进行初始变性在95°C 2分钟,这是紧随其后的是35周期在95°C 1分钟,1分钟60°C, 72°C 30年代。快照多路复用工具是用来调查的E2, E3, E4等位基因在放大产品。apoE snp是利用两个特定引物(正向引物5′-GCGCGGACATGGAGGACGTG-3′,和反向引物5′-CCCCCGGCCTGGTACACTGCCAGGC-3′)。快照多路复用设备反应进行ABI 377自动测序仪(应用生物系统公司)遵循制造商的建议。

2.6。的pcr PPARαL162V多态性

使用中提取DNA, PPARαL162V基因多态性等位基因分型的歧视使用TaqMan探测器基于定制assay-on-demand应用生物系统公司。一对是专门设计的放大的寡核苷酸片段包含不同allele-specific L162V SNP一起使用PCR荧光探针。使用实时PCR进行PCR反应(StepOnePlus应用生物系统公司)按照下列协议:10μL反应,5μL Maxima探针/火箭qPCR大师混合(2 x) 0.5 (Fermentas)混合μL TaqMan试剂(20 x大师混合含有探针和条寡核苷酸)和4.5μL(热压处理过的Milli-Q水。循环后的反应是执行协议,初始变性10分钟在95°C,紧随其后的是40变性的周期为15秒95°C,退火和延伸60年代60°C。骑自行车后,生成图表的等位基因歧视。

2.7。统计分析

均值和标准差的数据被表示为使用方差分析测试和比较。学生Newman-Keuls期末测验用于事后统计各组之间比较,和以及用于统计对比组。基因型和等位基因的分布频率和比较每个站点多态被基因数估计。一致性与哈迪温伯格比例。测试了对数似然比我们使用了皮尔森测试趋势分析LPL基因型和等位基因频率的差异结果组之间(感染症状,无症状感染和未感染)。脂质水平之间的联系和不同基因型和患者结果表示为优势比(或)和各自的95%置信区间(95% CI),调整年龄和性别,估计通过精确的逻辑回归模型。模型比较了感染(有症状和无症状)个人未感染的个体。脂质分析既是连续的水平和二分变量。二分分析,截止点用于TC、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白胆固醇,标签,和VLDL-C建立了通过选择ROC曲线的最大化的敏感性和特异性分离未感染和感染症状的人。数据分析使用占据统计软件(Windows 13.0占据,StataCorp,大学城,TX), Systat版本10(点里士满,里士满,CA)和3.0 GraphPad棱镜(GraphPad软件公司,圣地亚哥、钙、美国)。一个值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

在这项研究中,使用一个候选基因的方法来揭示遗传性状和由此产生的表型表达,也就是说,脂蛋白的水平,我们旨在识别标记的发展风险l . infantum感染。

脂质分数水平的评估显示升高三酰甘油(标签)水平和极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)水平升高在所有的感染症状的个体相比,无症状感染和未感染的个体()(表1)(根据血脂异常[III巴西指南33标签),最优水平是< 130 mg / dL个人20岁和< 150 mg / dL人年龄超过20岁)。因为理想与地方病控制这种方法不能得到由于技术和伦理原因,平均年龄(平均值±标准偏差)的感染症状个人(;岁)的平均年龄明显低于无症状感染(;岁)和未感染的个体(;岁)。规避的偏见,我们分别研究了20岁以下的人当组之间的差异仍然保持(数据未显示)。另外,我们观察到高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c)水平降低受感染的症状和无症状的个体比未感染个人()(表1)。

我们分析了LPL的多态性,载脂蛋白e, PPARα基因。所有的多态性的基因型分布在哈迪温伯格平衡(表的所有组2)。显著差异观察频率的多态HindIII-restricted基因型(H + / H +和H + / H−;H + / H +和H−−/小时,)和HindIII-restricted等位基因(H +对H−)(表1)。然而,未发现差异之间的团体根据基因或等位基因的频率(表PvuII限制的产品2)。apoE基因,分析三种常见的载脂蛋白e等位基因(E2、E3和E4)代码的三个主要的载脂蛋白e亚型(apoE2、apoE3 apoE4)表明,E3 / E3基因型是最常见,其次是E3和E4, E2和E3, E2 / E4, E4 / E4基因型。E2 / E2基因型中没有检测到任何个人。apoE等位基因的分析,E3等位基因是最常见,其次是E4和E2等位基因。之间的显著差异观察E4等位基因的频率和E3的等位基因()(表2)。我们发现E3的E3 / E3基因型和等位基因被更频繁的感染症状的个体比无症状感染和未感染个体(表2)。L162V PPARα基因多态性,我们发现显著差异的频率低浓缩铀/低浓缩铀和亮氨酸/瓦尔()基因型和低浓缩铀Val等位基因((表)之间的组2)。

之间的关联分析的基因型和脂蛋白水平在所有的人不管结果如何,标签和VLDL-C水平明显高于H + / H +个人()(表3)。H + / H +的个体基因型高密度脂蛋白胆固醇水平明显低于H + / H−的个体基因型()。血脂水平测定在只有两个H−−/ H个人,这是统计分析的不足(意味着在表的传说3)。在P1 / P1基因型的个体,在血脂水平没有显著差异之间观察到P1 / P2和P2 / P2个人(表3)。apoE基因型和等位基因的分析,我们发现标记和VLDL-C水平E2和E3的个体基因型明显高于在E3 / E3和E3 / E4 ()个人(表3)。中可用的血脂数据只有一个E4 / E4个人(所有的变量的传说表所示3)。血脂水平没有评估的E2 / E4和E2 / E2的个人。此外,标记和VLDL-C E2的个人水平明显高于在E3和E4个人(),但是TC水平高于E2和E3的个人E4个人()(表3)。E3等位基因与TC水平高于E2和E4等位基因;然而,仍然是最优水平33]。血脂水平没有与基因型或PPARαL162V多态性的等位基因的基因(表3)。

分析基因型和表型之间的关系表达式,结果,我们进行了一个多变量分析来计算调整后的优势比(或)因为年龄和性别分布显著差异的研究团体。这个分析的结果表明脂蛋白脂肪酶H +的存在/ H +基因型(调整或= 21.3;95%可信区间= 2.32 - -335.3;),PPARα列伊/ Val基因型(调整或= 8.77;95%可信区间= 1.41 - -78.7;)和高浓度的VLDL-C(调整或= 1.08;95%可信区间= 1.01 - -1.17;)和标签(调整或= 1.02;95%可信区间= 1.00 - -1.03;)与症状相关l . infantum感染。相比之下,HDL水平与症状呈负相关(调整或= 0.84;95%可信区间= 0.71 - -0.96;)和无症状(调整或= 0.92;95%可信区间= 0.84 - -0.99;)l . infantum感染(表4)。当脂蛋白水平进行了分析使用建立的截止值选择ROC曲线上的点,最大化的敏感性和特异性分离未感染和感染症状的个体,协会与有症状的感染变得更加明显的高浓度VLDL-C(截止值= 33毫克/分升;调整或= 18.8;95%可信区间= 1.71 - -1014.4;)和标签(截止值= 168毫克/分升;调整或= 18.8;95%可信区间= 1.71 - -1014.4;)。

4所示。讨论

发现可靠的标记评估个人和人口的疾病的风险开发是科学界的一个重大挑战。在这项研究中,我们评估潜在的重要发展的标志。地区流行的六世,大多数感染者发展保护性免疫反应。因此,我们关注多发地脂质元素作为一个潜在的敏感性因素的基础上,假设这些改变有利于六世病人可能寄生虫和疾病发展。我们进一步分析了某些基因的多态性,可能导致这些改变脂蛋白水平。

在大量重要的临床表现的患者,我们发现高标记水平,高VLDL-C水平和低高密度脂蛋白胆固醇水平感染症状个人之前报道的文献[19- - - - - -22]。LPL、载脂蛋白e和PPARα被称为脂质代谢的重要组成部分和体内平衡的角色不同脂蛋白分数及其运输,和这些基因的多态性与心血管疾病(28,29日,34- - - - - -36]。因此,这些基因多态性进行了分析。我们针对LPL、载脂蛋白e和PPARα基因多态性和等位基因分析与症状的关系l . infantum感染。重要的是,这些多态性与预期表型观察,不包括L162V PPARα基因多态性。这一发现与大多数研究基因多态性的产生的表型是不明的。研究人口的H + / H +基因型和H +等位基因与VLDL-C和标记水平升高有关()和高密度脂蛋白胆固醇水平降低()。apoE基因和等位基因,基因型和预期表型协会还不清楚,因为标签和VLDL-C水平显著高于个人的E2基因比E3和E4等位基因的人在E3等位基因而不是个人。这一发现可能是由于限制数量的样品和六apoE异型的不同的角色。然而,E2等位基因之间的关联和脂蛋白水平的改变可能没有被发现,因为apoE2携带VLDL胆固醇显著低于apoE4 [35],apoE2会损害VLDL的分解脂肪的转换通过抑制低密度脂蛋白LPL活性(34]。

H + / H +基因型之间的关系和较高的H +等位基因标记和较低的高密度脂蛋白胆固醇水平是在受感染的症状组比无症状感染组。PvuII与血清脂质变化有关的其他疾病(29日,36];然而,我们没有发现任何重要的之间的关联PvuII-restricted LPL基因型和活跃六世的存在或脂质部分的水平。这一发现强化了我们的建议,HindIII-restricted LPL基因型在这项研究中被识别风险标记为有症状的发展l . infantum感染。

在文献中,高标记和低高密度脂蛋白胆固醇水平被认为是参数的诊断和随访患者六世(37]。然而,除了一个研究表明低密度脂蛋白的作用发展的六世通过肿瘤坏死factor-α(TNF-α)生产22),我们的研究是第一次清楚地发现LPL基因型,导致高VLDL-C水平的表型,标记水平高和低高密度脂蛋白胆固醇水平是活跃的内脏利什曼病的一个危险因素。有趣的是,我们观察到高密度脂蛋白胆固醇(HDL - c)水平降低受感染的症状和无症状的个体与未感染的个体相比,这可能表明,降低HDL水平最初感染。当TG和VLDL水平增加,发展为有症状的感染可能发生。

VLDL和HDL的生物学作用利什曼虫感染需要进一步分析;然而,最初的方法一样,我们评估了脂蛋白分数在体外细胞感染的机制通过检查promastigotes由巨噬细胞的吞噬作用。我们观察到29%的巨噬细胞内寄生虫与VLDL孵化的6个小时(比文化没有增加脂蛋白)。高密度脂蛋白明显降低(37%)的coaddition寄生虫负担而VLDL ()。

的PPARαL162V多态性已经证明是一个危险的标志有症状感染;然而,变异的基因改变脂蛋白水平无关。在函数研究Val-mutated PPARα等位基因,这种突变的DNA结合域PPARα影响转录因子的功能,防止其适当的绑定到该地区在其DNA的转录控制(38]。这个突变等位基因的频率明显高于个体出现感染症状;因此,脂质代谢基因的低效的激活可能导致更高的血清脂质水平分数。然而,这项研究的结果并没有表明多态性与血脂之间的关系。这一发现的一个可能的解释是低了Val等位基因的个体的数量。这个变异等位基因是相对罕见的(10.8%的观测频率)和血脂水平的只有8人携带这种等位基因测定。因此,任何统计证据这种突变之间的关系和血脂水平不太可能。除了PPARα基因可以调节脂质通路,这可能不会反映在血脂水平,并间接影响的结果婴儿利什曼虫感染。此外,PPARαupregulation重要角色而闻名的胆固醇在巨噬细胞[走私和流出39]。有趣的是,在转录组研究利什曼虫来华的老鼠巨噬细胞、胆固醇积累显然是观察在宿主细胞中,这是通过基因的upregulation涉及的低密度脂蛋白(LDL受体CD36和)的差别,对这些基因的基因调节胆固醇流出(ABCA1和CYP27) (40,41]。在这个场景中,一个PPARα变异等位基因可能导致感染的调制提高胆固醇的积累在感染细胞和穿梭于胆固醇利什曼虫寄生虫。我们不能排除感染的调制PPARα函数在炎症过程39]。

这项研究的结果,那些来自两个先前的研究(30.,42]支持预设的基因型分子与适应性免疫系统,也就是说,LPL、PPARα,和mannan-binding凝集素(MBL)基因型有显著相关性l . infantum感染或疾病。值得注意的是,除了MBL在补充系统的角色43和自身免疫过程44),MBL的激活水平影响PPARα[45),导致LPL表达(46]。

更容易获得这些遗传标记和血脂水平可用于评估的风险l . infantum感染和疾病在流行地区,可用于跟踪与active-phase感染病人。此外,我们的研究结果表明,我们应该考虑研究降脂药物作为重要的辅助治疗的病人。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

玛西娅迪亚斯特谢拉卡瓦略和迭戈佩雷斯阿隆索和高级作者保罗爱德华多·马丁斯Ribolla和宏Goto,各自的平等参与这项研究。

确认

作者要感谢慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(h .转到格兰特154581/2006-2,研究奖学金),Fundacao de帕罗尽管做Estado de圣保罗(奖学金06/60006-9 M,迪亚斯特谢拉卡瓦略),和Laboratorio de Investigacao》(LIM / 38 HC-FMUSP)。他们也要感谢也好Sutti Nunes,玛丽亚das夫人Prianti, Leticia Amaral Nogueira阿隆索,黛博拉Colombi为实验室提供援助和所有参与者的同意为本研究作出贡献。此外,他们要感谢直接督导下的卡斯特罗的优秀统计援助和感激Laboratorio de脂质(LIM / 10 HC-FMUSP)的援助。