文摘

Paraoxonase 1 (PON1)活动明显受到编码多态性,Q / R在192位置和M / L 55 PON1基因的位置。我们调查的频率对PON1这些多态性及其影响和抗氧化活动在844年南非混合血统的人。基因分型是通过使用allele-specific TaqMan技术,PON1活性测定使用对氧磷和苯乙酸盐,氧化状态决定通过测量铁的抗氧化活动降低抗氧化能力和trolox等价的抗氧化能力,和脂质过氧化的标记包括丙二醛和氧化低密度脂蛋白。的频率Q192R L55M分别为47.6%和28.8%,分别和最常见的相应等位基因192 r(60.4%)和55米(82.6%)。的Q192明显与5.8个单位PON1浓度和增加15.4个单位的减少PONase活动后调整年龄、性别、体重指数、糖尿病,糖尿病状态微分效应的建议。的PON1L55变体与所有的测量指标。总之,我们已经表明,Q192R多态性是行列式PON1浓度和活动和本协会似乎与糖尿病受试者的增强。

1。介绍

Paraoxonase 1 (PON1)是一种钙依赖性的酯酶在人体肝脏内合成,并广泛分布在组织包括肝、肾、肠、和血清,它与高密度脂蛋白(HDL)同事。人类的这种酶具有双重生理功能。首先,它催化分解各种有毒的有机磷杀虫剂和神经毒气(OP),包括对氧磷、diazoxon,萨林,索曼(1,2),这是很强的乙酰胆碱酯酶抑制剂(疼痛)。其次,PON1越来越承认作为一个atheroprotective酶由于其在体外能抑制氧化修饰的低密度脂蛋白(3),高密度脂蛋白(4),巨噬细胞(5),动脉粥样硬化病变(6,增加从巨噬细胞胆固醇流出7]。此外,PON1降低炎症反应破坏生物活性脂质在动脉壁温和氧化低密度脂蛋白(8),损害单核细胞分化的巨噬细胞(9,减少单核细胞趋化性和附着力内皮细胞(10]。减少PON1活动已报告与加速动脉粥样化形成疾病包括糖尿病和家族性高胆固醇血症11- - - - - -13]。

酶的活性明显受到多态性在编码和PON1基因的启动子区域。编码多态性在Q / R位置192和M / L位置55导致同功酶的活动有很大程度的不同对不同基质(2,14,15]。水解R对碘氧基苯甲醚对氧磷速度比问同种型,而diazoxon索曼,萨林水解以更高的利率(Q比R对碘氧基苯甲醚2]。相比之下,R同种型水解脂质过氧化物的效果比[Q对碘氧基苯甲醚2]。M和L等位基因相关较低和较高的血清PON1浓度,分别为(16]。Q192R和L55M多态性的分布广泛的全球变化。例如,的频率PON1在白种人Q192等位基因频率高(0.70)17,18),但要低得多的频率在墨西哥人(0.48)19和非裔美国人(0.34)18]。的PON1L55等位基因主导在几乎所有人口但差异仍然存在,例如,台湾之间(0.97)20.],加蓬(0.695)[21)、土耳其(0.39)22,伊朗人(0.59)23]。

本研究进行调查的频率PON1Q192R和L55M多态性及其可能的关系PON1活性和氧化状态指数(铁降低抗氧化能力,trolox等价的抗氧化能力,丙二醛,和氧化低密度脂蛋白)。在此,我们研究了混合血统人口从南非已经被证明有2型糖尿病的患病率最高的国家之一,在南非和非洲撒哈拉沙漠以南地区(24]。

2。材料和方法

2.1。研究背景和人口

研究包括调查设计和过程的细节描述了其他地方(24,25]。的成员参与一项队列研究在混合血统乡(Bellville南),坐落在开普敦北部郊区,南非西开普省。南非的混合血统人口,有时被称为“有色”,是混合遗传起源来自欧洲,南亚人,印尼人,人口基因接近isiXhosa撒哈拉以南的班图(26]。这项研究是研究Stellenbosch大学的伦理委员会批准的(参考号:N10/04/118)和开普半岛科技大学(CPUT / HW-REC 2010 / H017)和是根据世界医学协会道德规范(赫尔辛基宣言》)。所有参与者签署书面知情同意后,所有的程序都充分解释他们所选择的语言。所有的参与者收到了标准化面试和体检期间血压测量根据世界卫生组织(世卫组织)指南(27)使用半自动的数字血压计(美国Rossmax PA)坐姿的右臂。人体测量数据进行三次,他们的平均用于分析:体重(公斤),身高(厘米),和腰部(cm)和臀部周长(厘米)。医生诊断出糖尿病的参与者没有历史经历了75 g口服葡萄糖耐量试验(OGTT)作为推荐的(28]。进一步,以下生化参数确定6000年Cobas临床化学仪器(罗氏诊断、德国):空腹血浆葡萄糖、胰岛素、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c)、甘油三酯(TG)、c反应蛋白(CRP),γ谷氨酰转移酶(GGT)和糖化血红蛋白(HbA1c)经国家Glycohaemoglobin标准化规划(NGSP)。低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白)是使用Friedewald的公式来计算的29日]。血清可替宁是衡量化学发光测定(Immulite 1000年,西门子)。

2.2。总抗氧化能力

血浆样品的总抗氧化能力是评估使用铁降低抗氧化能力(收紧)和trolox等效抗氧化能力分析(问题)。收紧了根据Benzie和应变的方法30.]。短暂,血浆样本与收紧试剂混合,孵化为30分钟37°C,和593海里的吸光度被记录使用分光光度计(Spectramax plus384分子设备,美国)。问题分析是根据再保险et al。31日)和基于监测(734海里)的氧化2,2′-azinobis——(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic酸)激进(abt)阳离子形成的反应abt和过硫酸钾。蒸馏水是abt代替PBS稀释⁺激进的解决方案。

2.3。Paraoxonase活动

Paraoxonase (PONase)和芳香酯(AREase)活动测量使用对氧磷和苯乙酸盐(西格玛奥德里奇,SA)为底物,分别。PONase活动用的方法测量级和弗隆(32)的初始速度p-nitrophenol生产37°C和吸光度的增加在405 nm监控在分光光度计(Spectramax plus384、分子器件、美国)。每个血清样本孵化5更易/ L毒扁豆碱(西格玛奥德里奇,SA)在室温下15分钟,血清胆碱酯酶抑制通常升高糖尿病和否则干涉的决心paraoxonase活动从糖尿病人血清。1 U / L PON-1活动被定义为1μ每分钟的摩尔p-nitrophenol水解。稍微修改了布朗的方法等。33)是用来测量AREase活动。工作试剂由20更易与L Tris-HCl 4更易与L苯乙酸,更易与L CaCl pH值8.0,1.0₂(西格玛奥德里奇,SA)。反应是由增加5μL(40倍tris-diluted样本为345μL工作试剂的25°C。吸光度的变化在270 nm记录后60分钟20秒的延迟时间Spectramax plus384分光光度计。表示为骨/ L,活动是基于摩尔吸光系数(1310)苯酚在270 nm。在这两种分析,利率用于生成数据点来自速度与时间的线性部分的情节。

2.4。脂质过氧化作用

血浆MDA和ox-LDL被用作标记的脂质过氧化(法律流程外包)。延奇的方法等。34)被用来估计硫代巴比土酸活性物质(TBARS),反映了MDA的生产。等离子体ox-LDLs测量使用定量夹心酶联免疫试剂盒(Cellbiolabs,圣地亚哥,加利福尼亚州)。

2.5。基因分型

DNA是采用盐析法从全血中提取的米勒et al。35]。传统的聚合酶链反应(PCR)其次是直接进行DNA测序检测野生型、杂合的,和纯合基因型PON1单核苷酸多态性(snp),Q192R(rs662 > G)L55M(rs854560 T >)。这些内部控制样本随后被用于分析验证执行的高通量基因分型从研究对象中提取DNA样本,使用应用生物系统公司(ABI)Taq男人SNP基因分型检测7900年ABI棱镜ht平台(美国应用生物系统公司)。

2.6。定义

身体质量指数(BMI)计算每平方米重量(公斤/米²)和waist-hip-ratio (WHR)腰/臀周长(厘米)。2型糖尿病是基于doctor-diagnosis的历史地位,空腹血浆葡萄糖≥7.0更易/ L,和/或2小时post-OGTT血浆葡萄糖≥11.1更易/ L。稳态模型评估胰岛素抵抗(HOMA-IR)按照下列公式计算:HOMA-IR =[空腹胰岛素浓度(个人/ L)×空腹血浆葡萄糖(更易/ L)] / 22.5;虽然功能β肽(HOMA-B %)估计使用公式:20×空腹胰岛素(μ国际单位/毫升)/空腹血糖(更易/毫升)−3.5。定量检查胰岛素敏感性指数(QUICKI) 1 /(日志(空腹胰岛素(μU /毫升)×日志(空腹血糖(mg / dL)))。

2.7。统计方法

946名参与者参加的调查显示,941答应了遗传研究。在后者中,103被排斥在基因缺失的数据变量。氧化状态概要文件在491年被评估对象,但121也被排除的失踪同意或完全匹配的生化和基因数据。因此,844年至370年期间,受试者有效数据整体遗传和genetic-oxidative应力分析,分别。一般特征的研究参与者为二分特征概括为计数和百分比,平均值和标准偏差(SD),或中位数和25 th - 75百分比量化特征。特征是对数转换近似常态,在必要时,之前的分析。snp进行偏离哈迪温伯格平衡(HWE)期望通过卡方拟合优度检验。连锁不平衡(LD)估计使用统计。x平方分布的方差分析(方差分析)和克鲁斯卡尔沃利斯测试被用来比较基线特征在等位基因的分布。单核苷酸多态性之间的交互是通过强有力的线性回归模型,评估假设添加剂模型snp。结果对应值低于5%被描述为显著。我们没有调整为多个测试。所有分析使用统计软件包R(3.0.0版本04-03,R统计计算的基础,维也纳,奥地利)。

3所示。结果

3.1。PON1多态性的分布

的844例(男性208人,24.6%)238(28.2%)患有糖尿病,高血压478(56.6%),平均年龄为56.6岁(15.5)年。L55M和Q192R多态性基因型和等位基因频率在整个队列以及跨性别和糖尿病状态表进行了总结1。的频率Q192R L55M分别为47.6%和28.8%,分别和最常见的相应等位基因192 r(60.4%)和55米(82.6%)。频率对多态性主要子组没有差异,除了Q192R基因型不同显著据糖尿病状态()。观察和期望频率多态性在哈迪温伯格平衡整体和内部主要的子组(所有)。两个多态性之间的联系是温和的整体样本(= 0.470,),但相对较弱的男性(= 0.199,),女性(= 0.290,),在参与者(= 0.219,)或非糖尿病(= 0.283,)。

3.2。基线资料整体和整个PON1基因型

基线特征的分布并不是各种PON1内不同基因型对年龄、性别、肥胖、血脂高血压患病率和胰岛素抵抗(表2)。然而,这并非如此流行的糖尿病()和收缩压水平()Q192R多态性和空腹血糖(),2小时血糖()和糖化血红蛋白(在L55M多态性(表)2)。

3.3。PON1在基因型和氧化状态概要文件

表3显示了PON1的指数分布在基因型和抗氧化活动。PON1 (),PONase (),Ox-LDL (),TBARS (),在某种程度上问题()有显著不同的基因型的PON1 Q192R多态性,而空腹血糖(),2小时血糖()和糖化血红蛋白()不同跨PON1 L55M基因型。

表4显示了强劲的线性回归分析的结果的预测两PON1 PON1和抗氧化状态指标的变异。的PON1 Q192多态性与PON1浓度显著相关,PONase活动导致单位增加6.8和减少18.3,分别。协会仍然显著模型时,将逐步扩大到包括年龄,性别,体重指数,和糖尿病,只有适度的衰减的影响大小。然而,当糖尿病和Q192的交互项添加到多变量模型,多态性的主要作用仍然显著的预测PONase却大幅减毒PON1浓度与临界协会(,)。此外,交互项糖尿病的效果^*有显著的预测Q192 PON1浓度(交互),但不是PONase,表明变异的影响在PON1浓度在患有糖尿病的参与者(表更重要4)。单独或与其他协变量模型,该PON1 L55没有明显与任何相关测量指标。然而,这是一个重要的建议糖尿病状态的交互效应PON1 L55 ox-LDL水平(交互积极影响的),建议ox-LDL水平与糖尿病和参与者消极的或没有影响不患糖尿病的参与者(,)的主要影响变量在多变量模型中包含的交互项基因^*糖尿病。多态性只有模型(有或没有他们的交互项),变异的影响PON1浓度和PONase依然显著PON1 Q192和无意义的PON1 L55。影响其他分析物与总是没有证据表明Q192保持不变^*L55多态交互(表4)。

4所示。讨论

Paraoxonase 1多态性Q192R L55M已报告解释90%以上的总表型方差PON1活性使用几种基质酶(36]。在这项研究中,我们使用的影响对氧磷和乙酸苯酯基质描述Q192R和L55M PON1多态性PON1浓度和酶活性在混合血统人口来自南非。只有Q192R似乎功能在这个人口PON1浓度和paraoxonase相关活动。我们发现存在Q192减少15.4 U / L和5.8μg / mL PON1活性和浓度在考虑了年龄的影响,性别、体重指数和糖尿病。有迹象表明,变异的影响PON1浓度在患有糖尿病的参与者更重要。同时,我们报告PON1 QQ192有关氧化应激的标记(ox-LDL和TBARS)和总抗氧化剂(问题)只有在cross-genotype比较,而不是线性回归(不论级别的调整),可能暗示没有关系的情况下,协会的非线性,或log-additive模型近似的不足这样一个协会。

PON1活性可以测量使用不同基质和报告表明,PON1多态性的影响取决于所使用的衬底(2,14,15]。三个常用的基质(对氧磷、苯乙酸和dihydrocoumarin), PON1最明显的基因型效应对氧磷(36]。先前的研究R等位基因与动脉粥样硬化性心脏病的发病率更高的风险和/或在各种人群如印第安人37),日本(38)和荷兰(39]。另一方面,Bhattacharyya et al。40)对1399名患者进行了前瞻性研究和报告更高的血清PON1活性水平,降低系统性系统性氧化应激的指标,相应减少冠状动脉疾病流行和潜在心脏事件192年PON1 rr运营商。同样的,本研究的结果似乎表明减少动脉粥样硬化风险主题PON1 192 r存在以来PON1 Q192能显著减少PON1活性进而与心血管疾病的发展有关41,42]。此外,PON1 QQ192基因型与增加PON1浓度特别是在患有糖尿病的受试者。我们的结果或许可以解释为不同基因型的影响HDL-bound PON1自PON1必须绑定到高密度脂蛋白履行antiatherosclerosis函数(4]。的Q192 alloenzyme与高密度脂蛋白粒子结合亲和力低三倍比R192 alloenzyme [43),但HDL-bound QQ192 PON1已被证明是更有效地保护低密度脂蛋白的氧化(2,44]。此外,它已被证明,增加HDL-bound PON1内容不会改变高密度脂蛋白组成或性质但保护它免受脂质过氧化(4]。综上所述,我们的研究结果表明,R基因增加PON1活性也表明,PON1 QQ192可能与氧化应激增加重要的个体如糖尿病,尽管它会抑制酶的活性。然而,我们的研究结果需要在前瞻性研究证实了一个更大的样本量。

在我们的研究中我们也显示PON1 55米的优势在这个人口(82.6%),一个不同寻常的发现报道在只有一个研究在低得多的比例(61%)22]。的PON1 L55 PON1一直与PON1活性增加有关(45];然而,这不是明显的在这个研究。然而值得注意的是,指数分布的血糖控制(光纤光栅、2小时血糖和糖化血红蛋白)在L55M显著不同基因型可能表明一个协会与血糖控制较差,因此glycation-enhanced氧化应激。虽然我们有一个健壮的线性回归研究相对较大的人口数量的基础上预测评估在目前的研究中,很可能一些基因型的低频率(PON1特别是L55M)影响了我们发现一些重要的关联。然而,我们的研究也有很大的优势。与许多现有的研究,除了PON1多态性,我们测量PON1蛋白质含量和活动两种方法和评估氧化状态通过几种方法来演示我们的结果的一致性。

总之,我们已经表明,Q192R多态性是PON1浓度和活动的决定因素。这种联系似乎与糖尿病受试者的增强,因此建议需要调整未来潜在的基因混杂PON1研究涉及糖尿病受试者。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢Bellville南社区开普敦,南非。这项研究是大学研究基金会赠款支持开普半岛科技大学,南非,南非医学研究理事会。