文摘

慢性牙周炎(CP)是一种炎症性疾病的teeth-supporting组织遗传倾向,牙菌斑的细菌和免疫机制都发挥着重要作用。本研究的目的是评估的发生在慢性牙周炎和il - 4基因多态性研究多态性之间的关系和细菌刺激后细胞因子的生产。六十二例(47 CP患者和健康对照组15日)与两个多态性检测il - 4基因(-590 c / T基因内区3 VNTR)检查。细胞因子(il - 1的生产α,il - 1β、il - 4、IL-5、il - 6、il - 10 IL-17, TNFα,正γ和VEGF)进行了研究在体外有丝分裂原刺激分离外周血(商陆促分裂原,伴刀豆球蛋白A),牙菌斑细菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella连翘,Porphyromonas gingivalis,普氏菌媒介物),热休克蛋白(HSP) 70 Luminex多路复用细胞因子分析系统。结果与il - 4基因型在CP患者和健康对照组。单核细胞与选择的CP患者外周血il - 4多态性显著改变干扰素的生产γ、il - 10、il - 1β,il - 1α,肿瘤坏死因子α刺激后,il - 6 HSP 70或选择(从细菌来)。il - 4基因多态性可能影响单核细胞产生的功能不仅interleukin-4还其他细胞因子,特别是在CP患者。

1。介绍

慢性牙周炎(CP)是一种炎症性疾病的teeth-supporting组织遗传倾向,牙菌斑的细菌和免疫机制都发挥着重要作用。细菌参与CP的发病机制包括Porphyromonas gingivalis,普氏菌Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella连翘,中间物,和梭菌属nucleatum。这些细菌参与CP的发病机制与增加血清的特定抗体水平(1]。怀疑病原体分离出牙菌斑不断刺激牙周组织细胞产生细胞因子等生物活性分子。免疫反应的发展和监管依赖于当地的生产和大量的细胞因子和其他介质影响疾病进展或决议。疾病进展取决于产量的增加促炎细胞因子(il - 1α,il - 1β、il - 6、引发和肿瘤坏死因子α)、金属蛋白酶和前列腺素或减少生产的抗炎细胞因子(il - 10, TGFβ)和金属蛋白酶抑制剂(2]。

根据不同的功能的概念TH1、TH2淋巴细胞(3),西摩et al。4)提出了假设,进步CP患者,克隆的TH2生成激活与细菌,同时,在nonprogressing疾病,稳定的病变是由TH1克隆。我们在以前的纵向研究证实这些结果,我们紧随其后,一段十年,早发性牙周炎患者(bgi,现在被称为积极的牙周炎)与牙周组织的变化诊断17到25岁之间的。这类病人反复表现出增加il - 4的生产(TH2)刺激后外周血淋巴细胞与牙菌斑细菌而健康的兄弟姐妹和其他无关的基因控制和完整的牙周组织产生了显著增加干扰素水平γ(TH1) [5]。如前所述,牙周疾病的发病和进展都强烈受个体的遗传易感性的影响。疾病的遗传变化从近100%份额“孟德尔/ syndromological”形式的国家较低比例的遗传和高环境因素的影响。Rateitschak et al。6早发性牙周炎]描述了遗传倾向;根据Michalowicz [7),基因是负责50%以上的慢性牙周炎的风险。1990年代见证了遗传分析的开始阶段的所谓的“候选人”基因,也就是说,基因是编码促炎细胞因子,趋化因子,金属蛋白酶,与生产相关的其他因素这些介质及其假定作用在疾病的发病机理8,9]。方法论的选项是现在时代的发展现状的全基因组研究[10]。在某些等位基因多态性与易感性相关的细胞因子被广泛的感染或免疫疾病,包括牙周炎(11- - - - - -16和其他人。人类interleukin-4映射(il - 4)基因在细胞因子基因簇5号染色体上q31-33包含几个多态性;其中一些涉及il - 4的规定生产。最近,这些多态性吸引了广泛的关注,尤其是il - 4基因启动子-590 c / T多态性(rs2243250)和一个70个基点变量数量的串联重复序列多态性(VNTR)在其第三个内含子。建议增加响应的-590 c / T等位基因(70碱基对(bp)) 2重复等位基因转录的激活可能会导致过度的il - 4 (17]。

然而,这些细胞因子基因多态性的角色在细胞因子的生产在应对由牙菌斑细菌刺激牙周疾病尚未研究。本研究的目的是评估的影响il - 4 (-590 c / T)和il - 4 VNTR(数量可变串联重复基因内区3基因多态性在细胞因子刺激后生产分离外周血单核细胞由牙菌斑细菌,有丝分裂原,HSP70在牙周炎患者和健康对照组。

2。材料和方法

2.1。研究人群

所有慢性牙周炎患者(CP、)招募的病人池牙周病学部门,口腔诊所,圣安妮的教员医院布尔诺,从2010年到2012年。入选标准是一般的健康有益,广义的诊断慢性牙周炎根据国际研讨会慢性牙周炎的牙周疾病分类(18),和协议样本收集基因/免疫学检查。排除标准包括心血管疾病史(如冠状动脉疾病和高血压的患者)、糖尿病、恶性疾病,免疫缺陷,目前怀孕或哺乳期,吸烟。对照组(健康/ nonperiodontitis主题,)随机选择同期病人和匹配了年龄,性别,和不吸烟的状态。所有控件至少有20个剩余的牙齿,一般健康,同意基因/免疫学检查。排除标准是一样的应用与牙周炎患者。

nonperiodontitis /牙周炎的诊断是基于详细的临床检查,医疗和牙科历史,牙齿移动,和影像学评估。探测深度(PD)和临床附着丧失(CAL)收集UNC-15牙周探针从六个网站在每个牙齿。所有的病人必须至少有三个探测(BOP)牙齿出血,PD > 4毫米,和卡尔≥3毫米的象限(不含第三臼齿);然而,他们治疗疾病的病人没有活跃阶段。牙槽骨的丧失决心放射学。我们使用了Muhlemann指数来评估减少牙槽骨水平(19]。对照组(健康的牙周膜)由受试者没有历史或牙龈炎或牙周炎的临床症状(没有> 4毫米的产后抑郁症,周围没有损失的临床依恋任何牙齿,没有射线骨吸收的迹象)。

研究伦理委员会的同意了医学院,马萨里克大学布尔诺和圣安妮的教员医院。书面知情同意从所有参与者获得符合赫尔辛基宣言之前加入这项研究。

2.2。基因组DNA的隔离

DNA遗传分析是提取外周血白细胞(5毫升)使用标准的苯酚/氯仿与蛋白酶K程序根据Sambrook et al。20.]。

2.3。基因分析

基因库中加入数字是AF395008用于il - 4的参考基因组序列比对。il - 4的SNP在位置-590 c / T多态性(rs2243250)被PCR-RFLP基因分型分析根据以前公布的方法(21)与轻微的修改。DNA扩增与以下引物:[5′法gg有条件现金援助CAC CTG ATA CG-3′(感觉),5′gg TGT CGA TTT GCA GTG AC-3′(反义)]作为一个产品646个基点的长度。PCR是一卷15μ包含50 L ng的基因组DNA, 0.3μ每个引物的米,0.5 U (DNA聚合酶(Biotools领头军的实验室。马德里,西班牙),MgCl 5毫米₂,10倍反应缓冲MgCl₂免费(Biotools领头军的实验室。,Madrid, Spain), and 0.5 mM of deoxyribonucleoside triphosphate mix (Roche, Basel, Switzerland). Denaturation for 5 min at 95°C was followed by 35 cycles of 95°C for 45 s, 56°C for 45 s, and 72°C for 1 min. The last synthesis step was extended to 10 min at 72°C. The PCR products were then digested with BsmFI restriction enzyme and separated on 3% agarose gel. The restriction was performed in a volume of 12 μL包含7μL的PCR产物,10 x NeBuffer 4, 4 U BsmFI酶(新英格兰生物学实验室,哈特金,英国)和孵化4小时65°C。基因型被描述为CC (601 + 45 bp), CT (646 + 601 + 45 bp)和TT(646个基点)。

VNTR多态性(il - 4 70 - bp重复)il - 4基因的内含子3被改良的PCR检测方法所描述的城市等。22]。DNA是放大与以下引物:[5′标签GCT棉酚gg GGG AAA GC-3′(感觉),5′ctg TTC ACC柠檬酸法GCT CC-3′(反义)]。PCR是一卷15μL包含100 ng的基因组DNA, 0.3μ每个引物的米,0.5 U (DNA聚合酶(Biotools S.A.的领头军实验室马德里,西班牙),MgCl 3.5毫米₂,10倍反应缓冲MgCl₂免费(Biotools S.A.的领头军实验室,Madrid, Spain), and 0.5 mM of deoxyribonucleoside triphosphate mix (Roche, Basel, Switzerland). Denaturation for 5 min at 95°C was followed by 35 cycles of 95°C for 45 s, 56°C for 45 s, and 72°C for 1 min. The last synthesis step was extended to 10 min at 72°C. Amplified products were separated on 2% agarose gel; the size of the product corresponds to the number of the repeats present (allele 1 = 3 repeats (254 bp); allele 2 = 2 repeats (184 bp)). The rarely occurring allele type 3 with only a single repeat (114 bp) was not present in our set.

基因分型是由p . b . l .知道表型。DNA样本与已知基因型,确定这些样品的测序在前面研究大声叫et al。14),被用作积极控制对多态性。

2.4。种植牙菌斑的细菌

sulcular流体样本细菌的培养(a . actinomycetemcomitans p . gingivalis t .连翘和p .媒介物)收集网站的牙周膜与牙周组织的影响最严重的地区。一卷50μL 2毫升的样品稀释大脑心脏介质表面接种微生物诊断媒体在培养皿。选择性培养的细菌进行根据槽的方法(23在37°C) TSBV琼脂孵化有限公司10%₂气氛由GasPak有限公司₂袋(Oxoid)细菌在厌氧罐。殖民地后5到7天,包含10个细菌悬液¹⁰细胞在120°C / mL被孵化灭活了20分钟。样品在600 g离心10分钟。沉积物与PBS稀释和离心10分钟600 g,然后洗3次。沉积物被X-Vivo稀释清洗介质光学密度对应于10¹⁰细胞/毫升。

2.5。免疫学检查

20毫升的外周血收集受试者在检查中BD真空采血管与肝素钠抗凝(BD,普利茅斯,英国)。外周血单核细胞(PBMC)被孤立的从血液肝素化Histopaque 1.077(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)梯度离心法在600 g为30分钟。白层包含单核细胞的间期与X-vivo收集和清洗介质在400 g和200 g,然后用X-vivo稀释血清组织媒介(Cambrex) 10的浓度⁷细胞/毫升。100年μL细胞培养3天在37°C的5%股份₂与100年大气和刺激μL的细菌浓度的10⁹/毫升(a . actinomycetemcomitans p . gingivalis t .连翘和p .媒介物),HSP 70(σ,5μg / mL)、商陆促分裂原(PWM,σ,2.5μg / mL),商陆促分裂原聚集有关伴刀豆球蛋白(PWM,σ,2.5μ10 g / mL + ConA,σ,μ10 g / mL)和补充X-vivo中长期l毫升(表2)。栽培的3天之后,中收集和储存在−20°C细胞因子(il - 1的决心α,il - 1β、il - 4、IL-5、il - 6、il - 10 IL-17,干扰素γ,肿瘤坏死因子αLuminex多路复用和VEGF)的方法(Luminex 100 tm分析仪,研发系统,美国)。细胞因子的生产主体与il - 4的不同基因型多态性进行比较。

2.6。统计分析

(统计上显著的结果,,)所示表3(一)和3(b)表示中位数为二分变量,分别对牙周炎患者(健康对照组)和()。计算进行SPSS(17.0版)。

产生细胞因子的差异在两组患者(牙周炎和控制)结合研究il - 4多态性进行了初步分析由多个利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验(24)与两个相邻等位基因与少数表示样本人群总是扎成一个(见表3(一)和3(b)等位基因与细胞因子的水平明显高于标记样本中位数)。另外,我们计算两个矩阵的斯皮尔曼等级相关系数25)(一个用于牙周炎患者,另一个用于控制)观察到的细胞因子和il - 4水平之间的多态性和比较两种方法的观察水平的意义(见图1,只突出了箭显著关系。)(统计上显著的结果,,)所示表3(一)和3(b)和图1。

3所示。结果

对牙周炎患者(平均年龄年,意味着±SD)和健康受试者(两组之间没有差别。没有显著差异(主题与牙周炎之间)和控制有关的平均年龄,不吸烟的状态和男性/女性的比例(4/11控制,牙周炎患者21/26)(表1)。

研究多态性(il - 4 -590 c / T和VNTR基因内区3)在哈迪温伯格平衡在对照组。il - 4多态性的等位基因和基因型频率没有显著不同受试者与牙周炎和控制(;数据未显示)。45 CP患者中,有2例轻微(1或2毫米卡尔),11例中度(3或4毫米卡尔),严重的患者和32 CP(≥5毫米口径)。当比较基因型(il - 4 -590 cc与CT + TT和il - 4 VNTR 11和12 + 22)患者之间轻微/中度()和严重的()形式的牙周炎,我们发现两组之间无显著差异(对il - 4 -590 c / T和对il - 4 VNTR多态性)。

患者和健康对照组被分成组根据il - 4基因的多态性(CC纯合子与CT + TT基因型-590 c / T变体和纯合子11和12 + 22 VNTR基因型)。表3(一)和3(b)说明了中位数的细胞因子水平测量后三天在体外刺激淋巴细胞分离的患者和健康对照组外周血牙菌斑的细菌,有丝分裂原,HSP70。

结果在表3(b)表明,il - 4的测量值和IL-5 (pg / mL)非常低,组间无显著差异在这些细胞因子检测的水平。相反,il - 6的水平相对较高的牙周炎患者和健康对照组。il - 6的水平后,刺激淋巴细胞的细菌p .媒介物患者携带-590 cc的il - 4和il - 4 VNTR 11基因型明显高于-590年运营商ct基因型和il - 4 VNTR 12 + 22 ()。类似的统计上的显著差异生产的il - 6和TNFα刺激后t .连翘检测il - 4的运营商VNTR 11基因型与患者携带基因型相比12或22 ()。结果在表3(一)表明,携带CC基因型牙周炎患者的淋巴细胞il - 4 -590年产生的il - 4 VNTR多态性或11基因型干扰素γ(和、职责)刺激后t .连翘也更刺激后il - 10t .连翘和p .媒介物(从来)。il - 10在组显著增加健康的人携带的基因型CC il - 4 -590年刺激t .连翘。另一方面,没有显著差异IL-17和il - 1的生产α由牙菌斑细菌刺激后决定牙周炎患者il - 4基因多态性在这项研究。生产的il - 1β牙周炎患者明显高于携带CC基因型il - 4 -590 c / T基因变异后刺激t .连翘如果文化()。受试者携带基因型il - 4 VNTR 11被发现有更高的il - 1的生产β与几乎所有的代理(刺激后来)除了刺激p . gingivalis和p .媒介物()。

在群健康对照组,统计学上显著差异观察只有主题之间CC和CT和il - 4 -590 TT基因型多态性刺激后t .连翘()。最高的不同细胞因子il - 1的生产α观察控制之间基因型CT和TT和CC与HSP70和刺激后答:actinomycetemcomitans如果文化()。一个明显高于il - 1的生产α只有在发现如果文化基因型患者il - 4 VNTR 11。我们没有发现任何显著差异在刺激后细胞因子的生产由PWM脉宽调制+一个,和HSP70检查小组。

图1显示了一个平行的结果评价这些关系的斯皮尔曼相关分析;他们是相同的数据表3(一)和3(b),清楚地表明il - 4多态性的关系研究细胞因子刺激后生产的细菌。图1表明,在牙周炎患者,比如“CC”il - 4 -590 c / T多态性和il - 4的“11”VNTR响应中发挥重要作用的外周血淋巴细胞与细菌刺激。t .连翘细胞因子肿瘤坏死因子的生产是一个重要的刺激器好吗α、il - 6、il - 10,干扰素γ、il - 10、il - 1β而p .媒介物影响在体外牙周炎患者il - 6和il - 10的生产。生产IL-17、il - 4和IL-5没有受到上述因素的短期刺激的(图1)。

4所示。讨论

牙周病原体之间的交互和生物体的免疫反应需要的知识牙周病的发病机制。牙菌斑细菌的激活涉及当地的发展和系统性的体液和细胞免疫。疾病的特征是积累的淋巴细胞在牙周组织;开始的炎性浸润为主的T淋巴细胞而后来慢性阶段显示了转向B淋巴细胞和浆细胞(26]。

后在体外刺激与p . gingivalis和f . nucleatum,大部分periodontitis-affected组织的淋巴细胞从活检获得的TH2表型(4]。失活的干扰素-γ并通过gingipains - 2p . gingivalis炎症地点也可以表达下调TH1反应(与非主动牙周损伤)和促进TH2通路和多克隆激活b细胞在晚期牙周炎27]。根据我们之前的经验,讨论了出版物,我们选择periopathogens和有丝分裂原在本研究中进行了测试。PWM作为T细胞和B细胞刺激器,这是与伴刀豆球蛋白结合使用,激活T监管机制;HSP70作为炎症组织的冲击响应的指标。

我们假设低水平的细胞因子刺激后调查p . gingivalis由于短时间内被发现由gingipains研究细胞因子的刺激或失活。

本研究结果指出单核苷酸的重要性在牙周病il - 4基因多态性。最重要的发现之一是证明-590 c / T多态性在启动子区域和VNTR基因内区3基因编码il - 4的影响不仅白介素的生产,如前所述[28- - - - - -30.),还生产其他细胞因子反应牙菌斑细菌或选定的有丝分裂原的作用,这种作用更明显在慢性牙周炎患者与健康对照组相比。

最大的刺激效果t .连翘生产的il - 10在牙周炎患者携带基因型CC (-590 c / T)基因编码il - 4和11 (VNTR)而增加干扰素的水平γ,il - 1β、il - 6和TNFα相同的基因型患者较低()。监管牙周炎患者细胞因子il - 10的水平携带适当的il - 4基因型多态性也显著增加,刺激后p .媒介物。与病人表现出增加的生产上述细胞因子的基因型CC或11,il - 1的产量更高α刺激后HSP70和细菌答:actinomycetemcomitans在对照组被发现携带结合CT + TT (il - 4 -590 c / T)和12 (il - 4 VNTR)。

基于我们以前的结果(5,15),我们假设,与牙菌斑细菌刺激后,il - 4基因多态性在牙周炎患者尤其会影响细胞因子il - 4的生产。这种假设相反,没有发现显著增加il - 4水平,而刺激t .连翘和p .媒介物导致的水平明显高于其他细胞因子。这些结果符合数据的最近的研究证明,多态性基因编码的一些细胞因子及其受体可以影响的生产不仅自己,而且其他介质。这项研究的结果,沃利斯等。31日]表明I50V SNP部分IL-4R控制生产IL-17 TH17细胞培养健康的人。同样,IL-4R微小等位基因的SNP (rs1805010),授予受损的il - 4信号和与咄咄逼人的破坏性有关类风湿关节炎(RA),有助于增加TH17细胞频率,增强临床活动,加速风湿性关节炎的影像学进展呈现从RA CD4 T细胞32]。

细胞因子发挥关键作用,调节免疫反应。细胞因子都是多效性的。他们有能力在细胞表面的特异性受体相互作用,可以调节为其他细胞因子受体的表达。相同的细胞因子的生物学功能是受几个不同的细胞因子(细胞因子相声)。这是一个生物学上重要的特性:如果一个细胞因子缺失或水平有限,替换另一个细胞因子存在,可能是受CP患者il - 4基因多态性(33]。我们的研究结果提出了表3(b)表明,il - 4基因多态性影响另一个TH2细胞因子il - 6的生产。il - 6是一种白介素,充当促炎和抗炎细胞因子。il - 6的抗炎作用:对肿瘤坏死因子有抑制作用α和il - 1生产和激活il - 1 ra和监管il - 10的生产。我们假设更高的平均检测健康组与牙周炎患者组后刺激的淋巴细胞p .媒介物也可能被解释成il - 6的消炎作用。

这项研究有一些局限性。例如,短时间从外周血淋巴细胞的分离培养与细菌和有丝分裂原。此外,健康控制和牙周炎组不精确匹配性。最后,排除了任何健壮的索赔和小样本大小的需要额外的大型纵向研究群牙周炎患者。因为这个原因,两种统计方法评价的结果。

看来,慢性牙周炎的遗传背景的知识仍将在相当一段时间内个人知识水平的“潜在的”风险或保护性因素对疾病的影响将取决于更广泛,仍然未知的遗传背景和表观遗传的因素。研究结果发表在个人研究的差异阻碍了个人的人口在世界上可以适当的多态性的等位基因频率的不同。其他可能发挥作用的因素有不同的方法评估和数据差异在临床评估和选择病人。例如,牙周炎的年轻学科,以前表现为早发性牙周炎或青少年牙周炎,目前分为积极的牙周炎。在纵向(10年)的一项研究中,我们探索的发展早发性牙周炎患者17-25岁开始这项研究。多年来,一些病人的疾病进展而在别人没有(15,34]。根据目前的标准,所有的病人在研究的开始就被归类为遭受侵略牙周炎。这个事实指出,预防考试的重要性集中在最初的年轻学科的牙周组织的变化和早期预防治疗。

5。结论

我们的研究表明,il - 4基因的多态性不仅影响细胞因子il - 4的生产,而且会影响其他细胞因子的生产,如il - 10、干扰素γ,il - 1β、il - 6和TNFα,这反过来会影响牙周疾病。还需要进一步的研究来阐明这些多态性与细胞因子的关联生产其他人群。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突与此相关的工作。

确认

这项研究是由PRVOUK-P28 / LF1/6(捷克共和国布拉格查尔斯大学),由市政工程/ / 0951/2013(马萨里克大学),授予11405 - 6元,NT 14164 - 3, NT 13087 - 3(卫生部,捷克共和国)。