文摘

丝氨酸肽酶抑制剂(isp)表示利什曼虫主要提高细胞内的寄生在巨噬细胞针对中性粒细胞弹性蛋白酶(NE),丝氨酸蛋白酶,夫妻prooxidative TLR吞噬作用₄/ PKR通路。在这里,我们调查了功能性ISP-expressing之间的相互作用l .主要和kallikrein-kinin系统(乐)。酶化验表明,NE抑制剂或重组ISP-2抑制乐在人血浆被硫酸葡聚糖激活激活。活体的显微镜的仓鼠颊囊表明,局部应用l .主要promastigotes (WT和突变体)有说服力地诱导等离子渗漏通过激活血管舒缓激肽B₂受体(B₂R)。接下来,使用反激肽原马伯域,我们表明,隔离这些BK-precursor蛋白质l .主要promastigotes,表达了在高%突变体。引人注目的是,分析吞噬吸收的细胞分裂素的作用途径l .主要显示,B的拮抗剂₂R或B₁R调节吸收的逆转WT的突变体没有抑制巨噬细胞内化l .主要。总的来说,我们的研究结果表明,l .主要ISP-2回馈都巨噬细胞吞噬作用通过抑制pericellular释放促炎从表面束缚激肽原激肽。正在进行的研究应澄清是否l .主要ISP-2颠覆了TLR₄/ PKR-dependent prooxidative反应阻止巨噬细胞的激活g蛋白耦合B₂R / B₁R。

1。介绍

综合3丝氨酸蛋白酶,第十二因素(FXII)系数ξ(FXI)和血浆prekallikrein (PK)和一个非酶的辅因子,高分子量激肽原(香港),kallikrein-kinin系统(乐),也称为凝固的等离子体接触途径,组装和激活当血液接触内生起源或微生物表面带负电荷的聚合物(1,2]。绑定到这些带负电荷的结构后,发酵菌FXII发生构象变化,赋予有限的不稳定的酶原酶活性。激活FXII (FXIIa),那么劈开prekallikrein(代数余子式的香港)混合时,产生PKa。互惠乳沟之间反应FXIIa PKa放大蛋白水解级联,导致下游(我)通过FXIIa代纤维蛋白/ FXIa-dependent procoagulative通路,(ii)发布的内部缓激肽(BK)一半PKa的香港。一旦被解放,短暂的BK诱发血管扩张,增加微血管通透性通过激活血管舒缓激肽B₂受体(B₂在内皮细胞衬里(R)表达1]。此外,多功能PKa生成血纤维蛋白溶酶,纤维蛋白溶解的效应,劈开原生C3补体系统的C3 (3,4]。

尽管香港经典被视为父母的促炎细胞分裂素的前体,香港的裂解形式(HKa)二硫链two-chain结构,额外的生物功能。例如,据报道,HKa减少中性粒细胞粘附功能绑定β2-integrin Mac-1 (CR3 CD11b / CD18,米β2)(1,5]。最近,杨et al。6)任命香港/ HKa plasma-borne调理素驱动efferocytosis凋亡细胞通过纤溶酶原激活物受体(uPAR) / RAC1-pathway。绑定到磷脂酰丝氨酸(PS)暴露后凋亡中性粒细胞,关掉前表面束缚香港uPAR结合促炎反应的巨噬细胞(6]。这部小说与免疫调节功能,香港(和低分子量激肽原路)是传统上被视为促炎细胞分裂素的前体。一旦泄露到血管外的组织,plasma-borne港元/路进行蛋白水解分裂组织激肽释放酶,释放B₂R受体激动剂lysyl-BK (LBK)炎性渗出液(1]。值得注意的是氧化形式的激肽原可能释放生物活性细胞分裂素由于中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)之间的合作和肥大细胞类胰蛋白酶(7,8]。作为旁分泌激素,短暂的细胞分裂素缓激肽(BK或LBK)迅速激活g蛋白耦合B₂受体(B₂R)亚型受体表达的既定的内皮细胞,疼痛的神经细胞,巨噬细胞,DCs (1,9- - - - - -11]。完整的远程信号活动激肽是由kinin-degrading metallopeptidases,如血管紧张素转换酶(ACE / kininase II) [1]。此外,解放激肽肽代谢的kininase我(羧肽酶N和M);删除c端Arg残渣产生des-Arg-kinins, B的高亲和性配体₁R, GPCR亚型的表达强烈调节受伤或发炎组织(12]。

在过去的十年里,在我们实验室进行的研究表明,细胞分裂素proteolytically在外围网站发布t . cruzi或利什曼虫chagasi感染可逆夫妇炎症物质免疫(13- - - - - -17]。另一个有趣的转折来自接触系统的研究表明,激活/ kk促进纤维蛋白网内细菌截留,从而提供一个物理屏障对微生物病原体的系统性传播(18]。这个日期,然而,目前尚不清楚联系通路调节免疫皮肤利什曼病的早期阶段。活体的显微镜研究在老鼠的耳朵模型l .主要感染(19- - - - - -21]表明,渗透中性粒细胞吞噬promastigotes之前表达所需的凋亡标记efferocytosis真皮DCs。寄生/凋亡中性粒细胞内化后,真皮DCs不再能够转向保护TH1-responses在淋巴结中(19- - - - - -21]。尽管efferocytosis强烈影响直流功能和发展l .主要感染,独立研究表明巨噬细胞清除凋亡中性粒细胞可以诱导pro - NE-dependent方式或抗炎反应,细胞内的命运受到寄生虫的宿主遗传背景(22,23]。

自然感染的食血节肢动物、昆虫长鼻不可避免地导致出血,然后导致等离子体和白蛉唾液物质与寄生虫的混合沉积在受伤的真皮24]。有趣的是,放血duboscq一个向量的利什曼虫物种,含有高水平的唾液蛋白(PdSP15)抑制接触途径(25)被绑定到带负电荷的聚合物内生origin-such血小板源聚磷酸盐(2,18,26]。考虑到procoagulative接触系统的激活导致微血管渗漏通过PKa-mediated释放BK,可想而知,sandfly-transmitted利什曼虫promastigotes进化的手段颠覆的天生的效应功能细胞分裂素途径感染的早期阶段。

目前的研究是出于最近的发现利什曼虫有三个基因编码ecotin-like丝氨酸肽酶抑制剂(isp) (27]。先前的研究原型的家庭大肠杆菌ecotin [28]表明这种抑制剂的目标中性粒细胞弹性蛋白酶(NE) (29日)——的成员trypsin-fold丝氨酸肽酶家族PA /家庭。注意的是,后利什曼虫基因组(30.缺乏这些内生丝氨酸肽酶目标,Eschenlauer et al。27)预测,l .主要互联网服务供应商可能的目标家庭丝氨酸肽酶表达的先天免疫系统的细胞,如东北、类胰蛋白酶、组织蛋白酶G (30.]。在一系列的优雅的研究中,Eschenlauer et al。27和法等。31日,32解决这个问题用l .主要行缺乏ISP2和ISP3 ()。在研究之间的相互作用的结果l .主要promastigotes引起巨噬细胞,这些作者发现这些吞噬细胞内化promastigotes更有效地比ISP-expressing野生型(WT)寄生虫27,31日)和相关的调节CR3-dependent吞噬作用l .主要突变体通过TLR NE-dependent激活先天免疫₄/ PKR TNF -/干扰素-βprooxidative通路,限制了细胞内寄生虫生存(31日,32]。值得注意的是,的表型promastigotes补充逆转了巨噬细胞培养与纯化(重组)ISP-2或合成NE抑制剂(MeOSuc-AAPV-CMK),在感染的发病31日]。基于这些集体的发现,这些作者建议ISP-2表达l .主要promastigotes可能downmodulate巨噬细胞的吞噬作用和限制杀菌剂的反应预防NE-dependent TLR的激活₄(31日,32]。最近,我们已经记录,巨噬细胞内化和限制细胞内t . cruzi增长的居民通过激活巨噬细胞通路伪造的缓激肽B之间的串音₂受体ca5的受体(33]。好奇的表型之间存在相似之处l .主要 突变体,l . chagasipromastigotes [15),t . cruzitrypomastigotes (Dm28应变)33,34),在当前我们审问ISP-expressing是否工作l .主要和ISP-2激活kk突变体有不同的能力在活的有机体内和在体外。使用活体的显微镜,我们首先显示l .主要promastigotes局部应用于仓鼠颊囊强有力地激活kk血管外的,不管存在/缺乏ISP。在本研究的第二部分,我们目前的证据表明ISP-expressingl .主要可能颠覆先天免疫针对kinin-releasing丝氨酸蛋白酶(家庭)暴露在巨噬细胞的细胞表面。

2。材料和方法

2.1。寄生虫

l .主要Promastigotes Friedlin (MHOM / JL / 80 / Friedlin)是生长在修改鹰的介质(HOMEMσ)补充heat-inactivated 10%胎牛血清(的边后卫,Gibco) 25°C,如前所述[31日,32]。悬浮液的promastigotes洗两次与PBS之前使用在体外或在活的有机体内。利什曼虫主要缺乏ISP2和ISP3 ()如前所述生成Eschenlauer et al。27]。以下显示浓度的抗生素使用转染子的选择:50毫克/毫升潮霉素B(罗氏),25毫克/毫升G418(表达载体),10毫克/毫升腐草霉素(InvivoGen)和50毫克/毫升嘌呤霉素盐酸盐(Calbiochem)。

2.2。活体的数码显微镜

叙利亚仓鼠,三月大的男性,是维护和麻醉按照规定由当地伦理委员会(23/02/2008 IBCCF、协议- 014)。总共65仓鼠(g) (Anilab,圣保罗,巴西)。麻醉诱导戊巴比妥钠腹腔注射3%与注射补充。氯醛糖(2.5% W / V,在盐水溶液)通过一个股静脉导管。插入气管插管(PE 190)促进自主呼吸和体温维持在37°C的加热垫监测直肠热敏电阻。仓鼠的颊囊(HCP)准备和用于活体的显微镜之前报道34,35]。HCP微循环的观察使用一个Axioskop 40显微镜,客观4 x,和眼部10 x配有LED光源Colibri(德国卡尔蔡司)和适当的过滤器(490/520和540/580 nm,若丹明)观察epiluminescence的荧光。AxioCam HRc,数码相机和电脑AxioVision 4.4软件程序(德国卡尔蔡司)被用于小动脉的直径和总荧光图像分析的代表矩形区域(5毫米²HCP)的准备。荧光记录实验干预前30分钟安全正常的血液流动和改变血管通透性和荧光测量30分钟后FITC-dextran (FITC-dextran 150 kDa, 100毫克/公斤体重,TdB咨询,乌普萨拉,瑞典)注射调整到2000荧光单位(RFU =相对荧光单位)原因统计。白细胞是标签在活的有机体内通过注入罗丹明100μ克/公斤b。w增长值实验干预前(10分钟),强化了注入相同的示踪剂在10μ克/公斤b.w.每10分钟至60分钟。10分钟的记录荧光罗丹明注射后在每个实验中调整到3000荧光单位(RFU)原因统计。两个完全相同的图像区域记录每5分钟间隔在整个实验。一个是用来测量血浆泄漏和小动脉的直径(490/520 nm)和其他测量总荧光rhodamine-labeled白细胞在流通,滚动,坚持,和迁移(540/580 nm)观察到的地区(5毫米²)定义为白细胞积累。曝光时间仅限于15秒为每个捕获图像为了避免光毒性。30分钟后控制时期局部暴露于WT FITC-dextran注射后的学校l .主要promastigotes或(7.5×10⁶/ 500μL)在溢出中断了10分钟。Cromoglycate注入i.p。(40毫克/公斤合著)戊巴比妥麻醉时,硫酸葡聚糖500 kDa (TdB咨询,乌普萨拉,瑞典)注入增长值(2毫克/公斤)应用程序之前的寄生虫。锄头在0.5 - 140测试μM和组胺H1受体mepyramine (10μ米)应用在本地通过注射泵到溢出在10分钟之前promastigotes中的应用。

2.3。隔离腹膜巨噬细胞和入侵检测

C57BL / 6小鼠获得的腹腔内注射2毫升3% thioglycolate和巨噬细胞都是从腹膜灌洗3天后。巨噬细胞被镀在13毫米的盖玻片24-well板和20 h的孵化后37°C在完全培养基(RPMI + 10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,和100年μg / mL链霉素)不依从细胞被洗的单层细胞与PBS。入侵检测通过添加固定相进行promastigotes到第五层的比例:1(寄生虫/巨噬细胞)中含有1毫克/毫升从牛血清白蛋白(BSA,σ)。交互进行3 h中包含5%的湿润商会有限公司₂在37°C。表示时,培养基补充了100海里的B₂R拮抗剂(锄头- 140,σ)或1μM B₁R拮抗剂des-Arg⁹——(低浓缩铀⁸汉堡王(木豆⁸汉堡王;σ),前5分钟的寄生虫。相互作用后,细胞外promastigotes被用PBS单层洗两次,然后固定Bouin隔夜和沾染色(默克公司)。细胞内无鞭毛体由数决定的数量至少100细胞/复制在光学显微镜下。所有化验都在一式三份,结果表示为平均值±SD。

2.4。寄生虫表面染色

Promastigotes preincubated了pbs - 1% BSA 1小时,以避免非特定的绑定,然后孵化与单克隆抗体安博凯1 h₃(IgG1-1: 50)或HKH4 (1:50),请提供的w . muller - esterl博士从法兰克福大学。安博凯₃认识到BK抗原决定基域人类和牛H - D4 / L-kininogens而HKH₄结合D1域(36]。Isotype-matched单克隆抗体作为消极的控制。寄生虫洗了三次与pbs - 1% BSA和孵化与二次荧光抗体(FITC-1: 50) 30分钟在4°C,免受光。洗涤后,样本通过流式细胞术(FACSCan;BD生物科学)和数据分析软件完成了峰会(Dako科罗拉多州公司)。分析是在重复进行,结果是代表两个独立的实验。

2.5。接触阶段激活人类的等离子体

激活FXII / PK在人类柠檬酸盐(血小板免费)等离子体处理(或不)和硫酸葡聚糖(dx;500 kDa, TdB咨询公司)被spectrofluorimetry监控(如前所述)(37),使用内部猝灭荧光底物的序列对应于c端(Abz-GFSPFRSVTVQ-EDDnp)或氨基端侧翼地区(Abz-MTEMARRPQ-EDDnp米)激肽原BK的老鼠。裂解底物的水解Abz-peptidyl-EDDnp (Abz = o-aminobenzoyl EDDnp =乙二胺2,4-dinitrophenyl)被测量的荧光监控纳米和纳米Spectramax M5荧光分光光度计。反应在PBS进行,pH值7.4,使用柠檬酸盐人血浆1:20,4μM Abz-peptidyl-EDDnp衬底和20 nM的接触系统激活dx (500 kDa)。内部控制,等离子体是用合成PKa抑制剂预处理(pksi - 527 - 5μ米)(38]。化验与重组ISP-2(请提供的a·p·c·a·利马)进行最终浓度的142,177,240,和355海里;中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)抑制剂MeOSuc-AAPV-CMK (Calbiochem)测试10,20和30μm . PKSI或重组ISP2 MeOSuc-AAPV-CMK与人血浆preincubated 15分钟,在37°C,之前的dx和衬底。等离子体是由离心20分钟的血液样本2500 g在4°C。离心后,血浆样本过滤使用0.2μm膜。

2.6。统计分析

统计分析是使用PRISM 5.0 (GraphPad软件)。比较不同群体的手段是通过单向方差分析(方差分析)。当组的平均值显示显著差异,两两比较与图基进行测试。一个值为0.05或更少被认为是表明一个统计上的显著差异。对于活体的实验中,我们使用方差分析或成对t以及,在适当的时候。

3所示。结果

3.1。分析动力学HCP局部炎症的敏化l .主要Promastigotes

活体的显微镜在HCP提供了丰富的信息之间的相互作用kk和局部应用病原体,因为这种方法将针的使用,从而排除出血的影响和间接接触系统的激活microcirculatory参数的分析。在这项工作作为起点,我们问ISP-expressing促炎反应诱发的l .主要promastigotes或ISP-deficient寄生虫具有可比性。我们的结果(图1- - - - - -3)透露,l .主要(WT) promastigotes诱导一个非常健壮的和可逆的微血管渗漏,在20分钟可检测,达到了45分钟后,病原体应用程序(数据最大价值1(一)- - - - - -1 (c))。4的15个实验我们测量周围白细胞积累postcapillary小静脉,并指出这些本地循环细胞被迅速动员,响应被检测后90分钟病原体的应用程序(图1 (b))。等离子体泄漏的时间过程和动力学响应诱发WT promastigotes完全不同于经典的反应引起了BK,组胺,或白细胞三烯,所有这些造成极大增加10分钟内和逆转30分钟内稳态条件(39,40]。有趣的是,我们发现泄漏反应诱发的l .主要(WT) promastigotes通常比相同培养液诱导的更健壮l . donovanipromastigotes(图1 (c))[16]或t . cruzi(组织培养trypomastigotes Dm28c应变)(35]。类似的发现在上述研究中,我们发现,使用锄头- 140 (B₂R拮抗剂)显著降低l .主要(WT)诱导等离子渗漏(图1(一))。

考虑到肥大细胞是天生的前哨细胞在血管周的本地化战略组织,我们接下来的审讯l .主要以桅杆cell-dependent方式promastigotes可能唤起等离子渗漏。如图1(一),局部增加mepyramine (histamine-1-receptor阻滞剂)显著抑制了大分子泄漏引起的l .主要promastigotes。在一系列有限的研究中,我们发现cromoglycate,著名的肥大细胞稳定剂,废除了l .主要全身的等离子体(图的泄漏1 (b)较低的面板)。进一步的兴趣,cromoglycate预防白细胞积累parasite-laden微血管床,减少水平低于该参数控制(图1 (b)上面板)。值得注意的是mepyramine和锄头- 140剂量的局部感染发病的添加到HCP足以阻止泄漏引起组胺(4的标准解决方案μ和BK (0.5 M)μ米)(35]。进一步扩大这个调查,我们接下来探讨微血管渗漏引起的可能性l .主要promastigotes需要循环中性粒细胞的参与。为此,我们单独的一组仓鼠静脉注射注射dx,带负电荷的聚合物(500 kDa)和发现它深刻地抑制等离子体引起的泄漏l .主要promastigotes。尽管dx最初认为抑制neutrophil-dependent微血管通透性通过阻断内皮与neutrophil-derived阳离子蛋白(41- - - - - -44),现在意识到这些影响可能源于DXS-mediated kk的激活,系统性反应导致低血压因过度BK形成(45]。

最后,我们试图比较WT的微血管反应引起l .主要与他们的同行在ISP-2 / ISP-3基因缺陷。如图1 (d)等离子体的动力学泄漏引起的局部应用突变体被WT寄生虫诱发类似,被观察到的峰值响应病原体后45 - 50分钟的应用程序。然而,令人奇怪的是,突变体减少了20%有效地诱发transendothelial泄漏等离子WT promastigotes相比(图1 (d));他们的炎性表型的差异()已经明显在25分钟后寄生虫的应用程序。

3.2。缓激肽受体选择性燃料ISP-Deficient巨噬细胞内化l .主要

研究在小鼠模型的急性恰加斯病(14和内脏利什曼病16最近表明,B₂R-deficient老鼠表现出受损的1型效应T细胞的发展,转基因株的免疫功能紊乱主要归因于缺乏成熟的B₂R^−−/DCs在chagasic老鼠14]。在第三个研究中,我们检测了细胞分裂素的作用途径在体外巨噬细胞相互作用的结果l . chagasipromastigotes [15]。有趣的是,这些研究表明,激活激肽/ B₂R通道可以燃料细胞内寄生虫从仓鼠,脾巨噬细胞产物容易内脏利什曼病的一个物种,或限制寄生虫生存thioglycolate-elicited小鼠腹腔巨噬细胞(16]。出于这个基础,在接下来的一系列的实验我们对巨噬细胞相互作用的结果(3 h在缺乏血清)l .主要promastigotes或突变体。与表型的性质一致promastigotes最初被Eschenlauer et al。27),我们发现这些突变体的吞噬吸收强烈调节WT promastigotes相比(图2)。接下来,我们问B₂R(持续表达的)或B₁R (NFκ- b诱导;(35])促成了吞噬吸收l .主要。感染化验中执行锄头- 140或木豆的存在⁸汉堡王(B₁R拮抗剂)透露,这些GPCR拮抗剂抑制巨噬细胞吸收ISP-expressing (WT)l .主要。在鲜明的对比中,然而,GPCR拮抗剂有效减少了吞噬吸收promastigotes吞噬细胞(分别地。58%和63%;图2)。原因不清楚,B₁R拮抗剂有温和但重要的刺激作用(与媒介相比增加39%)WT的吸收l .专业。

3.3。BK表面暴露抗原决定基WT和不同Promastigotes

因为巨噬细胞感染的研究l .主要promastigotes经常表现在缺乏血清的情况下,我们认为,激肽受体激动剂应该源自激肽原绑定到巨噬细胞表面分子(46)或者从激肽原分子最终被promastigotes血清。测试后一种可能性,我们洗了固定相l .主要promastigotes广泛描述感染化验,然后染寄生虫了两个不同的领域特定的马伯:安博凯(我)₃单克隆抗体,认识到BK抗原决定基(域D₄)激肽原(香港/路),和(2)HKH₄马伯,识别域D₁香港/路(36]。流式细胞仪分析显示,几乎70%的promastigotes HKH4阳性染色,而只有不到50%的WT寄生虫(图3(一个))。类似的,安博凯₃抗体表明激肽原的BK抗原决定基出现在更高比例的promastigotes WT promastigotes相比(图3 (b),82年,4%)相比WT寄生虫(图3 (b),73.1%)。这些结果表明,ISP-expressingl .主要promastigotes和突变体能够隔离激肽原从FCS(保留完好的BK分子)。根据我们的工作假说(图5),激肽原调理素系在ISP-deficient寄生虫可以裂解pericellular丝氨酸蛋白酶(家庭的巨噬细胞,而表面束缚激肽原相关ISP-expressing (WT)l .主要应防止蛋白水解乳沟。

3.4。针对接触阶段的激活/乐在人血浆重组ISP-2或合成中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制剂

考虑到ISP-2很难的上层清液中检测到l .主要promastigotes (a·p·c·a·利马个人通信),我们推断,我们认为这种ecotin-like抑制剂可能的目标丝氨酸蛋白酶隐蔽的空间内形成并列的宿主细胞/寄生虫等离子体膜。由于技术障碍监测kk激活激肽释放在这个细胞间室,我们第一次被问及可溶性(重组)ISP-2或MeOSuc-AAPV-CMK (NE抑制剂)可以抑制人体接触系统的激活dx。这是解决使用一种新型酶试验用于检测我们最近p . duboscq白蛉接触系统的蛋白抑制剂(25]。简单,添加dx (500 kDa)人血浆诱发FXII / PK的相互激活,导致PKa的积累,主要kinin-releasing (家庭)等离子体。使用as-read-outs合成基质生成氨基或c端侧翼序列BK的激肽原分子,我们积极的控制(图中所示的动态测量4)反映DXS-induced kininogen-like底物的水解PKa [25]。内部控制运行在合成PKa抑制剂的存在(pksi - 257)显示,正如预期的那样,明显抑制由dx接触阶段的酶。化验与可溶性ISP-2透露,水解的发生一直推迟,在剂量依赖性的方式(范围142 - 355海里;数据4(一)和4 (b))。类似的趋势观察当我们添加MeOSuc-AAPV-CMK (NE抑制剂)柠檬酸盐浆(范围10 - 30μM;数据4 (c)和4 (d))。总的来说,这些发现符合命题的活动联系阶段酶复杂(FXIIa / PKa)至少部分被ISP-2(溶)或合成抑制剂。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们使用转基因突变体的l .主要确定这些ecotin-like抑制剂调节细胞分裂素的促炎的活动/ B₂R通道在活的有机体内和在体外。在第一组研究中,我们证明了l .主要promastigotes强有力地唤起等离子渗漏和诱导白细胞积累在微血管床桅杆cell-dependent激活激肽/ B₂R通道,无论ISP-2的存在与否。这一分析扩展到在体外感染模型,我们表明,B的拮抗剂₂R(锄头- 140)或B₁R(木豆⁸bk)有效地逆转调节吞噬吸收l .主要 通过TG-macrophages没有干扰的内化ISP-expressing promastigotes (WT)。如下进一步的讨论,这些发现表明,在对巨噬细胞表面,ISP-expressing promastigotes可能抑制B的激活₂R / B₁R-dependent促炎反应通过抑制丝氨酸蛋白酶的kinin-releasing活动(家庭)。

学习时的功能之间的相互作用中NE和ISP-2巨噬细胞感染利什曼虫法等。31日,32]证明了两个明显的表型突变体(调节吞噬作用和诱导活性氧通过弹性蛋白酶/ TLR₄/ PKR通路)完全逆转文化与三种不同的丝氨酸肽酶抑制剂补充:抑肽酶(27),Arg-hydrolyzers的非特异性抑制剂,MeOSuc-AAPV-CMK (NE抑制剂),和l .主要ISP-2(可溶性/重组)。鉴于先例,NE和肥大细胞类胰蛋白酶(代理合作)解放生物活性细胞分裂素从氧化激肽原7),我们的研究结果,锄头- 140和木豆⁸汉堡王也逆转的表型突变体表明ISP-expressingl .主要可能会导致表面束缚的pericellular处理香港通过NE的目标。另外,我们发现可溶性ISP-2(或NE抑制剂MeOSuc-AAPV-CMK)部分抑制DXS-induced激活人类柠檬酸盐接触系统的等离子体(即。,PKa-mediated hydrolysis of the flanking sites of BK in kininogen-like substrates) suggests that ISP-expressing promastigotes might rely on their surface-associated ISP-2 to target the contact phase enzymatic complex (FXIIa/PKa/HK) assembled on macrophage surfaces [46]。诚然,基因研究需要解剖ISP-2是否颠覆了先天免疫的保护表面激肽原kinin-releasing NE和/或活动接触阶段目标表面组装肽酶(FXII / PK)。虽然我们还没有系统地分析了影响B的药理封锁₂R / B₁R的细胞内的寄生TG-macrophages,初步结果表明,锄头- 140(测试在100海里)移植的结果/生存在TG-macrophages突变体。如果证实了遗传研究,我们的研究结果可能暗示l .主要promastigotes可能会限制通过NE / TLR活性氧的形成₄/ PKR TNF -/干扰素-β通路最初描述法等。32]通过ISP-2-dependent定位kinin-releasing肽酶聚集在巨噬细胞的表面。

一个关键事件在许多炎症过程是循环的胶粘剂互动激活中性粒细胞和postcapillary小静脉内皮细胞,这一过程通常是耦合的微血管通透性增加,进而导致了进步的富含蛋白质的水肿液间质组织中积累。尽管承认sand-fly-transmitted炎症反应的动力学利什曼虫诱发的受伤真皮远比描述更复杂的在我们的活体的显微镜研究,分析HCP局部微血管渗漏和白细胞积累的敏化l .主要promastigotes (WT或ISP2/3-deficient寄生虫)透露,这些寄生虫更强大的等离子体诱导物泄漏和白细胞积累l . donovani(15),l . chagasipromastigotes(图1 (c)),或t . cruzitrypomastigotes [35]。尽管不符表型的机制l .主要和l . chagasi或t . cruzi仍然未知,我们好奇发现3 x-fold更高剂量的l . chagasipromastigotes没有唤起强烈的微血管反应,甚至与卡托普利治疗HCP后,细胞分裂素降解的血管紧张素转换酶抑制剂(图1 (c)黑色曲线)。相比之下,t . cruzi和l . chagasi是潜在的致命的病原体传播系统和优先目标组织器官灌溉通过有孔的毛细血管。在这种情况下,plasma-borne基质,如激肽原,自由扩散到内脏组织这些visceralizing物种入侵的病原trypanosomatids,这两个被授权kinin-releasing半胱氨酸蛋白酶(15,47- - - - - -49]。值得注意的是B₂R-deficient老鼠严重感染t . cruzi(14]或l . chagasi(16]显示加剧疾病易感性,这意味着激活激肽/ B₂R通路可能优先宿主和寄生虫的平衡转向保护性免疫,至少在急性期。

从长鼻出血的不可避免地引起某种程度上,我们可以预测血浆蛋白和抗炎物质来源于昆虫唾液迅速混合metacyclic寄生虫。我们的研究在HCP局部敏感l .主要promastigotes(防止出血和kk激活由于病原体接种针)表明,这些寄生虫有说服力地唤起等离子渗漏和白细胞积累微血管床上通过细胞分裂素/ B₂R通路。尚不清楚的原因,我们发现promastigotes唤起一种温和的炎症反应(20%)。顺便说一句,Eschenlauer et al。27)报道,小鼠皮下注射感染l .主要promastigotes短暂显示更高的组织的负担ISP2 / ISP-3-deficient寄生虫相比WT寄生虫。持续3天,寄生虫负担随后扳平比分,这意味着选择性优势赋予ISP-deficient promastigotes感染进展已经减弱。

根据药理方法,我们发现证据l .主要激活kk通过机制涉及transcellular相声中性粒细胞和肥大细胞(血管内)之间的一个子集的前哨细胞主要是局部血管周的组织中。除了组胺的作用于血管的作用,有效的血管通透性诱导物,肥大细胞也释放肝素钠和聚磷酸盐,这两家银行最近接触系统的特征作为内生活化剂(50,51]。由于炎症回路的相互依存的本质,肥大细胞可能和kk /补体级联相互激活和推动HCP敏化l .主要promastigotes。虽然我们没有研究大量补充到外围网站的影响l .主要感染,是证据确凿的利什曼虫lipophosphoglycan由C3bi[调理的52]。在缺乏其他的炎症信号,巨噬细胞由ISP-expressing CR3的参与l .主要(WT) promastigotes可能驱动吞噬不必刺激活性氧中间体的生产,从而创造一个好客的环境的细胞内增长l .主要(31日,32]。尽管研究CD11b-deficient BALB / c小鼠最近证实,C3bi / CR3通路的激活增加主机的易感性l .主要感染(53),这将是有趣的知道CR3-dependent抑制il - 12的反应可能取决于parasite-evoked补充组件的外渗到血管外的隔间里,这里提出的plasma-borne激肽原。

研究老鼠耳朵sandfly-transmitted感染模型显示l .主要metacyclic promastigotes存入真皮浸润吞没的中性粒细胞在大约3 h (19- - - - - -21]。基于HCP描述的结果局部敏感l .主要promastigotes,可想而知,蛋白水解释放血管活性的细胞分裂素可能会进一步刺激中性粒细胞的transendothelial迁移在感染的早期阶段。此外,鉴于证据表明寄生中性粒细胞凋亡公开efferocytosis所需的标记,这将是有趣的知道等离子体泄漏可能导致直流efferocytosis和随后的镇压Th1-inductive引流淋巴结(DCs的功能19- - - - - -21]。除了对适应性免疫的影响,这已是不争的efferocytosis凋亡中性粒细胞具有深远影响的寄生虫生存在被感染的巨噬细胞22]。在这种情况下,我们发现激肽原抗原表位(氨基端D1和内部/ BK / D4域)在表面的固定利什曼虫promastigotes是一项有趣的发现,因为它提出了一个可能性,ISP-expressing promastigotes可能“保护”表面的完整性约束激肽前体的过早蛋白水解降解宿主蛋白水解酶。这个假说是值得探索的最近的研究表明,香港(血液中丰富的蛋白质;660海里)绑定到PS暴露在凋亡中性粒细胞刺激uPAR-dependent efferocytosis巨噬细胞通过p130cas - crkii码头- 180 rac1通路(6]。换句话说,互联网服务提供商可以保护香港的完整性调理素“吃我的信号”,同时防止解放促炎细胞分裂素(看到方案图5)网站内寄生虫对吞噬细胞。虽然我们没有探索的潜在意义l .主要调理素作用的激肽原,将会很有趣知道whetherparasite子集轴承uPAR配体HK / HKa“吃我信号”可能使巨噬细胞的细胞内生存,也许让人想起凋亡模仿范例最初被Barcinski和同事(54]。

5。结论

扩展我们之前调查的广度的角色kallikrein-kinin系统实验恰加斯病和内脏利什曼病的免疫发病机理,本文研究报道表明,ecotin-like抑制剂所表达的l .主要promastigotes微调吞噬作用和可能限制无鞭毛体生存通过抑制pericellular kinin-releasing丝氨酸蛋白酶的活性(家庭)的巨噬细胞。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究支持由CNPq / INBEB Faperj, PRONEX。作者感谢教授Ana de Araujo利马葆拉·卡布拉尔(皇家研究院Biofisica卡洛斯恰加斯球场,里约热内卢联邦大学做)请提供WT和l .主要和丝氨酸肽酶2抑制剂(ISP2)和Werner muller - esterl教授(法兰克福大学)捐赠anti-kininogen抗体。他们也要感谢博士Marilia法(皇家研究院Biofisica卡洛斯恰加斯球场,里约热内卢联邦大学做)的独立测试B₂R和B₁R拮抗剂与巨噬细胞感染化验(未公开的数据)。