文摘

过敏性哮喘可导致气道结构重构,包括细胞外基质的积累和平滑肌增厚。肿瘤坏死因子(TNF)家庭配体光(TNFSF14)是一种细胞因子,结合疱疹病毒进入中介(HVEM) / TNFRSF14和淋巴毒素β受体(LTβR)。光诱发哮喘细胞因子IL-13纤维化细胞因子、转化生长因子-β从过敏与哮喘有关的嗜酸性粒细胞释放表达HVEM和肺泡巨噬细胞表达βR,从而分别扮演重要的角色在哮喘气道重塑。在这项研究中,我们调查的影响对人类嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和支气管上皮的coculture BEAS-2B细胞。粘附分子的表达、细胞因子/趋化因子和基质金属蛋白酶(MMP)是衡量流式细胞术、多路复用、化验或ELISA。结果表明,光可以显著促进细胞间粘附,细胞表面的表达细胞间粘附molecule-1,释放气道remodeling-related il - 6, CXCL8,和MMP-9 BEAS-2B细胞与嗜碱粒细胞和嗜酸性粒细胞,可能通过细胞间的相互作用、细胞表面受体HVEM和LTβR BEAS-2B细胞,细胞外signal-regulated激酶,p38有丝分裂原激活蛋白激酶和NF -κB信号通路。上面的结果,因此,增进我们的了解在过敏性哮喘和免疫病理作用的阐明气道重塑的潜在治疗靶点。

1。介绍

可能导致过敏性哮喘气道重塑和肺纤维化1]。气道重构的特征是细胞外基质(ECM)的积累,如胶原蛋白、平滑肌增厚。纤维发生的细胞因子转化生长因子(TGF -β),与哮喘有关的IL-13是至关重要的细胞因子的协同气道重塑(1]。矩阵metallopeptidase 9 (MMP-9),细胞外蛋白酶家族成员之一,协调组织重塑过程中细胞外基质的降解2]。

粒细胞嗜碱粒细胞被证明IgE绑定和执行Th2 cytokine-dependent免疫力和过敏性炎症的基本角色3]。嗜碱粒细胞很少存在于正常组织。然而,他们的数量显著增加在哮喘患者的气道过敏性炎症性网站,尤其是在哮喘恶化针对过敏原吸入(4- - - - - -6]。粒细胞嗜酸性粒细胞是另一个过敏炎症的主要效应细胞(7]。过敏性哮喘的特征是积累和嗜酸性粒细胞的浸润组织由特定的嗜酸性粒细胞趋化因子eotaxin和血管细胞粘附分子1 (VCAM)和细胞间粘附分子1 (ICAM)在上皮细胞,随后释放颗粒毒性蛋白,如嗜酸性阳离子蛋白从eoisnophils7]。

光(lymphotoxin-related诱导配体竞争为疱疹病毒糖蛋白D绑定条目中保T细胞),也被称为肿瘤坏死因子超家族(TNFSF) 14 / CD258,是肿瘤坏死因子家族成员之一。这是一个表面homotrimer等免疫细胞激活T细胞和B细胞。许多成员包括TNF -αCD40配体(CD40L), Fas配体(FasL) TNF-related activation-induced细胞因子(状态),光可以从细胞表面裂解,其可溶性形式已报告参与各种生理过程具有广泛的生物功能(8- - - - - -11]。自光membrane-expressed膜相关蛋白的淋巴毒素(LT)αβ(12),它结合疱疹病毒进入中介(HVEM;TNFRSF14)也是一个共享的配体与膜淋巴毒素βR (12,13]。光可以优化炎性细胞因子白介素生产由树突细胞和Th1细胞(14]。表示在肺部炎症CD45 +白细胞过敏原后屋尘螨的挑战[15]。光直接诱发气道重塑是依赖于诱导纤维化细胞因子的转化生长因子(TGF)β。在慢性哮喘小鼠模型,药物抑制光使用之间的融合蛋白免疫球蛋白Fc域和LTβR可以减少肺纤维化,平滑肌/上皮增生,通过抑制气道高反应肺TGF -的生产β和IL-13气道重构的关键细胞因子在人类15]。另一方面,外生政府对航空公司的光诱导纤维化和平滑肌增生。LIGHT-deficient老鼠展览在纤维化和平滑肌损伤积累(15]。符合这一点,哮喘病人的痰液光水平被发现与肺功能下降(16]。除了光,反B和T淋巴球衰减器(BTLA),一个抑制T淋巴细胞上受体与细胞毒性T T细胞抑制功能相似lymphocyte-associated抗原4 (CTLA-4)和程序性死亡1 (PD-1) [17),也是HVEM的配体18,19]。尽管BTLA-HVEM复合物有负调节t细胞免疫反应被证明18),BTLA的表达与哮喘有关的嗜碱粒细胞,嗜酸性粒细胞,支气管上皮细胞并没有被调查。

最近机械的研究表明,光可以诱导IL-13和TGF -β分别从esoinophils释放和肺泡巨噬细胞(15,20.]。嗜酸性粒细胞表达HVEM但不是LTβR (15),而光可以诱导MMP-9从巨噬细胞通过释放βR (21]。我们最近演示了关键角色交互的嗜碱粒细胞和嗜酸性粒细胞与支气管上皮细胞在过敏性哮喘(22,23]。然而,精确的所扮演的角色仍悬而未决,气道高反应的高架光,光的细胞内机制可以激活支气管上皮细胞与嗜碱粒细胞和嗜酸性粒细胞释放气道重塑相关的分子也不确定。因为我们假设光可能在气道重塑发挥免疫作用的激活粒细胞和气道上皮细胞之间的细胞间相互作用,本研究的目的是调查的影响对支气管上皮细胞与嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和底层交互的细胞内机制。

2。材料和方法

2.1。试剂

重组体人光/ TNFSF14购买从研发系统(明尼阿波利斯,美国)。我κBα磷酸化抑制剂bay11 - 7082, p38 MAPK抑制剂SB203580, c-Jun氨基蛋白激酶抑制剂SP600125(物),细胞外signal-regulated激酶(ERK)抑制剂U0126和PI3K抑制剂LY294002从Calbiochem购买公司(美国圣地亚哥,CA)。bay11 - 7082, SB203580 SP600125, U0126, LY294002溶解在0.1% (v / v)二甲亚砜(DMSO)。

2.2。净化人类外周血嗜碱粒细胞和嗜酸性粒细胞的巴菲外套和细胞培养

净化人类嗜碱粒细胞和嗜酸性粒细胞是根据我们之前的出版物(22- - - - - -24]。新鲜人巴菲外套从健康志愿者获得香港红十字会输血服务与PBS稀释和离心机使用Ficoll-Paque +解决方案(通用电气医疗集团,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)和等张Percoll解决方案(密度1.082克/毫升;通用电气医疗集团)净化嗜碱粒细胞和嗜酸性粒细胞,分别。Basophil-rich外周血单核细胞(PBMC)分数或eosinophil-rich粒细胞分数被收集和清洗两次冷PBS含2%胎牛血清(的边后卫)(英杰公司公司,卡尔斯巴德、钙、美国)。嗜碱粒细胞和嗜酸性粒细胞被负面纯化选择使用嗜碱细胞隔离设备和anti-CD16磁珠(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国),分别使用一个LS +列(Miltenyi)在一个磁场。这种准备,失败部分包含净化嗜碱粒细胞或嗜酸性粒细胞的纯度至少99%作为染色染色评估解决方案(Sigma-Aldrich Corp .,圣路易斯,密苏里州,美国)与特定的嗜碱细胞表面标记CD203c染色(22]或Hemacolor快速血涂片染色(E默克Diagnostica,达姆施塔特,德国)23),分别。孤立的嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞在RPMI1640培养介质(表达载体)补充10%的边后卫(表达载体)。上述协议使用人类嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞纯化从人类临床研究伦理委员会批准的淡黄色的外套是香港中文大学的新领土东集群医院所有健康志愿者的书面同意香港红十字会输血服务符合赫尔辛基宣言。

2.3。Coculture嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞

人类支气管上皮细胞系(BEAS-2B)从美国获得类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。这个细胞株已经改变了腺病毒12-SV40病毒混合(Ad12SV40)和广泛应用在体外支气管上皮细胞模型(24]。BEAS-2B细胞生长在杜尔贝科修改鹰的培养基营养混合物F12(英杰公司)与10%的边后卫在37°C湿润有限公司5%2气氛直到融合细胞单层。coculture,媒介BEAS-2B换成rpmi - 1640细胞中含有10%的边后卫(英杰公司)有或没有嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞。抑制实验、嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和BEAS-2B细胞使用信号分子抑制剂1 h coculture前和治疗受光。

2.4。Coculture嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞和BEAS-2B在存在Transwell插入

防止之间的直接交互嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞和coculture BEAS-2B细胞,transwell插入(孔隙大小:0.4毫米)(BD生物科学公司,圣何塞、钙、美国)被用来分离这两个细胞两个隔间。支流BEAS-2B细胞和嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞一起培养的transwell插入、嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和BEAS-2B细胞被置于上下室,分别是(23]。

2.5。量化的细胞因子,趋化因子,生长因子使用多路复用免疫测定

细胞因子的浓度IL-5, il - 6、IL-9 IL-13,表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、TGF -β和趋化因子CXCL8文化上层清液测定使用人类Milliplex映射工具测定试剂(美国默克密理博公司,Billerica的)与Bio-Plex 200悬浮阵列系统(Bio-Rad实验室、Inc .、大力神、钙、美国)。

2.6。人类MMP-9和Periostin的量化

人类MMP-9文化上层清液浓度测量使用Milliplex人类MMP磁板测定试剂(默克密理博)Bio-Plex 200悬浮阵列系统(Bio-Rad)。人类periostin用ELISA试剂(美国GA RayBiotech Inc .)。

2.7。附着力试验

Coculture BEAS-2B细胞(1×105细胞)和嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞(3×105细胞)或BEAS-2B (3×105细胞)维护与transwell 24-well板插入(孔隙大小:0.4毫米)(BD生物科学)和刺激与光(0 - 100 ng / mL) 24 h。嗜碱粒细胞和嗜酸性粒细胞被移除和另一批新鲜分离嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞(3×105细胞)被添加到附着BEAS-2B细胞粘附的分析。在RPMI1640培养细胞中含有10%的边后卫和孵化37°C湿润5%股份有限公司2大气1 h和胰蛋白酶消化resuspended鞘液。嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和BEAS-2B细胞分别分析了基于特定嗜碱细胞表面标记物的表达CD203c向前直方图和独特的光散射(FSC)连同侧光散射(SSC)的嗜酸性粒细胞点阴谋使用流式细胞仪(FACSCalibur流式细胞分析仪,BD生物科学)。的比值来衡量BEAS-2B细胞上的附着嗜酸性细胞和嗜碱性细胞数计算(22- - - - - -24]。

2.8。免疫荧光染色和流量仪分析

确定HVEM的表达,LTβR,细胞间粘附分子(ICAM) 1在细胞表面,不依从嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞洗和resuspended冷PBS。附着支气管上皮细胞收获使用细胞分离的解决方案。与2%的人类混合血清阻塞后20分钟在4°C和洗涤与PBS补充0.5%牛血清白蛋白,细胞被孵化与藻红蛋白(PE)共轭鼠标反HVEM抗体,PE-conjugated鼠标反LTβR抗体,APC-conjugated鼠标反BTLA / CD272抗体(BioLegend, Inc .,圣地亚哥,美国),PE-conjugated鼠标IgG1同形像,异硫氰酸荧光素(FITC)共轭鼠标反ICAM-1抗体,或FITC-conjugated鼠标IgG2a,κ同形像(BioLegend) 30分钟在黑暗中在4°C。洗后,细胞受到流仪分析(22]。

确定磷酸化信号分子的胞内表达,细胞被固定prewarmed 4%多聚甲醛10分钟37°C。离心后,细胞在冰冷的BD permeabilized Phosflow烫缓冲了30分钟,然后沾鼠标反磷酸化(p) p38 MAPK pERK1/2,πκBα或鼠标IgG1抗体(BD Pharmingen Corp .)、圣地亚哥、钙、美国)60分钟后跟FITC-conjugated山羊anti-mouse二级抗体(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)另一个45分钟在黑暗中在4°C。细胞被洗,resuspended,并受流仪分析(22]。

表面分子的表达和细胞内磷酸化信号分子5000可行的细胞用流式细胞术分析(BD FACSCalibur流式细胞分析仪)和作为荧光强度(MFI)。的微分分析细胞MAPK和核因子(NF)κB BEAS-2B细胞活动,不依从嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞被清洗附着BEAS-2B细胞分离后与PBS不同的治疗方法。附着BEAS-2B细胞然后收获使用细胞分裂细胞内信号分子的流动仪分析解决方案(西格玛奥德里奇Corp .,密苏里州,美国)。嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和BEAS-2B细胞分别分析了基于特定嗜碱细胞表面标记物的表达CD203c向前直方图和独特的光散射(FSC)连同侧光散射(SSC)的嗜酸性粒细胞点阴谋使用流式细胞仪(FACSCalibur流式细胞分析仪,BD生物科学)(22- - - - - -24]。

2.9。统计分析

统计学意义的差别是由单向方差分析(方差分析)或未配对 以及。数据表示为平均值+标准平均误差(SEM)从三个独立的实验。有任何差异 值< 0.05被认为是重要的。方差分析显示显著差异时,Bonferroni事后测试被用来评估组织的区别。所有使用SPSS统计分析软件对Windows(版本16.0;美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。

3所示。结果

3.1。细胞表面的表达HVEM, LTβR, BTLA

如数据所示1(一),1 (d),1 (g),1 (h),1(我)、蛋白质HVEM LTβR, BTLA既定的表达在细胞表面的支气管上皮细胞BEAS-2B但只有HVEM观察表达嗜碱粒细胞和嗜酸性粒细胞。结果类似于以前的报告(15细胞表面表达的,嗜酸性粒细胞HVEM但不是LTβR(数据1 (d)和1 (e))。符合之前的出版物,轻微下降,HVEM表达光刺激后发现这些细胞(25(数据未显示)。

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图1
蛋白质的表达HVEM, LTβR, BTLA净化人类嗜碱粒细胞,净化人类嗜酸性粒细胞和人类支气管上皮BEAS-2B细胞。代表HVEM的细胞表面表达的直方图,LTβR, BTLA (a, b, c)嗜碱粒细胞(d, e, f),嗜酸性粒细胞,(g、h、i) BEAS-2B细胞确定浇注在各自身边向前散射和散射使用流式细胞仪从一式三份的实验获得了本质上相同的结果。
3.2。光对ICAM-1 BEAS-2B细胞和嗜酸性粒细胞的表达

因为我们观察到等离子体光集中的哮喘病人使用ELISA可以高达100 pg / mL,当地的炎症可能是10 - 1000倍浓度高于循环水平。为了模拟炎症状况,我们选择1 - 100 ng / mL浓度以下在体外研究也与采用以前的出版物(26]。图2(一个)表明光(100 ng / mL)可以移植的细胞表面表达ICAM-1 BEAS-2B细胞。如图2 (b)细胞,细胞表面表达的ICAM-1 BEAS-2B就显著增强刺激,高浓度的光(100 ng / mL) ( ),但不是用低浓度(1或10 ng / mL)。细胞与嗜碱粒细胞,ICAM-1水平BEAS-2B也调节了光只100 ng / mL(图2 (b))。然而,光(100 ng / mL)没有任何明显的影响的表达的嗜碱粒细胞ICAM-1 coculture BEAS-2B细胞(图2 (b),所有 )。嗜酸性粒细胞和BEAS-2B coculture的细胞(图2 (c)),光可以显著诱导的表达ICAM-1 BEAS-2B细胞(光、10和100 ng / mL)和嗜酸性粒细胞(光,100 ng / mL) )。如数据所示2 (d)和2 (e)、嗜碱粒细胞细胞数量的增加或嗜酸性粒细胞(0.3×1053×105细胞)可以提高coculture ICAM-1 BEAS-2B细胞上的表达。此外,transwell插入可能显著下调ICAM-1表情BEAS-2B细胞coculture(所有 )。

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图2
效应的光在细胞表面表达ICAM-1 BEAS-2B细胞嗜碱性粒细胞/嗜酸性粒细胞。表达式的ICAM-1 BEAS-2B细胞单独或coculture,和嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞coculture有或没有光刺激了代表性的条形图。(一)代表直方图BEAS-2B ICAM-1的细胞表面表达的细胞(1×105细胞)处理不同浓度的光(0 - 100 ng / mL)显示了24小时。嗜碱粒细胞(b)或(c)嗜酸性粒细胞(3×105细胞)和支流BEAS-2B细胞(1×105细胞)是培养在一起或分别有或没有光(1 - 100 ng / mL) 24 h。表面的表达ICAM-1 5000 BEAS-2B细胞,嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞表示为均值+ SEM MFI的三个独立的实验有三个血液样本。* ,* * * 。(d)嗜碱粒细胞或(e)嗜酸性粒细胞(0.3×1053×105细胞)和支流BEAS-2B细胞(1×105细胞)一起培养有或没有光(100 ng / mL)和transwell(孔隙大小0.4μ米)24 h。表面的表达ICAM-1 5000 BEAS-2B细胞,嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞表示为均值+ SEM MFI的三个独立的实验有三个血液样本。* ;* * 相比与cocultured BEAS-2B细胞和嗜酸性粒细胞没有刺激与光(空酒吧)。# 与相应的组相比没有transwell插入。BS: BEAS-2B单独细胞;玉米穗轴:coculture BEAS-2B细胞;在coculture CoBAS:嗜碱粒细胞;coculture CoEosi:嗜酸性粒细胞。

我们没有观察到任何重大变化在细胞表面表达ICAM-1嗜碱粒细胞或嗜酸性粒细胞单独治疗光100 ng / mL ( )(数据未显示)。

3.3。嗜碱粒细胞粘附/嗜酸性粒细胞上BEAS-2B细胞

进一步解决光致激活cocultured BEAS-2B和嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞,我们估计的能力激活BEAS-2B与嗜碱粒细胞粘附/嗜酸性粒细胞(图3)。增加附着嗜碱粒细胞和嗜酸性粒细胞的数量只能观察到在coculture治疗100 ng / mL光(数字3(一个)和3 (b),两个 )。图3 (b)显示有一个温和的嗜酸性粒细胞粘附到BEAS-2B upregulation细胞仅当BEAS-2B细胞刺激与光(100 ng / mL)。因此上述结果一致粘附分子的表达调节BEAS-2B cocultured嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞的光(图2)。数据3 (c)和3 (d)表明,嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和BEAS-2B细胞可以分别分析了基于特定的表达嗜碱细胞表面标记CD203c嗜碱粒细胞(图3 (c)向前)和不同的光散射(FSC)连同侧光散射(SSC)的嗜酸性粒细胞点阴谋(图3 (d)使用流式细胞仪)。

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图3
嗜碱粒细胞粘附或嗜酸性粒细胞上BEAS-2B细胞。Coculture BEAS-2B细胞(1×105细胞)和嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞(3×105单独使用transwell插入或BEAS-2B细胞细胞)被光线刺激(0 - 100 ng / mL) 24 h。嗜碱粒细胞/嗜酸性细胞被移除和新鲜分离嗜碱性细胞嗜酸性粒细胞(3×105细胞)被添加到相应的包含附着BEAS-2B细胞(1×105细胞)1 h孵化。嗜碱粒细胞的比率(a)或(b)嗜酸性粒细胞粘附到BEAS-2B使用流式细胞术分析中描述的部分2。结果表示为三个独立的平均+ SEM实验有三个血液样本。* ,* * * 。BEAS-2B: BEAS-2B细胞粘附之前单独治疗与光分析;Co-BAS + BEAS-2B: Coculture BEAS-2B细胞和嗜碱粒细胞治疗前与光BEAS-2B细胞用于附着力分析;Co-Eosi + BEAS-2B: Coculture BEAS-2B细胞和嗜酸性粒细胞治疗前与光BEAS-2B细胞用于附着力分析。在上面的附着力试验,嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和BEAS-2B细胞用流式细胞仪分别进行分析。(c)代表流量仪的直方图分析的数量由特定细胞表面附着在嗜碱粒细胞coculture大门嗜碱CD203c标志所示。(d)代表点块流仪分析附着嗜酸性粒细胞的数量coculture SSC和FSC是封闭的。
3.4。诱导细胞因子和趋化因子的交互嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和BEAS-2B细胞受光的刺激

Milliplex人类细胞因子/趋化因子磁板试验被用来测量气道remodeling-related细胞因子和趋化因子,包括IL-5, il - 6, IL-9, IL-13, EGF, TGF -β、VEGF和CXCL8。如数据所示4(一)和4 (b)光(100 ng / mL)可以显著诱导释放细胞因子il - 6和趋化因子CXCL8 BEAS-2B细胞。在coculture嗜碱粒细胞,il - 6和CXCL8光的感应(100 ng / mL)被发现显著高于BEAS-2B细胞(包括 )。然而,光没有任何明显的影响il - 6的释放或从嗜碱粒细胞CXCL8孤独,即使在高浓度(100 ng / mL,数字4(一)和4 (b))。图4 (d)表明光(100 ng / mL)可以显著促进释放CXCL8独自从嗜酸性粒细胞。光(10 ng / mL)可能会进一步诱发释放il - 6和CXCL8 coculture嗜酸性粒细胞和BEAS-2B细胞与嗜酸性粒细胞或BEAS-2B细胞(所有 ,数据4 (c)和4 (d))。此外,coculture BEAS-2B细胞与嗜酸性粒细胞,一起光刺激(100 ng / mL),表现出对il - 6和CXCL8生产(协同效应 ,数据4 (c)和4 (d))。IL-5的水平、IL-9 IL-13,表皮生长因子,VEGF, periostin都检测不到使用相同的实验条件(数据没有显示)。此外,有感应的il - 6和CXCL8生产coculture BEAS-2B细胞和嗜酸性粒细胞(图没有光刺激4)。我们还发现没有显著诱导TGF -β的coculture BEAS-2B细胞和嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞(有或没有光刺激 数据未显示)。

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图4
光对释放il - 6的影响和CXCL8 coculture嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和BEAS-2B细胞。支流BEAS-2B细胞(1×105细胞)和(a, b)嗜碱粒细胞/ (c, d)嗜酸性粒细胞(3×105细胞)是培养在一起或分别有或没有光24 h。释放il - 6和CXCL8文化上层清液由Milliplex决定人类细胞因子/趋化因子磁板试验。结果表示为三个独立的平均+ SEM实验有三个血液样本。* ,* * ,* * * 。BAS:嗜碱粒细胞;Eosi:嗜酸性粒细胞;BS: BEAS-2B细胞;公司:coculture。
3.5。诱导MMP-9嗜碱粒细胞和BEAS-2B细胞的相互作用受光的刺激

如图5光(100 ng / mL)能显著诱导释放MMP-9 BEAS-2B细胞( )。在coculture嗜碱粒细胞,MMP-9的感应灯(100 ng / mL)明显高于控制没有光治疗( )。然而,光没有任何明显的影响从嗜碱粒细胞释放MMP-9孤独,即使在高浓度(100 ng / mL, )。没有明显的感应MMP-9仅在嗜酸性粒细胞或嗜酸性粒细胞的coculture BEAS-2B细胞有或没有光刺激(数据未显示)。


图5
光对释放的影响MMP-9 coculture的嗜碱粒细胞和BEAS-2B细胞。支流BEAS-2B细胞(1×105细胞)和嗜碱粒细胞(3×105细胞)是培养在一起或分别与光(0 - 100 ng / mL) 24 h。释放MMP-9文化上层清液是衡量Milliplex人类测定MMP的面板。结果表示为三个独立的平均+ SEM实验有三个血液样本。* ,* * * 。BAS:嗜碱粒细胞;BS: BEAS-2B细胞;答:coculture嗜碱粒细胞和BEAS-2B细胞。
3.6。信号通路参与嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和BEAS-2B细胞之间的相互作用在光刺激

如数据所示6(一)和6 (b)光(100 ng / mL)可以显著激活ERK和NF -κB在嗜酸性粒细胞(所有 )而不是嗜碱粒细胞(所有 )。数据6 (c),6 (d),6 (e)表明,随着光的治疗(100 ng / mL), p38 MAPK的磷酸化,ERK1/2,和我κBα在BEAS-2B显著增强细胞与嗜酸性粒细胞coculture 30和60分钟,甚至ERK1/2明显磷酸化在15分钟。p38 MAPK和ERK1/2显著磷酸化BEAS-2B细胞的嗜碱粒细胞和BEAS-2B coculture 30和60分钟在光(100 ng / mL)刺激(数字6 (c)和6 (d))。

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图6
ERK1/2 p38 MAPK的磷酸化,和我κBαBEAS-2B细胞的coculture嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和BEAS-2B细胞与光的刺激。BEAS-2B细胞(1×105细胞)和嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞(3×105细胞)是培养在一起或分别有或没有光刺激(100 ng / mL)对不同时间点(0,15、30和60分钟)。磷酸化的胞内表达(p) p38 MAPK pERK1/2,πκBα(一)permeabilized嗜碱粒细胞和(b)嗜酸性粒细胞没有coculture,和(c) pp38 MAPK, (d) pERK1/2, (e)πκBα在有或没有的permeabilized BEAS-2B细胞coculture嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞被细胞内免疫荧光染色使用流式细胞仪测量。结果显示在MFI和表示为三个独立实验的算术平均值+ SEM和三个血液样本在条形图。* ,* * 与coculture相比对照组。BAS:嗜碱粒细胞;Eosi:嗜酸性粒细胞;BS: BEAS-2B细胞。
3.7。信号传导抑制剂对光照的影响粘附分子和细胞因子/趋化因子

p38 MAPK抑制剂SB203580 (7.5μM)和ERK抑制剂U0126 (10μM)可以显著抑制光致表达式的ICAM-1 BEAS-2B细胞与嗜碱粒细胞coculture(图7(一))和il - 6的释放,CXCL8 MMP-9 coculture(数字7 (b),7 (c),7 (d))。p38 MAPK抑制剂SB203580 (7.5μ米)、ERK抑制剂U0126 (10μM)和NF -κB抑制剂bay11 - 7082 (1μ米)可以显著抑制光致表达ICAM-1 BEAS-2B细胞(图7 (e))和il - 6的生产(图7 (f)coculture)的嗜酸性粒细胞和BEAS-2B细胞。

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图7
影响信号分子的抑制剂在细胞表面表达ICAM-1和诱导细胞因子/趋化因子从coculture BEAS-2B细胞和嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞的光(100 ng / mL)。Cocultures (a, b, c, d)嗜碱粒细胞或(e, f)嗜酸性粒细胞(3×105细胞)和支流BEAS-2B细胞(1×105细胞)使用bay11 - 7082 (1μSP600125(3米)μSB203580(7.5米)μ米),U0126 (10μ米),或LY294002 (10μ米)1 h,其次是孵化有或没有光(100μg / mL)在抑制剂的存在进一步的24小时。细胞表面的表达ICAM-1 5000细胞,流式细胞仪分析了MFI。结果表示为平均+三个独立实验的扫描电镜和三个血液样本在条形图。释放细胞因子/趋化因子和文化MMP-9上层清液被Milliplex试验测量。结果表示为平均+ SEM。DMSO溶液(0.1%)被用来控制车辆。* ,* * 与汽车相比还是消极的控制。

4所示。讨论

气道的结构改造涉及到细胞外基质蛋白的积累和平滑肌增厚(1]。我们发现过敏与哮喘有关的嗜碱粒细胞和嗜酸性粒细胞持续表达HVEM(图1),一个配体光气道重塑的细胞因子。支气管上皮BEAS-2B细胞也表达了HVEM, LTβR,另一个HVEM配体,BTLA [17]。因此,光可以发挥免疫调节作用的激活嗜碱粒细胞/ eopsinophils互动与支气管上皮细胞在气道重塑。目前的在体外研究表明,肿瘤坏死因子家族成员光可以显著促进细胞表面粘附分子的表达ICAM-1, airway-remodeling细胞因子il - 6的释放,趋化因子CXCL8,细胞外蛋白酶MMP-9从人类支气管上皮细胞的相互作用与哮喘有关的嗜碱粒细胞和嗜酸性粒细胞。因为嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞细胞数量的增加可以提高ICAM-1 BEAS-2B细胞上的表达,并使用transwell插入细胞间相互作用的破坏可能显著下调ICAM-1表情BEAS-2B细胞(数字2 (d)和2 (e)),调节ICAM-1表情BEAS-2B细胞是依赖于嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和BEAS-2B细胞之间的直接交互。

如图2 (e),有一个显著的增加ICAM-1表情BEAS-2B与嗜酸性粒细胞与光线刺激后的存在transwell插入,这表明可溶性因素也与ICAM-1的规定。因为ICAM-1的直接交互和CD18已被证明调解嗜酸性粒细胞粘附到支气管上皮细胞(27),BEAS-2B能力的增加与嗜酸性粒细胞粘附可以部分解释为调节ICAM-1 BEAS-2B与嗜酸性粒细胞与光刺激。然而,高附着力BEAS-2B和嗜碱粒细胞之间也可以观察到,甚至ICAM-1表达式之间的相似(i) BEAS-2B coculturing嗜碱粒细胞使用transwell插入(图2 (d))和(2)BEAS-2B细胞被光线刺激(图2 (b)),从而表明coculture其他因素,除了粘附分子ICAM-1,部分导致了细胞间粘附。进一步的研究可能需要充分阐明生化机制嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞BEAS-2B上细胞的粘附。

il - 6可以增强胶原蛋白的合成,生产组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)和(气道高反应28- - - - - -30.]。在成纤维细胞表达il - 6与纤维化相关(28]。通过引起气道平滑肌细胞增殖和迁移,CXCL8已被证明是一个潜在的趋化因子对气道重塑31日]。CXCL8释放人类支气管上皮细胞对白三烯D4刺激参与哮喘气道重塑epithelial-mediated通过EGF受体的激活(32]。MMP-9显著增加在支气管肺泡灌洗液(BALF)和痰从过敏性哮喘患者33,34]。循环水平的升高MMP-9也见于患有哮喘恶化[35]。此外,在哮喘病人过敏原挑战诱发MMP-9表达式在气道36]。MMP-9-deficient老鼠挑战卵白蛋白表现出更少的支气管旁肝纤维化、肺总胶原蛋白相比ovalbumin-challenged野生型(37]。这些结果表明MMP-9参与调停allergen-induced气道重塑(37]。在一起,诱导il - 6, CXCL8, MMP-9建议光可能通过激活气道重塑中发挥重要作用的嗜碱粒细胞和嗜酸性粒细胞与支气管上皮细胞相互作用。

有三种亚型的TGF -β在正常的人类肺,TGF -β1与支气管上皮细胞有关,气道平滑肌细胞、纤维母细胞和细胞外基质(ECM) (38- - - - - -41]。TGF -β1级增加BALF的哮喘病人42),哮喘动物模型也显示增加水平的TGF -β1在BALF和组织43,44]。老鼠接受anti-TGF -β抗体明显减少支气管旁ECM的沉积,气道平滑肌细胞的增殖,在肺粘液生产(45]。TGF -β诱导基质金属蛋白酶的表达和TIMPs,两个都是ECM主要监管机构(46]。ECM的沉积会导致哮喘患者的纤维化(47]。TGF -β1起着重要的作用在调节气道重塑。在目前的研究中,BEAS-2B细胞被发现释放TGF -β1;然而,TGF -的水平β1似乎并没有受到光或嗜碱粒细胞和嗜酸性粒细胞的交互(数据没有显示)。已经表明,periostin matricellular蛋白质可以与细胞表面整合素分子,可以参与组织发展和改造(48,49]。然而,在目前的研究中,水平periostin由ELISA检测不到(数据没有显示)。此外,其他气道remodeling-related细胞因子和生长因子包括IL-5 IL-9, IL-13,表皮生长因子,VEGF无法在目前的研究中发现。这些介质的表达在未来应进一步调查在活的有机体内研究使用小鼠模型,以更好地阐明具体的交互效应嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞在气道重塑和炎症。

我们之前对气道炎症的研究表明,il - 6的感应和CCL2嗜碱粒细胞和支气管上皮细胞的相互作用下IL-17A刺激被ERK不同监管,物,p38 MAPK和NF -κB通路(24]。在本研究调查中涉及的信号通路相互作用的嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞和人类支气管上皮细胞在光刺激,一些特定的信号分子抑制剂被用来阻止通路。NF -κB抑制剂bay11 - 7082、ERK抑制剂U0126和p38 MAPK抑制剂SB203580不同抑制光致ICAM-1, il - 6, CXCL8, MMP-9 coculture嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞和BEAS-2B细胞(图7)。一起在图的结果6关于LIGHT-mediated ERK的活化,p38 MAPK和NF -κB仅在嗜酸性粒细胞和coculture BEAS-2B细胞,结果表明,诱导气道重塑ICAM-1和释放的细胞因子il - 6,趋化因子CXCL8,细胞外蛋白酶MMP-9光控coculture嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和BEAS-2B细胞不同受细胞内NF -κB、ERK和p38 MAPK通路,可能通过调节下游转录因子和/或微rna (22,50]。这些在体外机械的结果实际上是符合我们之前发表的结果表达的细胞因子/趋化因子和粘附分子coculture嗜酸性细胞和嗜碱性细胞和支气管上皮细胞的不同规定不同的信号分子激活配置文件(22- - - - - -24]。因为目标信号分子可以是哮喘的治疗新策略51),不同信号通路之间的潜在的相声和下游分子调节机制有待进一步的研究。

5。结论

总之,气道重塑的表达粘附分子ICAM-1气道remodeling-related的释放细胞因子il - 6,趋化因子CXCL8,细胞外蛋白酶MMP-9和细胞间粘附明显增强的coculture嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞通过调节不同的细胞内信号转导机制。我们之前的研究也表明,支气管上皮细胞和嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞之间的相互作用可以诱导释放多种炎症介质参与过敏性哮喘通过调节表达粘附分子和信号通路的调制(22,23]。MMP-9等介质的释放,il - 6, CXCL8激活受光应该为气道重塑。然而,无论是光信号通过HVEM嗜碱粒细胞/嗜酸性粒细胞和/或LTβR对上皮细胞的直接或间接后果涉及其他受体介导机制需要进一步调查。然而,目前细胞机械的结果可能以某种方式阐明气道重塑的潜在的治疗目标。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

淮河Na秋、春郭黄分享这篇论文的第一作者。

确认

这项工作是由一个直接拨款支持香港中文大学的研究(项目代码:4054060)。