文摘

血吸虫病是一种慢性炎症性疾病的巨噬细胞参与免疫病理调制。尽管P2X7受体信号在炎症反应中起着重要的作用由巨噬细胞,没有报告检查P2X7受体在巨噬细胞功能的作用在血吸虫病。因此,我们评估P2X7受体功能腹膜巨噬细胞在血吸虫病使用ATP-induced透化作用的分析和测量细胞内Ca^{2 +}浓度。ATP治疗诱导的巨噬细胞透化作用明显不足美国曼来华的老鼠比在控制细胞未受感染的动物。此外,P2X7-mediated增加细胞内钙^{2 +}水平也降低了感染小鼠的巨噬细胞。TGF -β1水平增加腹腔感染动物,和预处理控制与TGF -巨噬细胞β1降低ATP-induced透化作用,模仿的效果美国曼感染。免疫印迹和中存在数据显示没有区别P2X7蛋白质和未感染之间的信使rna,感染,和TGF -β1-treated组。然而,免疫荧光分析显示减少细胞表面的本地化P2X7受体在巨噬细胞感染和TGF -β1-treated老鼠相比,控制。因此,我们的数据表明,血吸虫病减少腹膜巨噬细胞P2X7受体信号。这种效应可能是由于这一事实被感染的老鼠增加了水平的TGF -β1,减少P2X7受体细胞表面表达。

1。介绍

巨噬细胞是塑料吞噬细胞参与先天和适应性免疫,对额外有重要角色的反应和细胞内的寄生虫,以及在组织内稳态1,2]。这些细胞在急性和慢性炎症有复杂的函数。巨噬细胞在炎症病灶,导致安装特定的免疫反应对宿主防御,和巨噬细胞的表型可塑性的细胞因子调节的概要文件(1]。

在炎症组织损伤否则细胞内分子的细胞外水平增加,导致有关分子模式(抑制)被免疫系统3- - - - - -5]。细胞外核苷酸,如由死细胞ATP释放和激活免疫细胞在炎症,是重要的危险信号参与免疫反应(6),参与两个旁分泌(7和自分泌8信号通路。在炎症过程中,高细胞外ATP水平所产生的组织损伤或分泌被免疫系统作为一个危险的信号,激活purinergic P2受体导致促炎反应(9]。

Purinergic P2受体可分为ionotropic ATP-gated (P2X)或g蛋白耦合metabotropic (P2Y) [10]。细胞外ATP (eATP)诱发macrophage-mediated P2X7受体的免疫反应主要是通过激活(11]。这些受体有无处不在的分布,虽然受体表达的最高水平观察单核细胞/巨噬细胞的免疫细胞起源(12]。P2X7受体激活引发无数的细胞内事件,包括一氧化氮(NO)的生产和活性氧(ROS)的激活phospholipase-D(骑士)。这些事件是重要的细胞内寄生虫杀死,促炎细胞因子的释放(如il - 1β),诱导细胞凋亡(13,14]。

P2X7受体的表达和功能都受到支持和抗炎症刺激15]。最初,P2X7受体激活巨噬细胞的质膜离子通道打开,允许K的大量流出⁺,涌入的Ca^{2 +},后来形成的毛孔渗透大分子(16,17]。P2X受体激活也可能诱发caspase-1激活,白介素il - 1β释放,细胞凋亡,phagolysosomal融合,消除细胞内病原体(14,18,19]。在小鼠巨噬细胞,成熟的il - 1β分泌P2X7受体的激活是减少free-Ca孵化^{2 +}缓冲(20.]。因此,小鼠巨噬细胞释放il - 1的成熟β取决于细胞内钙^{2 +},确认^{2 +}信号对这个P2X7受体功能至关重要。

血吸虫病是一种慢性炎性疾病所致曼氏裂体吸虫它是第二个最常见的热带寄生虫病与socioeconomical因素有关。而通过受感染哺乳动物宿主的血管系统迁移,寄生虫从schistosomula迁移形式发展为成虫,导致内皮细胞激活,免疫反应和组织损伤。疾病开始Th1-type免疫反应,逐渐改变Th2概要文件(21- - - - - -24]。之前的数据显示,Th2“阶段”开始在感染后四到六周,成虫产卵有关。

巨噬细胞扮演重要角色在血吸虫病的两个阶段24]。在疾病的早期阶段,巨噬细胞作为免疫系统感受器细胞杀死schistosomula和促进组织修复(24]。产卵后,免疫反应开关Th2概要文件,参与肝脏和结肠肉芽肿的形成和纤维化。它们将卵产在肠系膜微循环,他们可能达到腹膜腔的肉芽肿形成包含主要是巨噬细胞(25]。尽管肉芽肿是重要的限制蛋类来源的潜在细胞毒性产品,巨噬细胞孤立的,例如,从肝肉芽肿,产生脂质介质和自由基潜在破坏性的宿主组织(26]。在细胞因子参与血吸虫病、转化生长因子-β1 (TGF -β1)是特别感兴趣的,因为高水平的细胞因子释放到外周血单核细胞(PBMCs)美国曼来华的老鼠(27]。TGF -β有一个重要的角色在感染免疫调制后,限制肝脏炎症和有利于宿主生存27,28]。

最近,Bhardwaj和史盖(29日)表明,美国曼表达P2X7 receptors-like分子和酶负责清除细胞外ATP (ectonucleotidases),这表明purinergic信号在这些寄生虫是守恒的,开始相互作用是非常重要的。然而,慢性炎症的影响三角血吸虫病在巨噬细胞P2X7受体功能仍然是未知的。

在这里,我们评估P2X7受体功能和巨噬细胞中表达美国曼来华的老鼠。我们的数据表明,腹膜巨噬细胞P2X7受体在血吸虫病功能减弱,这是与腹膜TGF -水平高有关β1,重要的炎性介质出现在慢性疾病的阶段。我们还表明,TGF -β1会使P2X函数在体外,模仿的效果美国曼感染。

2。材料和方法

2.1。试剂和抗体

以下主要抗体被用于这项工作:兔多克隆anti-P2X7受体(008年4月- 004年4月;Alomone实验室、以色列);鼠单克隆抗β肌动蛋白(美国圣克鲁斯生物技术);老鼠anti-F4/80(美国Biolegend);老鼠anti-F4/80 FITC(美国AbD Serotec)。(ATP, 3′- o) - 4-benzoyl ATP (BzATP) PMSF,原钒酸钠,抑肽酶,亮抑酶肽,BSA, ionomycin, EGTA从西格玛化工有限公司(美国)。Fura-2-AM是从分子探针(美国)和A740003是从Tocris(美国)。RPMI、胎牛血清(的边后卫)和青霉素、链霉素的解决方案来自GIBCO BRL(美国)。TGF -β1从研发系统(明尼阿波利斯,美国)。股票的解决方案准备在DMSO(2.5毫米Fura-2-AM和10毫米A740003),水(10毫米BzATP), RPMI (5 ng / mL TGF -β1),或者一个缓冲生理盐水(10毫米ATP)。溶剂使用的最高浓度为0.1% (v / v)。其他试剂均为分析纯。

2.2。老鼠

瑞士、C57BL / 6(野生型)和P2X7受体敲除(P2X7 KO)雄性小鼠被用于所有程序。瑞士和C57BL / 6小鼠经动物设施的保罗·德·是微生物学研究所(里约热内卢联邦大学的里约热内卢,巴西)。P2X7 KO小鼠(来自杰克逊实验室,美国股票数量005576)保持在转基因动物里约热内卢联邦大学的。所有老鼠都保存在一个光/暗周期的12/12 h和提供水和食物随意。

所有实验符合道德标准的机构(里约热内卢联邦大学的伦理委员会;批准许可下dfbc icb - 011和IBCCF - 154)和后两个国家实验动物管理委员会的指导方针(CONCEA、巴西)和保健委员会和使用实验动物(美国国家研究委员会)。都是努力减少动物痛苦和实验用动物的数量的基础上有效的统计评估。

2.3。寄生虫和感染

在这项工作中,我们使用BH的应变美国曼,获得感染Biomphalaria glabrata蜗牛。瑞士、C57BL / 6和P2X7 KO小鼠经皮(7 - 10天)被感染的大约80 cercariae两性,8分钟,如前所述30.]。用于实验动物感染后至少45天(dpi),以便全面建立感染。年龄(60 - 80天)感染瑞士、C57BL / 6和P2X7 KO小鼠作为控制。C57BL / 6和P2X7 KO小鼠生存在感染期间被评估。

2.4。腹膜巨噬细胞

获得小鼠腹腔巨噬细胞,动物麻醉,牺牲了颈椎错位,并与70%乙醇清洗。5毫升的腹膜腔被无菌磷酸盐缓冲盐(氯化钠PBS: 137毫米,8.1毫米Na₂HPO₄1.5毫米,不₂阿宝₄2.7毫米氯化钾,pH值7.4),腹膜渗出物收集和离心机在350×g, 5分钟,在4°C。1毫升的颗粒是resuspended PBS和用于执行总白细胞计数(细胞生存能力,估计通过台盼蓝排斥,总是≥95%)。巨噬细胞培养,细胞resuspended 1毫升的rpmi - 1640中含2 g / L碳酸氢钠,1毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素和镀在35毫米培养皿或6-well盘子。1 h孵化后37°C公司为5%₂不依从细胞被剧烈的洗涤,rpmi - 1640中10% heat-inactivated的边后卫是添加到文化,这是保持在37°C公司为5%₂24小时直到进一步的使用。

2.5。ATP-Induced透化作用分析

探讨巨噬细胞反应ATP,刚收获的腹膜巨噬细胞(10⁵细胞)瑞士(未感染或美国曼来华的)或C57BL / 6(野生型或P2X7 KO)小鼠接受0.1,0.5,ATP和2.5或1毫米μ在PBS M溴化乙锭(EB)(15分钟;37°C)。海尔哥哥被用作示踪P2X7受体激活(即。,细胞透化作用)由ATP。与ATP和EB孵化后,F4/80阳性细胞分析流式细胞术(10000事件/样本)使用FACScan系统(美国BD Pharmingen)。流式细胞仪使用WINMDI 2.9软件进行数据分析。在每一个柱状图,标记添加基于门F4/80阳性巨噬细胞的人口,这限制了基底荧光。具体ATP-induced透化作用阈值定义相比控制细胞的“基线”配置文件不接受ATP(即。,与EB)孵化。具体透化作用的比例是EB阳性细胞ATP刺激后F4/80积极封闭的细胞。

另外,腹膜巨噬细胞被镀在24-well板块(2×10⁵细胞/),24小时之后,处理5 ng / mL TGF -β1或车辆(RPMI), 24 h,在37°C和5%股份有限公司₂。巨噬细胞在PBS洗(pH值7.4),然后用1毫米孵化ATP和5μ米海尔哥哥缓冲区(145毫米氯化钠,氯化钾5毫米,1毫米MgCl₂,1毫米CaCl 10毫米玫瑰,pH值7.4)为15分钟37°C评价P2X7受体激活。permeabilized之间的比率(即。,EB positive) and total cells was determined by direct counting of cells in five randomly chosen fields, using an Axiovert 100 microscope (Karl Zeiss, Oberkochen, Germany) equipped with an Olympus digital camera (Olympus American Inc., PA, USA). The specific ATP-induced permeabilization value (in %) was calculated by subtracting from the total % of permeabilized cells a “baseline” value corresponding to the % of permeabilized cells in control samples not treated with ATP (i.e., incubated with EB only).

2.6。测量(Ca^{2 +}]_我在巨噬细胞

测量细胞内Ca^{2 +}浓度([Ca^{2 +}]_我)使用Fura-2-AM进行如前所述[31日]。短暂,巨噬细胞被镀在玻璃底板块(美国MatTek), 1×10的密度⁵细胞/板,维持24小时在37°C,公司为5%₂。然后,介质被除去,细胞被孵化与2.5 40分钟μ在室温下M Fura-2-AM。细胞受到交替周期的照明与340 nm和380 nm激发波长和发射测量在500海里。细胞与生理的缓冲溶液洗两次(140年在mM:氯化钠,氯化钾,MgCl₂1,CaCl₂2、葡萄糖5,玫瑰5 pH值7.4),然后用100刺激μ(米3′- o) - 4-benzoyl atp (BzATP)(在37°C)没有或在50 nM P2X7受体拮抗剂A740003 (preincubated 45分钟,在37°C)。最大的效果已经实现后,细胞治疗与Ca^{2 +}离子载体(10μM ionomycin),然后用6毫米EGTA决定Ca的摩尔浓度^{2 +}根据Grynkiewicz方程(32]。

2.7。测定TGF -β1水平

TGF -的估计β1水平使用ELISA免疫小鼠腹膜洗了(美国新泽西Peprotech,落基山),根据制造商的指示。腹膜洗集合,小鼠安乐死有限公司₂和腹腔被1毫升无菌PBS。大约60%的初始体积PBS的恢复和离心5分钟350克、在4°C。上层清液收集并存储在液体N₂直到进一步使用(确定TGF -β1内容)。

2.8。共焦显微镜

从控制和受感染的小鼠腹腔巨噬细胞(10⁵细胞/)处理5 ng / mL TGF -β24 h,固定与4%多聚甲醛和4%蔗糖在PBS 10分钟,洗净,孵化为30分钟50 mM氯化铵(pH值8.0)。在PBS三洗后,样品被封锁在PBS 10%的边后卫和0.1% BSA为30分钟,在PBS洗两次,孵化隔夜的兔多克隆抗体识别P2X7受体的细胞外抗原决定基(apr - 008;Alomone实验室,以色列;肽KKGWMDPQSKGIQTGRC,对应氨基酸残基136 - 152鼠标P2X7受体;细胞外循环)稀释1:400年BSA PBS和0.1%。然后,细胞被清洗和孵化与一只老鼠anti-F4/80抗体稀释1:50 PBS和0.1% BSA 4 h,在4°C。样本然后贴上二级anti-rabbit-Alexa 488年和546年anti-rat-Alexa抗体稀释1:500年PBS和0.1% BSA 1 h在4°C。二次抗体被用于初级抗体-控制的缺失。标签后,细胞被安装在幻灯片用Vectashield DAPI(美国向量,伯林盖姆,CA)和检查TCS-SP5 aob共焦显微镜(德国徕卡微系统)。使用ImageJ图像分析软件。 Each cell micrograph was analyzed using ImageJ software (Rasband, W.S., ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA,http://imagej.nih.gov/ij/,1997 - 2014)。感兴趣的区域(ROI)在每个细胞分隔,各自的平均荧光强度测量基于像素强度。10细胞/图像进行评估和荧光值被用于统计分析。数据也显示在正交切片视图显示原始像素强度值相互发现的三个垂直的平面。

2.9。西方墨点法

巨噬细胞坚持6-well盘子洗了无菌PBS和与200细胞溶解μL•瑞帕缓冲区(50毫米Tris-HCl, pH值7.4,含1%诺乃清洁剂P40、0.25%钠脱氧胆酸盐,150毫米氯化钠,EDTA 1毫米,1毫米PMSF, 1毫米原钒酸钠,氟化钠1毫米,10μ10 g / mL抑肽酶,μg / mL亮抑酶肽)。细胞溶解产物在4°C孵化8100 g×30分钟和离心机,10分钟,在4°C;球被丢弃和上层清液的蛋白质含量由洛瑞法(33]。样本运行在sds - page凝胶(15 10%μg蛋白/ lane),然后转移到硝化纤维膜用半干的传输系统。膜被封锁的1 h Tris-buffered盐水(TBS) 2%脱脂牛奶然后孵化隔夜兔子anti-P2X7受体(apr - 004;Alomone实验室,以色列;1:200;肽(C) KIRKEFPKTQGQYSGFKYPY,对应氨基酸残基576 - 595 P2X7受体的细胞内,或鼠标单克隆抗糖)β肌动蛋白(1:20.000)主要抗体。在TBS-Tween 3洗后,膜与HRP-conjugated孵化anti-rabbit或anti-mouse二级抗体(1:1.000)1 h和开发使用增强化学发光(ECL)。朱红色染色和标记单克隆抗-β肌动蛋白抗体被用作蛋白质内部控制加载。微的蛋白质乐队使用ImageJ执行软件,和的值相对大量的蛋白质被规范化β肌动蛋白加载控制。

2.10。实时定量PCR(存在)

从感染腹膜巨噬细胞瑞士老鼠(处理5 ng / mL TGF -β1或车辆,24 h)或从美国曼来华的老鼠被用来分离总RNA使用试剂盒试剂(技术),根据制造商的指示。总RNA量化使用nd - 1000分光光度计(NanoDrop),和500 ng的总RNA的互补脱氧核糖核酸合成使用高容量cDNA逆转录工具包和核糖核酸酶抑制剂(表达载体)。SYBR选择主(应用生物系统公司)是用于混合存在,检测双链DNA合成。反应进行了最后的10μL使用2μL稀释cDNA(1: 10)和300 nM的反向和正向引物。以下引物被用于存在:P2rx73′,5′AATCGGTGTGTTTCCTTTGG(向前)和5′CCGGGTGACTTTGTTTGTCT 3′(反向);为Actb3′,5′TATGCCAACACAGTGCTGTCTGG(向前)和5′TACTCCTGCTTGCTGATCCACAT 3′(反向);和Gapdh3′,5′GGTCATCCCAGAGCTGAACG(向前)和5′TTGCTGTTGAAGTCGCAGGA 3′(反向)。

反应进行了在7500年快速实时系统(应用生物系统公司),使用下面的PCR条件:5分钟在95°C,紧随其后的是40 15秒的周期在95°C, 35 s 60°C, 15秒72°C。自行车协议,年底熔化曲线分析(荧光测量从60岁提高到99°C)。相对表达水平测定使用序列检测软件v.2.0.5(应用生物系统公司),计算每个样本和效率是使用LinRegPCR 11.0软件(制造商)。β肌动蛋白和Gapdh被用作内部控制计算相对P2rx7信使rna水平,通过比较阈值周期(与效率修正)方法,使用每个扩增子的意思存在效率,如前所述[34,35]。

2.11。统计分析

数据被表示为均值和SEM。两个或两个以上的团体之间的差异被学生的分析以及或单向方差分析(方差分析)其次是事后Newman-Keuls试验,分别考虑。

3所示。结果

3.1。P2X7受体在腹膜巨噬细胞功能降低血吸虫病

我们用几种方法研究引发的慢性炎症的影响美国曼感染巨噬细胞P2X7受体的功能。P2X7受体的激活ATP打开质膜孔,使分子大于900 kDa(如荧光染料EB)进入细胞(17,36]。因此,我们使用ATP-induced细胞透化作用(就是明证与EB染色)作为一种工具来比较P2X7受体激活腹膜巨噬细胞感染和未感染瑞士老鼠。孵化项目,0.1 - 1毫米ATP诱导细胞透化作用从感染小鼠巨噬细胞;然而,这种效应是减少从受感染的小鼠巨噬细胞(图1(一))。ATP也感应透化作用C57BL / 6野生型小鼠的巨噬细胞,但正如预期的那样,不是从P2X7 KO小鼠巨噬细胞(图1 (b))。

我们也使用了强大的P2X7受体激动剂BzATP验证如果P2X7受体激活增加了胞质Ca^{2 +}集中感染和未感染的巨噬细胞瑞士老鼠,因为ATP-induced Ca^{2 +}涌入是P2X7激活的标志(36]。胞质Ca的基础水平^{2 +}(BzATP除了之前)在两组(图中是相似的2(一个))。治疗后与100年μM BzATP,未受感染的小鼠巨噬细胞显示一个典型的P2X7受体激活配置文件在37°C,具有明显的两相的增加细胞内钙^{2 +}水平(图2(一个))[36]。然而,P2X7受体介导^{2 +}涌入大大减少明显的巨噬细胞被感染的老鼠相比,观察巨噬细胞从老鼠无毒性(数字2(一个)和2 (b))。我们也评估细胞内钙的变化^{2 +}在选择性P2X7受体拮抗剂A740003的存在。治疗50 nM A740003没有改变基底细胞内Ca^{2 +}水平,但它有强烈的负面影响BzATP-induced Ca^{2 +}涌入,这种效果是类似于从两组巨噬细胞。这些结果证实,细胞内钙的增加^{2 +}水平后添加BzATP P2X7受体激活。这些数据在赞同削减ATP-induced透化作用观察巨噬细胞从受感染的老鼠(图1(一)),表明P2X7受体信号在血吸虫病表达下调。

3.2。美国曼来华的老鼠有更高水平的腹膜TGF -β1,与P2X7-Dependent减少巨噬细胞透化作用有关

抗炎细胞因子TGF -β1防止P2X7受体upregulation在单核细胞(37]。此外,在血吸虫病的慢性阶段,逐渐增加的血清Th2细胞因子(21]。事实上,我们观察到显著增加TGF -β在小鼠的腹腔感染1水平美国曼(图3)。

调查如果TGF -β1可以调节P2X7受体功能腹膜巨噬细胞单核细胞[所描述的相似37),我们收获腹膜巨噬细胞未受感染的动物和治疗这些细胞与5 ng / mL TGF -β1 24小时之前评估他们对ATP-induced透化作用(利用EB作为示踪剂)。在缺乏ATP, TGF -β1治疗不诱导细胞透化作用;然而,TGF -β1 1毫米ATP的permeabilizing效应减少了约50%,相比只控制ATP处理(图4)。我们还进行了TGF - 48 h后透化作用β治疗,我们观察到,即使48 h后,P2X7-induced透化作用也减少(数据未显示)。量效曲线的分析使用不同浓度的TGF -β只显示5 ng / mL浓度和10 ng / mL能够减少巨噬细胞的透化作用强度(数据没有显示)。

3.3。P2X7受体蛋白质和mRNA水平感染后不改变美国曼与TGF -或治疗β1

评估是否减少P2X7受体功能观察在血吸虫病和TGF -β1-treated细胞是由于,至少在某种程度上,对P2X7受体表达的变化,我们量化P2X7蛋白质表达和转录的P2rx7分别由免疫印迹位点和存在。我们发现类似P2X7蛋白质和mRNA水平巨噬细胞感染和感染组(数字5(一个)和5 (c))。此外,P2X7蛋白质的水平和mRNA在巨噬细胞未受感染的老鼠不改变治疗5 ng / mL TGF -β1 24 h(数字5 (b)和5 (c))。

3.4。TGF -血吸虫病和治疗β1降低细胞表面P2X7水平腹膜F4/80积极的巨噬细胞

P2X7受体的转译后的修改目标控制自己插入质膜(38],P2X7受体的促炎效应(包括il - 1β释放,没有和ROS生产)取决于受体定位在细胞表面。此外,长期接触巨噬细胞ATP可能诱发P2X7受体清除内化(从细胞表面39,40]。

由于减少P2X7函数中美国曼感染并不是由于蛋白质或mRNA水平降低,我们假设受体结构或本地化的变化发生在感染和表达下调受体功能,类似于其他描述P2X受体(41]。为了验证这个假设,我们分析了P2X7受体定位在nonpermeabilized F4/80(一种常见的成熟巨噬细胞表面标记)正从感染巨噬细胞美国曼来华的老鼠用抗体能识别细胞外P2X7抗原决定基。共焦显微镜分析anti-P2X7标记细胞表明,细胞表面的水平P2X7受体减少巨噬细胞从受感染的老鼠(数据6(一)和6 (b))。有趣的是,还有减少巨噬细胞的细胞表面P2X7未受感染的老鼠接受TGF -β1(数据6(一)和6 (b))。免疫荧光的相对量化数据显示有一个减少1.6倍(大约)在巨噬细胞细胞表面P2X7荧光强度受感染小鼠,观察相比,感染控制老鼠(图6 (b))。

3.5。减少P2X7 KO小鼠感染的生存美国曼

接下来,评估疾病P2X7受体的参与,我们感染C57BL / 6 KO小鼠和野生型和P2X7后感染的进展。生存曲线显示死亡率P2X7 KO小鼠感染开始28 dpi 60 dpi和达到100%。相比之下,没有死亡C57BL / 6野生型小鼠(图中观察到7)。

4所示。讨论

在血吸虫病,巨噬细胞表型可能显示古典或激活。后者表型存在主要在肝脏内巨噬细胞周围的卵肉芽肿和最近被证明是重要的控制的组织纤维化(42]。考虑到血吸虫病是一种慢性炎性疾病,巨噬细胞参与血吸虫病发病机理(24),我们试图评估P2X7受体的功能在巨噬细胞从老鼠感染美国曼,因为这些受体在炎症过程发挥重要作用。

在这里,我们使用的组合ATP-induced透化作用和细胞内钙^{2 +}测量分析表明,血吸虫病的慢性阶段期间,有一个减少ATP-dependent P2X7受体在巨噬细胞(数据的函数1和2),类似于观察肠系膜内皮细胞使用相同的实验模型(43]。

而巨噬细胞的功能和表达P2X7受体的积极管理促炎细胞因子,如干扰素-γ(44,45),Gadeock和同事(37]表明P2X7受体的upregulation THP-1单核细胞负受TGF -β。另一方面,外周血单核细胞(PBMCs)美国曼来华的小鼠产生高水平的TGF -β(27细胞因子),这是很重要的限制肝脏炎症和有利于宿主生存27,28]。总体而言,这些数据是在协议与我们的结果还表明腹膜TGF -的水平β1增加小鼠感染美国曼(图3),TGF -β1,浓度接近的慢性病人的血清中观察到(46),减少了大约50%的P2X7-dependent巨噬细胞透化作用引发的ATP(图4),模仿减毒P2X7响应期间观察到的美国曼感染(图1(一))。综上所述,这些研究结果支持我们的假设P2X7函数的差别,对这些基因在血吸虫病是由于增加的TGF -β在感染1水平。关于TGF -β的水平,尽管之间的差异在体外治疗(5 ng / mL)和浓度在活的有机体内腹膜测量(100 pg / mL),我们必须考虑注射1毫升的PBS在删除之前的腹腔感染动物的体液细胞因子的决心。因此样本稀释,因此,腹膜TGF -β水平在活的有机体内可能高于估计在体外。此外,之前的数据显示,个人长期感染血吸虫病TGF -β血清水平大约20 ng / mL [46)和血清水平的估计美国曼来华的老鼠(ng / mL)兼容的价值中观察到患者(47]。因此,我们得出这样的结论:TGF -β集中在目前的工作是兼容使用疾病,和腹膜TGF -β浓度受感染动物可能比预计的还要多。最后,TGF -βng / mL的浓度可以调节P2X7R函数。

西方墨点法和存在的数据(使用完整的细胞溶解产物)排除这样一种可能性,即减少P2X7受体在函数美国曼感染或治疗后与TGF -β1 P2X7蛋白质或mRNA水平降低造成的。事实上,免疫荧光显微镜分析nonpermeabilized巨噬细胞表达在细胞表面F4/80透露,有一个低密度的表面P2X7受体在细胞从未受感染的老鼠相比,控制动物(图6)。自P2X7总蛋白水平在两组相似,我们建议减少P2X7受体在质膜感染小鼠的巨噬细胞。从质膜免疫反应性的消失可能与某些受体的构象变化,与其他蛋白质掩蔽的交互识别的细胞外表位抗体或P2X7受体内化。然而,TGF -β治疗在体外模仿细胞表面受体表达减少和功能观察巨噬细胞从受感染的动物。因此,减少的合理解释P2X7函数(没有相应减少总蛋白质或mRNA水平)在慢性血吸虫病可能与降低P2X7受体的细胞表面表达。

尽管Gadeock等的工作。37)、数据调查TGF -之间的联系β1和P2X7受体功能和/或表达人仍下落不明。自控制巨噬细胞治疗TGF -β1模仿细胞表面的形象P2X7受体表达和功能观察巨噬细胞从受感染的老鼠获得生活,人们猜测TGF -β1可能参与P2X7受体减少函数中观察到这种疾病。我们所知,这是第一个报告,显示了TGF -的直接影响β1对巨噬细胞P2X7受体功能。然而,我们不排除其他细胞因子可能导致P2X7减少巨噬细胞的功能美国曼来华的老鼠,因为在后期阶段的疾病的增加之外TGF -β还有增加il - 4水平,IL-5, il - 10, IL-13 . .此外,它表明,il - 4和il - 10也抑制EB吸收在大鼠肺泡巨噬细胞(48]。此外,之前的数据显示,TGF -β、il - 10、il - 4抑制巨噬细胞细胞毒性这可能是一个重要的策略美国曼逃避macrophage-mediated免疫破坏(49]。

血吸虫病的患者可能更容易继发感染,和之前的感染裂体吸虫属也会增加二次感染的严重程度利什曼虫、刚地弓形虫和沙门氏菌(50]。此外,以前的报告显示,慢性感染小鼠的巨噬细胞吞噬活动下降(51];然而,对这一现象的机制。最近,威利和顾52]表明P2X7受体表面的单核细胞/巨噬细胞可以作为清道夫受体细菌ATP的缺失。因此,减少P2X7受体功能美国曼来华的动物可能会限制细菌(也可能是原生动物的)吞噬作用在血吸虫病。这种现象可以解释病人感染的易感性增加美国曼与其他寄生虫和继发感染也在这些患者继发感染的严重程度就越高。

Kusner和亚当斯(53)表明,ATP杀死结核分枝杆菌在人类巨噬细胞,这种影响取决于P2X7受体介导骑士激活。这种机制也很重要ATP-mediated杀害沙眼衣原体在小鼠腹腔巨噬细胞13]。此外,我们表明,急性感染的巨噬细胞衣原体psittaci减少P2X7受体介导细胞透化作用和Ca^{2 +}涌入,从而抑制巨噬细胞凋亡(54]。考虑到c . psittaci是必须的细胞内寄生虫,这种现象可能是一个试图限制通过减少ATP-mediated细胞凋亡和免疫反应,因此,支持寄生虫生存。P2X7受体信号中强调的一个重要的新方面目前的工作是,巨噬细胞的功能P2X7受体细胞外寄生虫也可以调制美国曼。

总之,我们的数据表明,在血吸虫病,巨噬细胞的功能P2X7受体减少,TGF -β1起着关键的作用的差别在对这些受体信号。我们假设巨噬细胞purinergic受体不同调制在疾病进展,这种现象在免疫反应对一个关键的角色美国曼。在这种背景下,我们的数据表明,P2X7受体基因敲除动物(P2X7 KO)期间更容易死亡美国曼比WT老鼠感染强调这个P2 purinergic受体和加强未来的研究探索的必要性深陷其重要性美国曼全身疾病。鉴于purinergic信号也发现美国曼之间的相互作用,了解宿主和寄生虫purinergic信号通路是现在重要的澄清如果未来治疗方法针对这些信号通路将针对血吸虫病的有效治疗方法。

5。结论

总之,我们的数据显示美国曼感染减少P2X7函数在腹膜巨噬细胞在慢性疾病的阶段。此外,受感染小鼠的腹腔TGF -水平增加β1,这个细胞因子减少P2X7受体功能未受感染的小鼠的巨噬细胞。因此,由TGF -免疫调节β1可能会限制P2X7-dependent炎性巨噬细胞的影响美国曼病人,可能提供一个解释这些病人感染的易感性增加其他病原体。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢西尔瓦娜博士Aparecida Rogel卡瓦略Thiengo(软体动物学实验室,FIOCRUZ,里约热内卢RJ,巴西)的捐赠cercariae Grasiella诉Matioszek博士(生物医学科学研究所,UFRJ)在共焦显微镜技术援助。本研究支持的慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq), Fundacao卡洛斯恰加斯球场德帕罗尽管Estado里约热内卢(FAPERJ),做项目干扰素有de Excelencia (PRONEX-CNPq)和西班牙帕拉尽管Translacional em Saude e环境na Regiao Amazonica,慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府/ MCT (INCT-INPeTAm / CNPq / MCT),巴西。资助者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。