文摘
与动脉粥样硬化是心血管疾病死亡的主要原因。动脉粥样硬化主要是与血管内皮细胞功能障碍和皮下累积的氧化低密度脂蛋白的形式。在目前的研究中,我们调查的角色髓过氧物酶氧化低密度脂蛋白(Mox-LDL)内皮细胞功能障碍。我们研究了促炎效应Mox-LDL治疗内皮细胞活性,必不可少的一个参数正常血管血管生成和血管修复等过程。这是特别重要的粥样硬化斑块,血管壁的完整性受到影响和干扰其修复可能导致疾病的进展。我们调查了在体外Mox-LDL对内皮细胞血管生成的影响特性,我们还研究了信号通路,可以通过分析影响Mox-LDL angiogenesis-related基因的表达。我们报告Mox-LDL抑制内皮细胞的能动性,通过增加tubulogenesis miR-22和血红素加氧酶1表达。我们的在体外数据显示,Mox-LDL干扰参数与血管生成有关。他们建议患者低密度脂蛋白水平高会损害内皮细胞应对受损内皮细胞的能力造成消极的粥样硬化斑块的进展。
1。介绍
心血管疾病(CVD)是全球死亡的主要原因。根据2005年世界卫生组织报告,CVD负责全球所有死亡的30%。心血管疾病通常源于血管功能障碍,这主要是与动脉粥样硬化有关。氧化的低密度脂蛋白形式的积累(ox-LDL)血管内膜是被广泛接受的粥样硬化斑块的发展发挥着重要作用。低密度脂蛋白粒子氧化原位;少量也可以发现在循环,因此与内皮细胞接触(ECs) [1- - - - - -3]。无论这些粒子被修改,髓过氧化酶(MPO)是现在最好的候选人在活的有机体内演员在低密度脂蛋白修改而其他候选人(如脂肪氧合酶、NADPH氧化酶类和内源性铜)以前被认为(4]。MPO中分泌的一种酶激活中性粒细胞;它会刺激生产过氧化氢和氯的次氯酸。生成的HOCl负责检测的改性氯化检测(HOCl-LDLs) [5]。
此外,血清MPO水平在急性冠状动脉综合征患者不良预后的标志(6]。Mox-LDLs被赋予促炎属性。Mox-LDL确实引发引发基因表达内皮细胞和单核细胞和巨噬细胞,分别(4]。他们也干扰电子商务功能。内皮功能障碍包括招募免疫细胞粘附分子的表达内皮和允许他们进入病变7]。在招募细胞是单核细胞,一旦进入内膜,会分化成巨噬细胞,吞噬硬化的氧化脂蛋白,演变成所谓的泡沫细胞。泡沫细胞积聚导致的动脉粥样化核心的形成将进一步演变成大量的坏死细胞,胆固醇和脂质碎片(8]。这个过程被认为是早期动脉粥样硬化的标志。内皮功能障碍,也阻碍了电子商务能动性和迁移(9,10];EC运动性血管生成的一个基本方面,是一个必要的过程在许多生理和病理过程11- - - - - -13]。也可能是关键的内皮脱皮与循环ECs的存在与许多疾病如血管炎,红斑狼疮,镰状细胞性贫血,地中海贫血,感染性休克,感染(rickettsiae、巨细胞病毒),或癌症(14]。动脉粥样硬化而言,循环ECs与斑块破裂,中风或心肌梗死15]。ECs的物理剥蚀床被描述在粥样硬化斑块位置和本地再生失败的内皮是内皮功能(怀疑是有害的16]。还民国(急性心肌梗死)血管重建手术和支架植入程序已经注定要失败由于再狭窄,被认为是导致内皮再生的能力并治愈剥蚀区13]。另一个现象涉及电子商务增长和支架reendothelialization与心血管疾病有关。最后,大部分的程序参与狭窄或动脉瘤治疗包括导管与血管壁剥蚀(17]。
问题是否氧化低密度脂蛋白,仪器在粥样硬化斑块的形成,也会妨碍愈合的能力相关的内皮损伤是否后续的动脉粥样硬化。为了解决这个问题,我们调查了可能的生理改性低密度脂蛋白对EC的能动性和生存的影响以及基因表达和信号转导。我们报告,病理MPO-modified浓度检测抑制EC迁移和血管生成属性,这依赖于缺陷miR-22和血红素加氧酶1 (HO-1)增加。
2。材料和方法
2.1。细胞培养、基因转染,击倒和超表达
Clonetics HUVEC细胞(Lonza)是完全循证医学Clonetics内皮生长培养基培养(Lonza;猫。号码cc - 312) 37°C, 5% (v / v)有限公司2根据供应商的建议。细胞转染基因进行了使用反式二根据制造商的指示(MobiTec;猫。0102号b)。miR-22选择性击倒和抑制,我们使用[hsa-miR-22 miRCURY LNA microRNA抑制剂]由Exiqon(产品编号411669 - 00)(顺序:AAGCTTGCCACTGAAGAAC)。质量评估的可拆卸的实验中,我们使用一个miRCURY LNA microRNA抑制剂-控制(序列:GTGTAACACGTCTATACGCCCA)。对于HO-1超表达,我们使用了TrueClone pCMV6AC-HMOX1 (NM_002133.1)向量由OriGene (SKU SC320297)。
2.2。使用xCELLigence系统测量细胞的行为
详细的协议是彻底前面描述的18]。简单地说,50μ循证医学的L在室温下添加到每个E-plate 16。E-plate 16然后连接到系统,检查细胞培养孵化器的适当的电触点和背景在24年代阻抗测量。HUVECs resuspended在循证医学和调整到103细胞/µl . 100μL细胞悬液的添加到E-plate 16井和板被放置回孵化器。播种后约24小时,细胞暴露于100年μL中等或中等包含本地控制低密度脂蛋白或Mox-LDL最终浓度为100μ克/毫升。只控制了循证医学媒介。细胞行为监控每20分钟xCELLigence系统在一段时间内48小时通过整合传感器电极阵列的E-Plate 16。电阻抗测量的RTCA-integrated软件xCELLigence系统作为一个无量纲参数称为细胞指数(CI)。
2.3。Tubulogenesis化验
人工基底膜管的形成分析,或者tubulogenesis试验,进行评估的能力HUVECs内皮细胞形成血管结构(或小管)参与血管形成(血管)。如前所述(19),个别井被涂上一层100μL(基底膜基质基底膜矩阵(BD生物科学;猫。356234号)24-well板和允许聚合在37°C 2小时。聚合后,250μL完整的循证医学是添加到每个盘子是孵化一个额外的小时在37°C。HUVECs(治疗或不与本地低密度脂蛋白和Mox-LDL 24小时)然后resuspended在500年μL的完成度(Lonza;猫。cc - 312)(±原生低密度脂蛋白或Mox-LDL最终浓度为100µg / mL),并添加到每个在重复。一夜孵化后,请检查细胞小管形成和图片都来自三个字段的视图使用倒生的光学显微镜与4 x的目标。小管网络长度测量使用图像J程序,视图和重复的字段之间的平均,表示为一个百分比的控制未经处理的细胞。独立实验复制三次。
2.4。Tubulogenesis实时
过程进行了如上所述的异常细胞的37°C条件孵化室AxioVision-Carl蔡司显微镜,显微镜设置为自动拍照每隔10分钟见到段。培养基是缓冲与玫瑰15毫米最终浓度来弥补有限公司2在我们设置不可用。
2.5。在体外愈合试验
HUVEC移民监测使用愈合试验如前所述[20.]。简单地说,细胞/好/ mL被播种在24-well板块在循证医学媒介(±原生低密度脂蛋白或Mox-LDL 100年最终的浓度µg / mL)。24小时孵化后允许细胞附着和组成一个支流单层,这些细胞被刮守恒的宽度用一个黄色的小费。刮后,细胞被洗PBS和孵化在循证医学有或没有原生低密度脂蛋白/ Mox-LDL最终浓度为100µ克/毫升。划痕宽度被拍到在* 0和8小时三个字段的视图使用20 x客观和微观摄像系统耦合的倒置光学显微镜。重复的实验研究。使用图像J程序、伤口大小测量通过计算伤口边缘之间的距离保持在游离h,平均字段之间的观点和重复,表示最初的伤口宽度的百分比h。
2.6。细胞迁移试验
如前所述(21),细胞迁移实验进行了使用改性Boyden钱伯斯Transwell组成的膜过滤器插入(格林尼Bio-one;猫。662631号)24-well组织培养盘子。半透明的Transwell膜是6.5毫米直径的孔隙大小8μm。Transwell膜的上表面涂有纤连蛋白和Transwells最初孵化2小时37°C,然后一夜之间在4°C。第二天,插入与循证医学媒介冲洗一次,然后放入24-well组织培养板包含600μ循证医学的L中/。HUVECs (细胞治疗或不治疗与原生低密度脂蛋白或Mox-LDL 24小时)在100年μL循证医学的介质(±原生低密度脂蛋白或Mox-LDL最终浓度为100μg / mL)被播种的上面每个Transwell室和本机的低密度脂蛋白或Mox-LDL准备同时添加(100年最终的浓度μg / mL)趋化剂(VEGF在0.4μg / mL)的低舱Boyden腔。孵化后8小时在37°C,剩下的细胞在膜表面上被用棉球擦拭去除和过滤器和4%多聚甲醛固定,与结晶紫染色。细胞的数量每膜低表面使用20 x光显微镜下计算的目标。实验进行重复和入侵细胞的数量平均之间的复制和表达为一个折叠/控制未经处理的细胞。
2.7。研究细胞死亡和细胞增殖的流式细胞术
支流HUVECs处理或不处理原生低密度脂蛋白或Mox-LDL最终浓度为100μg / mL为24小时。细胞死亡被发现使用现场/死亡可以解决的红死细胞染色工具包(分子探针;猫。l - 23102)制造商的指示。HUVECs收获,沾染了近红外线死细胞染色633/635纳米波长的兴奋。对于扩散分析,BD Pharmingen Ki67装备使用和分析也根据制造商的指示执行。总之,与红色的死细胞染色,染色后细胞被固定,permeabilized,然后沾FITC-Ki67 (BD Pharmingen、圣地亚哥、钙、美国;猫。612472号)在4°C为20分钟。细胞使用BD FACSCanto II流式细胞术,进行分析和数据分析使用FlowJO(树明星,©inc .)。 The experiments were performed in duplicate and the percentages of proliferating and dead cells were averaged between the duplicates.
2.8。π/膜联蛋白V染色和流式细胞仪分析细胞凋亡的研究
HUVECs处理或不处理原生低密度脂蛋白或Mox-LDL最终浓度为100μg / mL为24小时。细胞凋亡检测使用BD Pharmingen FITC膜联蛋白V检测设备1。执行的分析是根据制造商的指示。总之,HUVECs与冷洗两次PBS和resuspended绑定缓冲的浓度为106细胞/毫升。FITC膜联蛋白V和π添加细胞被轻轻涡和孵化在黑暗中在室温下15分钟。流式细胞术分析在1小时内使用BD FACSCanto II流式细胞术,和数据分析使用FlowJO(树明星,©inc .)。实验进行重复和膜联蛋白V积极和π的百分比之间的阳性细胞平均重复。
2.9。免疫印迹分析Phospho-FAK
HUVECs处理模拟介质或Mox-LDL在100年最终浓度μg / mL为24小时。细胞被可溶性Laemmli样品缓冲。细胞总蛋白的提取分离,sds - page electrotransferred PDVF膜,分析了anti-p-FAK(酪氨酸576)- r抗体(200µg / mL;1:200;圣克鲁斯生物技术),发现与西方Lightning-ECL (PerkinElmer Inc .)。
2.10。免疫荧光
HUVECs处理模拟介质或Mox-LDL在100年最终浓度μg / mL为24小时。细胞被播种到fibronectin-coated盖玻片。第二天,细胞被固定在4%多聚甲醛,permeabilized Triton x - 100年的0.1%,在BSA阻塞,一夜之间适当的孵化主要抗体。细胞被进一步孵化与相应的二次抗体1 h。洗后,细胞被安装Fluoro-Gel (Laborimpex)和加工使用尼康荧光免疫荧光共焦显微镜(尼康A1R)。
2.11。HUVECs微分析和数据分析
HUVECs处理或不处理原生低密度脂蛋白或Mox-LDL最终浓度为100μg / mL为24小时。总RNA提取细胞总RNA分离试剂使用试剂盒(罗氏应用科学)。剖面微rna表达的处理和参与HUVECs,那时一个两步过程。首先,microRNA的互补脱氧核糖核酸的合成,1000 ng提取的总RNA受到逆转录(RT)使用TaqMan微RNA逆转录工具包(应用生物系统公司)和Megaplex RT引物(人类池,应用生物系统公司)制造商的指示后,允许同时逆转录380成熟人类microRNA。RT执行在Mastercycler Epgradient thermocycler (VWR)。RT后一步,cDNA RNase-free水稀释,再加上TaqMan基因表达主人混合,并加载到TaqMan人类微阵列(应用生物系统公司)。这个微数组是384 -实时pcr微流控卡使用嵌入式TaqMan引物和探针在每个人类microRNA对应380个不同的成熟。7900年定量rt - pcr进行ABI棱镜ht序列检测系统(应用生物系统公司)根据制造商的指示。microrna的相对表达水平计算的SDS 2.3软件(应用生物系统公司)使用的比较方法和RNU48内生控制。
2.12。为个人microrna TaqMan microrna的测定
细胞治疗或不与本机LDL或Mox-LDL最后100的浓度μg / mL 24小时使用试剂盒和总RNA提取细胞总RNA分离试剂(罗氏应用科学)。根据制造商的指示,TaqMan微RNA逆转录工具包(应用生物系统公司)是用于执行gene-specific逆转录每个微使用10 ng纯化总RNA, 100毫米核苷酸,50单位MultiScribe逆转录酶,20单位的核糖核酸酶抑制剂,50 nm gene-specific RT底漆样品。实时pcr进行ABI 7900棱镜ht序列检测系统(应用生物系统公司)使用5μL RT产品,10μL TaqMan 2 x普遍PCR反应混合液(应用生物系统公司),1μL (TaqMan microRNA测定混合(包含PCR引物和TaqMan探针)根据制造商的指示。所有定量rt - pcr进行了一式三份和microrna的相对表达水平计算的SDS 2.3软件(应用生物系统公司)使用的比较方法。
2.13。定量实时聚合酶链反应
细胞治疗或不与本机LDL或Mox-LDL最后100的浓度μg / mL为24小时。总RNA是使用试剂盒提取细胞总RNA分离试剂使用逆转录酶(罗氏应用科学)和reverse-transcribed核心设备(Eurogentec)根据制造商的指示。执行中存在在96孔板格式使用SYBR Green-based Step-One-Plus机器上的检测与每个20(应用生物系统公司)μL反应包含~ 50 ng cDNA, 0.3μM和反义引物,绝对qPCR SYBR绿色混合火箭(热科学)。板密封,骑在下列条件:95°C 15分钟,40 95°C的周期15秒,60°C 30年代,30年代的72°C。每个反应进行了一式三份和mRNA水平的RPL27用于规范化。mrna的相对表达水平进行了计算比较方法。PCR引物用于量化HO-1 RPL27如下:HO-1正向引物5′-AAGACTGCGTTCCTGCTCAAC-3′;HO-1反向引物5′-AAAGCCCTACAGCAACTGTCG-3′;RPL27正向引物5′-ATCGCCAAGAGATCAAAGATAA-3′;RPL27反向引物5′-TCTGAAGACATCCTTATGACG-3′。
2.14。基于存在的StellARray系统研究血管生成
细胞治疗或不与本机LDL或Mox-LDL最后100的浓度μg / mL为24小时。总RNA是使用试剂盒提取细胞总RNA分离试剂使用逆转录酶(罗氏应用科学)和reverse-transcribed核心设备(Eurogentec)根据制造商的指示。94个预选的基因表达分析的参与血管生成,人类血管生成96孔StellARray qPCR数组(Lonza有限公司、瑞士)是根据制造商的指示使用绝对qPCR SYBR绿色混合火箭(热科学)在7900年ABI棱镜ht序列检测系统(应用生物系统公司)。数据分析与全球模式识别数据分析工具(美国巴尔港生物技术,特伦顿,我)使用规范化的内部数组控制管家基因表达。
2.15。微目标预测
微:mRNA目标预测从公共网站下载TargetScan算法4.1版(http://www.targetscan.org)和米兰达算法(http://www.microrna.org)。
2.16。重组MPO准备
重组MPO准备如前所述。简单地说,为了表达MPO,构建了prepromyeloperoxidase重组质粒编码和命名pNIV2703。这个质粒包含一个MPO片段编码氨基酸11公认的信号序列中氨基酸696。pNIV2703表达向量被electopermeabilization转染CHO细胞。细胞上清液恢复试验生产的水平和分泌的酶活性分子。每一批方案活动的特点(U /毫升),蛋白质浓度(毫克/毫升)和特定的活动。使用过氧化活动的决心-dianiside衬底。使用酚试剂法测定蛋白质浓度测定,以卵白蛋白为标准。每批检查使用Lonza内毒素检测内毒素工具包qcl - 1000(目录数量:50 - 647 - u)。浓度总是小于100 pg / mL,,考虑的最终稀释MPO-treated LDL分数,会造成最终的浓度小于0.1 pg / mL Mox-LDL补充中添加到细胞中。
2.17。隔离本地低密度脂蛋白和Mox-LDL准备
脂蛋白颗粒分离从血液血浆从无菌袋使用密度梯度超速离心法。本机LDL分数(= 1.019 - -1.063)存储在4°C在黑暗中氮和氧化根据下面描述的过程:氧化之前,本地的低密度脂蛋白是凝胶过滤(PD-10列,法玛西亚)2.1和1.6毫克的原生低密度脂蛋白被氧化氯化MPO重组,生成氧化低密度脂蛋白(Mox-LDL)在1毫米H2O2在pH值为6.5 2毫升PBS 5分钟。检测是脱盐后再MPO治疗。酚试剂法测定蛋白质浓度测定,使用卵白蛋白作为标准。
2.18。统计分析
GraphPad棱镜用于分析。数据是通过单向方差分析或学生的评估测试。值< 0.05 ()、< 0.01 ()和< 0.001 ()被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。MPO-Oxidized LDL (Mox-LDL)在HUVECs干扰细胞的行为
为了实时监控Mox-LDL对动力学的影响细胞粘附和增殖HUVECs, xCELLigence系统(18)是利用。细胞被播种和EC的阻抗层实时测量。细胞阻抗指数(CI)逐步增加播种在24小时后,由于固有细胞属性可能包括细胞粘附、形态变化、扩散。24小时后的信号采集,细胞融合,掩盖的整个表面区域E板井和阻抗到达了一个高原。本机LDL或Mox-LDL随后添加到井和阻抗测量进行了另一个24小时。而阻抗CI mock-treated和本地LDL-treated井保持稳定,在Mox-LDL治疗显著降低井(图1)。阻抗CI是受细胞粘附、增殖,依恋,蔓延,和细胞间接触,这表明Mox-LDL干扰这些细胞参数之一。因此,我们决定进一步解决这些EC属性专门的化验。
3.2。在HUVECs Mox-LDL Tubulogenesis减少
为了调查的影响Mox-LDL ECs的能力来构建一个血管网络,一个在体外使用HUVECs tubulogenesis化验了。ECs最初孵化控制媒介或媒介与本机LDL或Mox-LDL补充。24 h后,细胞基底膜基质涂层板过夜。正如所料,控制ECs形成特征capillary-like网络(22]。然而如图2(一个),Mox-LDL部分抑制欧共体建立血管网络的能力,而控制本机LDL没有影响。量化分析表明累计船长度的减少Mox-LDL高于50%(图的存在2 (b)),证明Mox-LDL严重影响血管生成ECs活动。实时监测网络的形成在9小时表示,这种效应与发芽的抑制投影而不是回归的网络(数据未显示)。
(一)
(b)
3.3。Mox-LDL抑制ECs的迁移能力在体外
因为tubulogenesis高度依赖细胞迁移,我们接下来的Mox-LDL调查行动在体外伤口愈合试验(23]。在这个试验,培养单层HUVEC preincubated 24小时在模拟中,本地的低密度脂蛋白,或Mox-LDL补充媒介被允许开拓殖民地挠地区8个小时。正如图所示3(一个)Mox-LDL-treated ECs的迁移能力下降,影响未见的原生低密度脂蛋白的存在。细胞迁移是评估通过测量细胞的划痕边缘之间的距离自由区域h和表达它最初的划痕宽度的比例h。如图3 (b),而57%和46%的划痕周长8小时后仍未结束的模拟和低密度脂蛋白治疗细胞,分别Mox-LDL细胞治疗仍未结束的80%。
(一)
(b)
3.4。Mox-LDL抑制ECs定向Chemomigration
然后我们评估的影响对HUVEC Mox-LDL chemomigration在修改Boyden室试验(24]。HUVECs最初培养存在与否的原生低密度脂蛋白或Mox-LDL 24小时。细胞被收获和播种在底部的参议院Boyden室在类似的条件。定向细胞移植诱导VEGF梯度。正如图所示4(一),EC迁移减少Mox-LDL的存在。相比之下,本机LDL没有影响。量化分析表明Mox-LDL治疗细胞迁移下降超过了60%(图4 (b))。总之,这些结果表明,随机和ECs的定向迁徙能力被Mox-LDL除了受到严重影响。
(一)
(b)
3.5。Mox-LDL不会干扰HUVEC增殖或生存能力
接下来,我们检查的负面影响是否对HUVEC Mox-LDL tubulogenesis和迁移是由于负面影响细胞增殖和生存能力。这一目标,我们孵化EC与本机LDL或Mox-LDL培养基补充或控制中24小时。ECs收获和提交流式细胞仪分析,首先使用Ki67抗体的结合和生活/死染色评估细胞死亡和扩散25]。凋亡细胞的比例也评估了膜联蛋白V和propidium碘染色(26]。关于细胞增殖没有明显差异,生存能力,或死亡(凋亡或坏死)之间的任何条件(数据5(一个)和5 (c))可以被检测出来。统计分析的结果来自独立实验证实的比例激增,死亡或PS阳性细胞,保持可比在所有条件(数据5 (b)和5 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.6。对附着力疫源地Mox-LDL没有影响
我们的数据指出Mox-LDL对HUVEC蠕动的影响。关键球员在这一现象的结构调节细胞/ ECM交互称为粘附斑或粘附疫源地。因此,我们分析了我们这些粘附复合物治疗的效果。如果染色桩蛋白,一个经典的标志粘连疫源地,并没有显示出任何影响Mox-LDL的发生,附着力复合物的大小或亚细胞分布ECs见补充图我网上(见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/134635)。粘着斑激酶(FAK)是一个主要玩家在信号转导途径负责矩阵重组,cell-matrix粘附,细胞迁移27]。因此,我们调查的FAK磷酸化Mox-LDL治疗。免疫印迹分析HUVECs使用anti-phospho-FAK(酪氨酸576)抗体没有透露任何Mox-LDL对磷酸化的影响FAK水平(补充图二)或本地化(数据未显示),从而证实Mox-LDL没有对EC胶性能的影响。
3.7。Angiogenesis-Related Mox-LDL HUVECs治疗基因表达分析
tubulogenesis广泛接受作为一个在体外的早期阶段的模型在活的有机体内血管生成,人类血管生成StellARray技术被用来研究94个预选的基因的表达参与血管生成途径。治疗的HUVECs Mox-LDL显著改变的四个测试基因的表达,包括HO-1(补充表1)。
3.8。转录HUVECs Mox-LDL治疗的影响
为了探索分子机制Mox-LDL效果和HO-1感应,我们试图检查是否改变小分子核糖核酸(大鹏)表达模式可能与表型在HUVECs Mox-LDL行动(28]。因此,RNA提取从HUVECs孵化控制或低密度脂蛋白和Mox-LDL补充媒介。首次分析了TaqMan低密度阵列(TLDA)技术。几个大鹏被识别差异表达只在Mox-LDL HUVECs治疗(见补充表II)。TLDA结果验证了存在进行的每个差异表达大鹏使用特定的引物。这导致了高信任度米尔miR - 133 a的签名,miR - 203, miR-22超表达(4、2.5和8.5倍;职责。),mir - 672下调(3折)在Mox-LDL治疗(见补充表III)。特别是,miR-22 Mox-LDL治疗细胞调节8.5倍比控制。
3.9。miR-22感应之间的函数关系,HO-1表达式,和HUVECs Mox-LDL Tubulogenesis抑制的
当我们建立了Mox-LDL对HUVEC能动性和tubulogenesis的影响,以及相关的mRNA micoRNA签名,我们评估因果和功能之间的交互这三个观测;我们第一次筛选的调节mRNA 3′UTR假定的网站目标的共识——或者下调大鹏展翅。在网上分析发现miR-22目标站点位置之间的276年和299年位于HO-1 3′UTR。为了测试一个因果miR-22对HO-1基因表达的影响,我们检查了HO-1 miR-22击倒的表达的影响。如图6(一),消耗miR-22阻止HO-1表达即使Mox-LDL细胞治疗。
(一)
(b)
(c)
为了测试tubulogenesis miR-22的因果效应,我们阻止miR-22表达Mox-LDL ECs治疗基底膜基质试验和评估他们的tubulogenic活动。如图6 (b),抑制miR-22专门中和Mox-LDL tubulogenesis负面影响。我们接下来问功能连接miR-22 HO-1 upregulations Mox-LDL治疗可以解释下tubulogenesis Mox-LDL负表型效应的。我们还证实,超表达HO-1一再Mox-LDL治疗血管生成的抑制作用的属性HUVECs(补充图(四)。
4所示。讨论
负干涉我们的数据表明,Mox-LDL HUVEC流动性(运动性、迁移和tubulogenesis)在体外通过增加miR-22 HO-1表达式。
我们的研究必须对先前发表的论文讨论了光的影响ox-LDL(我)细胞死亡/凋亡和(2)“血管生成”。
关于细胞死亡,与先前的报道显示,ox-LDL能够诱导细胞凋亡,减少血管的可行性ECs (29日,30.),我们没有发现Mox-LDL对细胞增殖的影响和死亡。这种差异可能与实验设计、细胞类型和氧化协议或ox-LDL浓度。我们使用了一个氧化剂和ox-LDL浓度的病理生理,我们相信,更密切相关在活的有机体内的情况。特别是,铜被广泛用于氧化低密度脂蛋白在体外不太可能是在浓度足以产生观察ox-LDL浓度。先前提出的演员如脂氧合酶或NADPH氧化酶已经被丢弃。虽然新参与者可以提出如VPO (peroxidasin), MPO是一个最喜欢的在活的有机体内演员:氧化低密度脂蛋白在体外;高血清水平是心血管疾病的危险因素;MPO氧化低密度脂蛋白检测在活的有机体内。我们使用氧化低密度脂蛋白浓度曾被检测到在活的有机体内。最后,我们应用质量控制过程评估已例如氧化低密度脂蛋白的水平。最近这些条件会引起特定的信号转导途径说明了他们独特的能力引发途径涉及PLA2在巨噬细胞31日]。
关于血管生成,我们首次表明,病理生理浓度的Mox-LDL诱导人类ECs的重要功能变化。因此在我们的手中,ox-LDL抑制HUVEC在体外tubulogenesis、运动性和迁移,属性联系在一起在活的有机体内血管生成。这是面对一些报告关于一个ox-LDL对血管生成的影响。这些数据再次矛盾,这可能与不同的实验协议,特别是不同ox-LDL浓度。因此,尽管先前的研究显示ox-LDL的抑制作用和高胆固醇血症angiogenesis-like内皮生长(29日),最近的一些研究报告,ox-LDL可能发挥proangiogenic作用在低浓度(32,33]。我们的观察可能与我们使用的氧化剂和浓度都是病理生理学是尽可能接近在活的有机体内的情况。
表型分析后,我们旨在确定分子机制干扰EC的能动性。虽然最简单假设最终涉及一个干扰粘附焦点函数我们不能发现任何Mox-LDL对EC胶粘剂性能的影响。
我们下一个分析与Mox-LDL治疗相关基因表达的变化。我们的研究结果表明,观察表型效应可以解释在分子水平上由miR-22 HO-1基因表达调控。HO-1酶诱导的氧化应激和催化等对压力的反应刺激血红素降解成一氧化碳,胆绿素,和自由铁。有许多研究HO-1与血管生成途径(34- - - - - -38]表明正面和负面的影响。其他的研究报告也miR-22的抗血管新生的活动39- - - - - -41]。两个研究特别是,一个表现在结肠癌模型(42)和其他在肝细胞癌模型(43),分别miR-22和HO-1 upregulation减少细胞迁移,侵袭性和伤口愈合,虽然独立于Mox-LDL治疗,但是按照我们的观察与Mox-LDL治疗。最后,一些报告显示HO-1如何干扰血管生成。它确实产生职业的表达——(CCL-2 CXCL-8)或抗血管生成趋化因子(CXCL-10)。在这之后情况下HO-1过度诱导分泌的EC CXCL-10能够抑制电子商务增长(44]。我们没有看到任何影响CXCL10表达和细胞生长。结论HO-1的角色,值得一提的是,先前所有的出版物,尽管一些声称HO-1酶活性是必需的,研究血红素可用性或有限公司生产铁,胆红素。
为了检查的致病作用miR-22 / HO-1轴Mox-LDL信号转导通路,我们在ECs抑制miR-22表达式。对tubulogenesis MiR-22抑制废除Mox-LDL负面影响。此外,miR-22击倒了HO-1 Mox-LDL超表达和归纳。我们也检查了HO-1击倒或异位表达对电子商务的影响血管生成的能力。虽然HO-1击倒表明,少量的HO-1是强制性的在体外血管生成,其超表达是有害的。这支持了先前的迹象复杂HO-1的作用,低浓度的效果比更高的浓度(44),表明适当水平的HO-1 tubulogenesis是至关重要的。
我们的数据填补Mox-LDL信号转导通路。Ox-LDL之前报道绑定到LOX-1清道夫受体和触发信号转导途径涉及一些激酶包括物、pKC, ERK 1和2,英国皇家空军,IP3K [34,45]。我们专注于这个途径:控制基因表达和表型的影响。生物信息学预测工具指着一个假定的目标站点miR-22 HO-1 mRNA和建议后者的直接监管。但是只有极少数情况下直接米尔积极作用已报告之前(46,47]。报告基因进行分析以评估这种可能性的确给了负面结果(数据没有显示)。假定的miR-22目标网站,发现HO-1启动子,提出了可能的米尔转录效应如前所记录(48,49]。报告基因分析并不支持这一建议。米尔的报道积极影响通过抑制负监管机构更加频繁。在我们的例子中,这个米尔目标仍有待确定。然而,另一种HO-1控制miR-22可能通过抑制nonsense-mediated RNA衰变(NMD)。例如,brain-specific mir - 128最近被证实引起一连串的成绩单在神经细胞通过针对NMD镇压外显子结复杂核心组件MLN51和RNA解旋酶UPF1 [50]。
我们第一次拒绝了另外3大鹏展翅的表达受到Mox-LDL由于缺少HO-1 3′UTR目标站点。的负面记者化验,他们又不过值得考虑,因为他们可以间接(例如,通过干扰微rna的表达或蛋白质本身直接代理HO-1表达式)。这将是解决在我们未来的工作。
最好最简单的模型,解释了我们的观察是,如下所示。低密度脂蛋白修改MPO清道夫受体结合LOX-1 ECs。这触发一个氧化应激信号通路,这将刺激NRF-like转录因子的结合潜在共识序列miR-22启动子(51]。这反过来增加miR-22表达式。Mir-22间接增加HO-1表达式通过不明目标可能通过抑制NMD机制在细胞中。这个干扰细胞的能动性。
然而在这种转导通路还不确定。首先,分子的性质演员连接miR-22和HO-l是未知的。细胞特异性的链接应该是解决我们不能执行报告基因在HUVECs化验。其次,HO-1的参与酶活性和其目标的本质仍然是假设的。
我们的数据都被获得在体外。他们建议Mox-LDL干扰血管生成在活的有机体内。因此,在患者的血清低密度脂蛋白浓度高会损害血管生成和应对阻碍电子商务能力受损的内皮。这些机制在起作用在一些病理或生理条件。例如,高LDL水平会损害angiogenesis-dependent肿瘤增长,尽管这似乎矛盾的报道肥胖作为某些癌症的危险因素。更合适,而众所周知,高LDL浓度通过动脉粥样硬化是心血管疾病的危险因素,我们的数据表明,他们将进一步导致坏的疾病通过干扰的reendothelialization血管剥蚀,atheroma-associated伤口,支架,动脉瘤,梗塞或再狭窄的地方。更普遍的高ox-LDL水平也可能产生负面影响的发展相关联的所有病理与内皮脱屑,如血管炎,红斑狼疮,镰状细胞性贫血,地中海贫血,感染性休克,感染(rickettsiae、巨细胞病毒),或者癌症。
5。结论
动脉粥样硬化主要是导致心血管疾病,全球死亡的第一原因,其中包括脑血管意外和心肌梗死。动脉粥样硬化与氧化低密度脂蛋白在血管壁的积累,影响其功能。我们表明,病理生理氧化低密度脂蛋白的浓度影响内皮细胞的迁移和血管生成能力。我们确定一个微RNA(一个小RNA能够调节基因表达),miR-22,血红素加氧酶1基因编码的超表达有助于这种显性效应。我们的研究结果表明,脂质丰富的饮食,提高低密度脂蛋白和ox-LDL水平不仅导致粥样硬化斑块形成,而且干扰内皮伤口愈合过程;他们可以因此导致疾病的进展;他们可以负面影响所有临床条件与内皮脱皮。他们可以干扰剥蚀造成医疗协议如导管或支架。
非标准缩写和首字母缩写
| 低密度脂蛋白: | 低密度脂蛋白 |
| MPO: | 髓过氧物酶 |
| ox-LDL: | 氧化低密度脂蛋白 |
| Mox-LDL: | 髓过氧物酶氧化低密度脂蛋白 |
| HO-1: | 血红素加氧酶1 |
| 电子商务: | 内皮细胞。 |
伦理批准
楚该市医院伦理委员会(拉西' d 'Ethique I.S.P.PC: OM008)已批准血液采样和特别批准了这项研究。研究符合赫尔辛基宣言》阐述的原则。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
Frank Dequiedt Luc Vanhamme和莫德马丁的研究主任,副研究员,博士后研究人员,分别在比利时科学研究基金(FRS-FNRS)。作者感谢Anouk Bleuart和乔纳森Bruyr有价值的帮助。这项研究是由比利时科学研究基金(FRS-FNRS),溺爱让雌猎犬,昏聩大卫·爱丽丝·Buuren, la医学背景倒在埃诺(FRMH)基金会pour la Chirurgie Cardiaque,和欧盟,7日FP根据授权协议。269966 -血栓,部分支持的大学间的吸引力波兰人项目由比利时科技政策办公室(IUAP-BELSPO元太/ 28和PVII / 13)。从捐赠者获得书面同意。
补充材料
我们发现Mox-LDL抑制EC能动性和tubulogenesis,试图揭示这一行动背后的分子机制。补充表我量化94个基因的表达变化,参与血管生成在这种Mox-LDL治疗而补充表II和III总结的变化中发现miR表达式。我们在“结果”部分显示,两种表达变化MoxLDL行动很重要,即后羿和miR-22。为此我们使用miR-22抑制剂和补充图3展示了一个控制实验表明它确实明显miR-22水平降低。我们也过表达后羿和显示,这是足以模仿的作用Mox-LDL(补充图(四)。我们也试图揭开后羿的最终目标行动,I和II和补充数据表明,本法离子变化不是由一个表达式或附着菌斑的本地化组件。