文摘

子宫内膜异位,定义为子宫内膜组织生长在子宫外,是一种常见的妇科疾病影响数以百万计的世界各地的妇女。是炎症,estrogen-dependent复杂的障碍,症状变化,骨盆疼痛和不孕的主要特点。卵巢子宫内膜瘤常常在妇女子宫内膜异位症。后期诊断子宫内膜异位症的一个主要问题;因此,重要的是要识别早期诊断的生物标志物。当前工作的目的是评估子宫腺肌瘤的ecto-nucleotidases活动内容。这些酶,通过调节细胞外ATP和腺苷水平,炎症过程中的关键酶,其表达以前描述的人类子宫内膜。为了实现我们的目标,子宫腺肌瘤的echo-guided吸气式液体分析评估ecto-nucleotidases活动并与简单的囊肿。我们的结果表明,酶活性可量化的卵巢囊肿送气和子宫内膜瘤显示ecto-nucleotidases活动显著高于单纯囊肿(5.5倍增加atp酶和20倍ADPase),从而为新的子宫内膜异位生物标记物可能的候选人。此外,我们证明ecto-nucleotidases轴承的存在在这些液体液。 These results add up to the knowledge of the physiopathologic mechanisms underlying endometriosis and, open up a promising new field of study.

1。介绍

子宫内膜异位症是一种慢性疾病,其特征是存在子宫内膜组织(基质和腺体)在子宫腔外,主要是在盆腔腹膜和卵巢。它影响多达15%的生育年龄的女性,其患病率上升。是炎症,estrogen-dependent复杂的障碍,症状变化,骨盆疼痛和不孕的主要特点。这两个症状被认为是过度的结果炎性环境不仅在骨盆还在内膜,影响植入(1,2]。

这是女性不孕症的主要原因之一。后期诊断病理学的一个主要问题,采取五到十年后检测的第一个症状。因此,有必要确定早期诊断子宫内膜异位症的生物标志物3]。

卵巢子宫内膜瘤发生在17 - 44%的患者子宫内膜异位的影响(4)和占35%的良性卵巢囊肿。子宫腺肌瘤也称为异位或“巧克力囊肿”,因为内部流体的血液衍生深色(5]。虽然恶性转化的风险较低,0.6 - -0.8% (6),手术已成为黄金标准治疗。如今,腹腔镜胆囊切除术是最延长治疗子宫腺肌瘤,尽管生育率可能后来妥协。一些研究报道较低的卵巢储备卵巢子宫内膜瘤切除后由于偶然的正常卵巢组织的切除子宫腺肌瘤一起墙(7,8]。还有一个重要的证据术后循环她们血液中的抗苗勒氏管激素下降,卵巢储备量化常用的生物标记,表明对卵巢储备功能产生负面影响子宫内膜瘤切除后(8]。因此,一种新的微创介入技术治疗低风险实施恶性卵巢囊肿,包括子宫内膜瘤,其次是硬化超声引导下愿望,似乎连低复发风险(0 - 15%)9- - - - - -13]。的硬化似乎并没有影响怀孕,怀孕,堕胎,提取卵子、胚胎质量和荷尔蒙水平如果与不孕妇女卵巢囊肿(11,14]。

子宫腺肌瘤的内容的分析可以帮助确定新的生物标志物病理学。例如,异位囊肿包含铁明显多于其他卵巢囊肿;这被认为是一个可能的致癌原因在子宫腺肌瘤铁诱导持续氧化应激(15]。蛋白质组学分析,卵泡液与子宫内膜异位症的女性还指出,免疫功能的改变可能与不育(16]。

Purinergic信号,产生的生物效应等细胞外ATP和核苷等核苷酸腺苷通过特定受体,是一个重要的调节机制在范围广泛的炎症条件下(17,18]。ATP是一个“危险信号”发布的组织应力条件下,如坏死、凋亡、缺氧、炎症和迅速转化为腺苷,保护细胞和组织免受过度的炎症和免疫介导的损伤。转导由分子从而影响往往相反,和由此产生的细胞反应的结果ATP的比率(ADP)腺苷浓度,主要由ecto-nucleotidases控制,关键酶purinergic信号(19]。最良好的ectonucleotidase通路包括顺序行动CD39(三磷酸ectonucleoside diphosphohydrolase-1, NTPDase1),把细胞外ATP (ADP)音箱,和CD73 (ecto-5′核苷酸酶),生成腺苷的AMP (20.- - - - - -23]。我们以前子宫内膜ecto-nucleotidases的表达特点,展示沿着周期和变化在更年期24,25]。我们还表明,CD39和CD73在子宫内膜癌中表达的高度26),导致免疫抑制水平的增加细胞外腺苷在肿瘤微环境中找到。

液虽小,膜分泌囊泡(30 - 100 nm直径)的内吞作用的起源,由许多不同的细胞类型,形成多泡核内体与质膜的融合。他们被认为扮演重要的角色在细胞间通信中,例如,在免疫和信息交互,并已确定在生物体液,血浆和尿液等,以及在细胞培养上清液27,28]。的存在ecto-nucleotidases CD39和CD73就得以证实癌症液(29日- - - - - -31日),导致了腺苷生产抑制t细胞功能。

在目前的工作中,我们旨在确定ecto-nucleotidases活动(atp酶、ADPase AMPase)存在和可衡量的卵巢囊肿的超声引导下吸气内容和内膜异位囊肿中这些活动是否改变而简单的囊肿,子宫内膜异位的影响炎症条件。我们的目标是评估其潜在生物标志物的子宫内膜异位症,导致子宫内膜异位症physiopathologic机制的知识。

2。材料和方法

2.1。样品

本研究的伦理原则遵循赫尔辛基宣言和所有程序批准bellvige医院临床研究伦理委员会。前瞻性群组的27个附件的囊肿与低恶性肿瘤的风险,包括14个子宫内膜瘤和13个卵巢囊肿,简单研究了bellvige医院的妇科服务(西班牙巴塞罗那)2013年3月至2014年4月。

患者入选标准研究(1)岁> 18岁;(2)超声波特性预测的低风险囊肿恶性肿瘤:光滑的墙壁,没有可靠的组件,最大直径40和100毫米之间,不超过一个薄的分隔作用(< 2 - 3毫米),没有内部流彩色多普勒成像的双房的囊肿,根据极微小标准(32];(3)囊肿持久性从诊断≥6个月;(4)肿瘤标记Ca 国际单位/毫升和Ca 国际单位/毫升;和(5)从患者知情同意。

超声引导下愿望,腹部后,或阴道,消毒,消毒17 G脊椎穿刺针(BD医疗富兰克林湖,NJ Becton,迪金森和公司)旨在直接超声引导下囊肿的中心内容是吸气。厚高密集intracystic流体在场时,为了便于愿望,生理盐水稀释进行。稀释了被认为是在最后的计算。然后,几个intracyst盐水洗进行直到间隙,紧随其后的是滴剂的乙醇为硬化性的代理。灌输乙醇的体积是子宫腺肌瘤的吸气量的2/3,总是少于100毫升。乙醇是左内囊肿15分钟,然后取出,与生理盐水洗出来。分析了intracystic液体正常值bellvige病理服务的医院确认非典型细胞的缺失。

患者分为两组后,超声波特性和内部颜色液体:(a)子宫腺肌瘤组有均匀的外观涉及扩散内部回声呈低背景和包含血液颜色液体和(b)简单的囊肿组一个消声结构,包含明确的浆液。表1包括描述性统计的两组患者,包括年龄和大小和囊肿的体积。

表1
描述性统计两组患者的样本。

每个样本的整除外来体浓缩在冰上保持直到使用情况。其余整除,储存在−80°C。

2.2。外来体浓缩

子宫腺肌瘤和简单的囊肿液样本在3000 g×15分钟离心去除细胞和细胞碎片,和上层清液转移到无菌管。250年μL与63年每个上层清液混合μL (ExoQuick外来体沉淀的解决方案(系统生物科学、山景、钙、美国)反演,混合物是冷藏一夜之间在4°C,以下供应商的指令。样本然后离心机在1500 g×30分钟。离心后,液出现作为一个米色或白色颗粒底部的管。上层清液吸气和剩余ExoQuick解决方案是将下降在1500×g离心5分钟。所有流体的痕迹都被愿望和外来体颗粒resuspended在两个不同的缓冲区。免疫印迹分析,外来体颗粒在75年resuspendedμL的缓冲区包含10毫米Tris-HCl pH值7.4,150毫米氯化钠,和1:100蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。或者,ecto-nucleotidases活动分析,外来体颗粒在75年resuspendedμL酶测定缓冲区(160毫米Tris-HCl pH值7.4,10毫米CaCl2)。在外来体样品中蛋白质含量是由布拉德福德的方法(33]。样本储存在−20°C到使用。

2.3。免疫印迹分析

15μg蛋白质在95°C加热3分钟,装上任何kD Mini-PROTEAN TGX预制凝胶(Bio-Rad、大力神、钙、美国),和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜使用Trans-Blot涡轮增压传输系统(Bio-Rad)。屁股被封锁与0.1% Tween-20 Tris-buffered盐水(TBS-T)含5%脱脂奶粉1小时在室温下(RT)。膜在一夜之间被孵化在4°C以下抗体:exosomal标记抗体CD9、CD63,研究,HSP70(稀释1:1000)从ExoAB-KIT-1抗体免疫印迹检测工具(系统生物科学),anti-CD39(克隆BU61,稀释1:500),和anti-CD73(克隆4从Abcam g4,稀释1:50)。的屁股然后洗TBS-T孵化和适当的HRP-conjugated二级抗体(系统生物科学,稀释1:20000)1小时在沿膜被孵化Amersham ECL免疫印迹检测试剂(美国通用电气医疗集团,匹兹堡,PA) 1分钟和暴露在x光片。

2.4。核苷酸酶活性测定

核苷酸酶活动(atp酶、ADPase AMPase)测定在乘96 -孔板通过测量大量的解放无机磷酸盐(Pi)使用孔雀石绿的比色测定(34]。所有的样品都用于这些化验。孵化混合物包含160毫米Tris-HCl pH值7.4,10毫米CaCl25毫米左旋咪唑,碱性磷酸酶抑制剂,1毫米ATP、ADP、AMP基质在150年最后一卷μl .化验是由添加样品,要么直接液体(5μL atp酶和ADPase化验和10μL AMPase试验)或50μg的孤立的外来体分数。另外,越来越多的液被添加到评估如果ectonucleotidase活动依赖于外来体剂量(5、10、15、20、30、50μg)。20分钟后的孵化37°C, 50μL(孔雀石绿的解决方案是添加到每个10到20分钟后,OD620年测量和记录。被选出的孵化时间和蛋白质浓度确保酶反应的线性。KH2阿宝4被用作π标准。控制,以确定非酶的π堆积进行孵化基质的样品没有或衬底。每个实验进行了三次,在每一个实验样本一式三份分析。酶活性表达pmolsπ/分钟/μL在整个液体和pmolπ/分钟/μ液的g。

2.5。电子显微镜研究

形态分析,包埋电镜准备液被延伸获得如前所述et al。35]。总之,exosome-containing小球在2%多聚甲醛在100毫米resuspended磷酸盐(PBS)。5μL resuspended颗粒的沉积在formvar-coated网格和孵化20分钟的RT。彻底冲洗后,样本后缀在1%戊二醛五分钟,然后在2%醋酸双氧铀溶液对比,150毫米草酸pH值7。然后网格被转移到一滴1.8%甲基纤维素、0.4%醋酸双氧铀10分钟在冰上。最后,与不锈钢循环和风干网格被额外的10分钟。

另外,为了获得薄片,在paraformaldehyde-fixed exosome-containing丸后缀在2.5%戊二醛和2%多聚甲醛在100毫米PBS,在一系列分级乙醇脱水,嵌入到性欲低粘度树脂。超薄部分(50 - 60海里)从exosome-enriched丸是用钻石刀切成一个超微切片机UltracutE(徕卡微系统)。后拿起铜网格,超薄部分都沾染了醋酸双氧铀及柠檬酸铅。最后,液与杰姆- 1010透射电子显微镜观察(JEOL、日本)和图像记录生物扫描792摄像头(GATAN,德国)。

2.6。统计分析

使用SigmaStat 3.2执行统计分析软件SPSS Inc .)、芝加哥,美国)。值报告为均值±S.E.M.学生的 以及用于比较的手段正态分布数据的两个独立的团体。

3所示。结果与讨论

大多数试图确定外围生物标志物的子宫内膜异位症专注于他们的存在在等离子体中,血清或尿液(3]。然而,子宫腺肌瘤的研究内容已被证明是非常有用的15,16]。在目前的工作中,我们评估了ectonucleotidase酶活性存在于子宫内膜瘤相比,卵巢囊肿。

Echo-guided愿望是子宫腺肌瘤中包含的技术用于消除流体和简单的囊肿。直接乙醇硬化进行了化学破坏囊肿衬里,并防止其再生。图1显示了一个子宫腺肌瘤的超声图片之前和期间其内容的愿望。

(一)
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图1
经阴道超声引导下子宫腺肌瘤的愿望。(一)子宫腺肌瘤测量之前的愿望。虚线表示的一个直径测量。(b)子宫腺肌瘤吸气。箭头表示囊肿内的针。愿望后注意减少体积。

吸气式液体被用于酶活性研究。Ecto-nucleotidases活动(atp酶、ADPase,某种程度上,AMPase)在场的吸气流体和可量化的卵巢和子宫腺肌瘤简单囊肿(图2)。子宫腺肌瘤吸入物显示显著提高( )腺苷三磷酸酶和ADPase活动(±SEM, 38岁,96±11和33岁的68±95 pmol /分钟/μL, resp)比单纯囊肿(7,19±1 88年和1 55±0,4 pmol /分钟/μL,职责)。活动率低吸气液中检测到与AMP衬底虽然子宫腺肌瘤显示更高AMPase活动(1,28±0,46 pmol /分钟/μL)比单纯囊肿(0 87±0 25 pmol /分钟/μL),差异不显著。同样的结果也获得活动计算时μg蛋白质的液体,与更高的活动在子宫腺肌瘤(数据未显示);然而,因为众所周知,异位囊肿不同于简单的囊肿在蛋白质含量(16),结果显示是π代单位体积。这是第一次,ecto-nucleotidases研究卵巢囊肿,尽管这些酶活性特征之前在胰液等其他液体(36和等离子体37),那里是他们的活动之间的相关性和不同的炎症性疾病38]。


图2
酶活性的液体从简单的囊肿和子宫腺肌瘤。Ectonucleotidase活动,表示为pmoles生成的π,在液体从简单的囊肿(白列)和子宫腺肌瘤(灰色列)的ATP, ADP、AMP作为衬底。子宫腺肌瘤的atp酶和ADPase活动显著高于单纯囊肿( ),而AMPase难以觉察的活动和差异无法确定。

自进行酶活性测定,吸气液体以前离心去除细胞和细胞碎片,由此产生的活动可能是由于溶酶或膜结合ecto-nucleotidases存在于细胞外膜囊泡,如微泡和液没有被最初的离心分离。因此,我们决定执行外来体浓缩评估他们的存在,并确定他们ectonucleotidase活动。据我们所知,这是第一次研究证明存在液的液体包含在卵巢囊肿。电子显微镜分析证实了液的大小和形态(图3(一个))。西方墨迹使用四个外来体抗体标记(CD9、CD63、研究和Hsp70)演示了这些结构的存在在子宫腺肌瘤的100%和46%的简单的囊肿吸入物(图3 (b))。从这些实验中,我们得出结论,在标记中使用,CD9是最适合外来体示范吸气液体的卵巢囊肿,因为它存在于所有外来体样品分析。CD9已经证明是一个不错的外来体上皮子宫内膜细胞的标志(39,40]。所有的样品表示,连同CD9、至少一个其他的外来体标记化验。有趣的是,使用anti-CD63抗体,主要的乐队在子宫腺肌瘤是较低的分子量比简单的囊肿。一个可能的解释是基因编码的可变剪接已经描述CD63,导致多个变体编码记录不同的蛋白质。因为这在所有的样品一致的研究结果,我们建议进一步研究其在液从其他起源于子宫内膜异位患者,建立如果它可以作为生物标志物的病理变化。

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(b)
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图3
外来体特征。(一)代表的TEM图像液分离子宫腺肌瘤(bar = 25海里)。(b)与四个不同的外来体标记免疫印迹:CD63 (A), Hsp70 (b)的研究(C)和CD9 exosome-enriched分数从简单的囊肿(D) (SC)和子宫腺肌瘤(EM)。该图显示了每种类型的样本代表性的实验之一。分子量kDa的标记显示在左边的图像。

酶的实验与exosome-enriched分数表明,这些样品保留ectonucleotidase活动(atp酶、ADPase AMPase)显示的整个流体。此外,这些活动都依赖于样本剂量,如图4(一)与以前的结果,符合液从其他来源表达积极CD39和CD73 [29日]。腺苷三磷酸酶和ADPase最大活动被发现50μ克液。难以觉察的AMPase活动,在整个液体,在净化液,虽然只有在高浓度(50μg),表明这个活动在整个流体主要是由于酶液。相反,atp酶和ADPase活动对双方都是相关的外来体膜结合酶和可溶性。图4 (b)显示了使用ATP酶活性,ADP、AMP的基质液从简单的囊肿,子宫腺肌瘤。这些活动都明显高于子宫腺肌瘤比简单的囊肿。免疫印迹分析证明CD39和CD73在这些样品(图4 (c))。

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(c)
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图4
酶活性在exosome-enriched分数从简单的囊肿,子宫腺肌瘤。(一)腺苷三磷酸酶(黑色圆圈)和ADPase(白色圆圈)的活动越来越多的液从子宫腺肌瘤(0、5、10、20、30、50μg)。(b) Ectonucleotidase活动,表示为pmoles生成的π,在exosome-enriched分数从简单的囊肿(白列)和子宫腺肌瘤(灰色列)的ATP, ADP、AMP作为衬底。所有的活动都明显高于子宫腺肌瘤比简单的囊肿( )。(c)免疫印迹和anti-CD39 anti-CD73 exosome-enriched分数从子宫腺肌瘤的抗体。分子量kDa的标记显示在左边的图像。

我们的结果加强新兴子宫内膜异位病理生理学证据表明炎症,逃避免疫监视的地方似乎是至关重要的在最初的建立和后续发展流离失所的子宫内膜组织(41]。在这个意义上,增加顺序表演ectonucleotidase活动将有助于维护当地所必需的免疫反应的抑制疾病进展,通过调节细胞外ATP和细胞外腺苷水平上升。我们建议在其他生物液体更容易检测到它们的存在,这一事实,加上简单的检测,会使他们有前途的子宫内膜异位生物标志物。

4所示。结论

我们的工作有助于子宫内膜异位的知识通过提供新的子宫腺肌瘤的流体成分数据。Ecto-nucleotidases活动是可量化的卵巢囊肿送气,并显著增加子宫腺肌瘤的内容较简单的囊肿。此外,识别ecto-nucleotidases轴承液在卵巢囊肿内容打开领域广泛的蛋白质组学和基因组学的研究。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

劳拉Texido,克劳迪娅·罗梅罗,比达尔8月贡献同样这项工作。

确认

作者感谢肿瘤医院银行Universitari de bellvige (IDIBELL生物)的技术援助。他们也感谢Inmaculada戈麦斯de阿兰达她优秀的技术支持和格洛丽亚Gannaway对她的帮助用英语编辑。本研究支持皇家研究院祝您健康卡洛斯三世(格兰特FIS-PI10/00305) MMSGeneralitat de加泰罗尼亚(格兰特SGR2009/152)。