文摘
野玫瑰果粉(右投手)减轻骨关节炎(OA)由于其抗炎和cartilage-protective属性。右投手中包含的物质可能导致其临床疗效。两个右投手的活动(即。,RH-A, from the whole fruit, RH-B, from fruits without seeds) was investigated in human peripheral blood leukocytes (PBL) and primary chondrocytes (NHAC-kn). RH-A and RH-B diminished the secretion of chemokines and cytokines in LPS/IFN-激活PBL,包括CCL5 /咆哮,CXCL10 / IP-10、白介素- 6 (IL), IL - 12。以来最影响转录,基因表达水平显著影响RH-A RH-B。在il - 1治疗正常软骨细胞(NHAC-kn), RH准备减少的表达基质金属蛋白酶- 1 (MMP), MMP-3, MMP-13 ADAMTS-4。这些变化与减少炎性损伤或软骨侵蚀。主成分分析表明,(1)RH-A RH-B修改大量的模式生物标记,和(2)RH-B RH-A表现出来。此外,RH-B包含比RH-A chondroprotective和抗炎成分。因此,右投手恢复PBL和软骨细胞的细胞内稳态。RH准备从水果种子因此预计改进OA-preventive或OA-therapeutic概要文件,随后显示在相关的临床试验。
1。介绍
骨关节炎(OA)反映了退化和细胞外基质(ECM)的侵蚀和随后的关节狭窄的空间。ECM结构的变化是由于酶的激活系统,也就是说,在软骨细胞和基质金属蛋白酶(MMPs)和aggrecanase synoviocytes [1,2]。促炎白介素- 1 (IL)β有关键作用诱导OA软骨细胞表型[3]。同样,一氧化氮(NO)生产也与软骨细胞病理生理变化(4- - - - - -8]。il - 1β激活软骨细胞产生多种趋化因子(9- - - - - -12];这可能反映了细胞招聘的含义在炎症过程中OA的疾病。
天然物质据说减弱或延迟OA的发病和进展。葡萄糖胺和软骨素最有前途的物质识别到目前为止,尽管它们的有效性是一个有争议的问题。临床研究已经证实的有益影响野玫瑰果粉(右投手)治疗OA [13- - - - - -15评论]([16,17])。其成分之一,galacto-lipid (2 s) 1, 2-di-O - [(9 z, 12 z, 15 z) -octadeca-9, 12日15-trienoyl] 3 -β-D-galacto-pyranosyl甘油(GLGPG),发现抑制中性粒细胞的趋化作用13,14),因此可能损害病理生理学细胞招聘OA病变。右投手的其他成分如抗坏血酸、多酚、类黄酮,和不饱和脂肪酸可能有助于缓解OA主要通过其抗炎作用。事实上,右投手提取物和不饱和脂肪酸抑制环氧酶- (COX - 1和COX - 2活动(18,19)和相关的铂族元素2生产(20.]。在之前的在体外研究中,右投手的多个影响生产的炎症介质通过外周血白细胞和软骨细胞的合成代谢和分解代谢的过程描述(20.]。目前的研究旨在识别生物活性的不同部分的野玫瑰果水果和一种改进的野玫瑰果准备使用办公条件的管理。
2。材料和方法
2.1。野玫瑰果准备和试剂
右投手是准备从狗牙蔷薇由Axellus Ishøj,丹麦;RH-A由干野玫瑰果粉末如前所述[20.];RH-B准备从干野玫瑰果,种子被移除之前制备的粉末。主要成分(见表的内容1)衡量标准程序在分析研究中心,实现DSM营养产品,Kaiseraugst(瑞士)。简而言之,桦木酸、齐墩果酸和乌索酸测定根据内部验证方法(可以在请求);分析了维生素C和维生素E EN14130 EN12822,根据官方的方法分别;亚油酸、EPA和DHA测量根据官方的ISO 12966 - 2的方法。右投手的解决方案准备在DMSO和添加到培养基与刺激的代理。大肠杆菌脂多糖(LPS、血清型055:B5)和胎牛血清(的边后卫)从σ/奥尔德里奇(密苏里州圣路易)。RPMI 1640、DMEM 2-mercaptoethanol, MEM不必要的氨基酸(NEAA)从英杰公司(CA)卡尔斯巴德。人类il - 1β和重组干扰素-γ(IFN -γ)从PeproTech EC(英国伦敦)。
2.2。细胞培养
人类外周血白细胞(PBL)和主要来自健康个体的软骨细胞培养和治疗炎症刺激[描述20.- - - - - -22]。人类主要的细胞培养协议和在体外外周血白细胞实验通过瑞士联邦公共卫生办公室(没有。A050573/2)和伦理委员会的坎顿阿尔高,瑞士。PBL是获得健康的捐赠者。PBL (8×106可行的细胞/毫升)培养12 - 24 h在酚红自由RPMI 1640(含0.25%的边后卫,0.1毫米NEAA 50 U /毫升青霉素、50μ50 g / mL链霉素,μ米2-mercaptoethanol)与LPS刺激(100 ng / mL)和干扰素-γ(20 U /毫升)与分级的测试物质。正常的人类从膝盖关节软骨细胞(NHAC-kn)被播种到6-well盘子0.5×106每口井的细胞,表明,激活与10 ng / mL il - 1β补充CBM (Lonza Walkersville MD)的分级测试化合物的数量为4 h。在所有的细胞培养,车辆(即。,DMSO) was included at 0.5% final concentration.
分子分析,NHAC-kn细胞和人外周血细胞溶解在RLT缓冲区(试剂盒、希尔登,德国)4和12 h的文化之后,分别和总RNA提取。分析分泌介质和蛋白质,人外周血培养24 h;上层清液被收集并存储在−80°C到使用进行分析。
2.3。RNA隔离,互补脱氧核糖核酸的合成,rt - pcr
隔离的总RNA,互补dna的合成和定量rt - pcr已经完成之前详细(20.]。
2.4。Multiparametric分析细胞因子、趋化因子和白细胞介素
Multiparametric包买来BIO-RAD实验室(大力神,CA)和用于LiquiChip工作站是200(试剂盒、希尔登,德国)测量分泌蛋白的量。数据评估使用LiquiChip分析器软件(试剂盒)。
2.5。统计分析
数据被统计评估工具前面描述的(20.]。P值< 0.05(通过使用学生的t测试或单向方差分析)被认为反映统计上显著的差异。统计差异治疗组被学生的评估t以及。主成分分析(PCA)与包进行“化学计量学”[23)的统计软件24)使用nipals算法为中心和缩放输入数据。
3所示。结果
3.1。组成RH-A RH-B
RH-B,准备从野玫瑰果果实种子去除后,显示抗炎作用更有效。RH-A截然不同的生物活性和RH-B与不同内容的成分:RH-B包含大量的乌索酸,桦木酸,GLGPG和DHA(表1)。其中,乌索酸,桦木酸和3-omega欧,但不是β胡萝卜素,维生素C,维生素E,显示抗炎作用(我们的未发表的数据和25,26])。删除种子增加的内容生育酚和GLGPG;后者有抗炎作用20.]。其他成分(如维生素C)同质分布在野玫瑰果水果部分。
3.2。RH-A和RH-B外周血白细胞的影响
我们调查的影响,野玫瑰果准备在外周血细胞,这是一个专为靶组织(即营养补充剂。软骨)。有限合伙人/干扰素-γ治疗诱导的分泌大量CCL2 / MCP-1 CCL3 / MIP-1亚兰/ MIP-1β,CCL5 /咆哮,CXCL10 / IP-10, CXCL8 /引发(表2和图1)。野玫瑰果准备的分泌明显减少,例如,CCL5 /咆哮,CXCL10 / IP-10。相反,CXCL8 /引发和CCL3 / MIP-1分泌增加,而其它趋化因子(CCL11 / eotaxin CCL2 / MCP-1,和亚兰/ MIP-1β)没有明显改变。同样的分泌白细胞介素和细胞因子是影响RH准备:il - 6和il - 12 (p70)少的产量增加右投手的存在,而il - 10、il - 1β和肿瘤坏死因子-上级分泌。的分泌CCL5 /咆哮,CXCL10 / IP-10和il - 12 (p70)受到最低检测浓度的影响,而其他的变化(例如,CXCL8 /引发CCL3 / MIP-1右投手浓度和il - 6)要求高。RH-B更有力的影响,因而对炎症介质的影响比其RH-A(见表2)。应该提到,铂族元素的分泌2CCL2 / MCP-1,亚兰/ MIP-1β和细胞因子(例如,il - 1β、il - 6和TNF -)被RH-A刺激或RH-B有限合伙人/干扰素-即使没有γ(图1)。RH-A RH-B并没有损害细胞生存能力(数据没有显示;参见[20.),因为一些细胞参数分段数量没有改变的物质。
(一)总人外周血与LPS刺激/干扰素-γ24小时没有或分级的RH准备。分泌分析物测定的详细的材料和方法。符号的y设在指示的数量有限合伙人/干扰素-分析物检测γ只有刺激细胞。直线:RH-A;虚线:RH-B。,(有限合伙人/干扰素-γ只对有限合伙人/干扰素-γ+ RH)
(b)铂族元素的生产2如果PBL、各种趋化因子和白细胞介素。注意的对数刻度y设在。RH-A和RH-B测试在500年μ克/毫升。和表明RH-A和RH-B之间的显著差异
接下来,我们调查是否右投手是在转录和转录后的水平。基因表达水平变化显示一个模式类似于各自的蛋白质,作为最能说明CXCL10 / IP-10, il - 6和CXCL8 /引发(表3和图2)。RH-A相比,RH-B同行有更强的影响炎症基因的表达。这表明RH-B和有限合伙人/干扰素- RH-A调制γ全身的PBL在转录水平的变化。一个明显的例外是CCL5 /咆哮,释放激活PBL虽然各自的基因活动是几乎没有改变。此外,il - 1β信使rna水平下降了右投手,而细胞放电增加il - 1的含量β(见图1)。右投手诱导铂族元素2在如果在有限合伙人/干扰素- PBL和增加它γ激活PBL(没有显示;参见[20.])。这可能是解释的存在转化为基质的脂肪酸COX-1出版广播公司。
3.3。野玫瑰果准备调节降解基因表达在激活正常的人类软骨细胞
治疗与IL - NHAC-knβ彻底分解代谢和炎症基因的表达水平增加反映OA的感应在正常软骨细胞(表条件4和图3)[12]。在4 h的刺激,il - 1β显著调节分解代谢的基因(金属蛋白酶- 1,MMP-3、MMP-13 ADAMTS-4),细胞因子(il - 1的基因、il - 6和TNF -)和趋化因子(CXCL8 /引发CCL5 /咆哮,CXCL2 / MIP-2和CXCL20 / MIP-3)。RH-A concentration-dependently减少金属蛋白酶- 1和MMP-3表达式> 50%,而MMP-13表达RH-A最高剂量的减少了90%。ADAMTS-4 mRNA水平也减少了~ 50%。促炎细胞因子il - 1的基因和il - 6显著下调。对趋化因子基因(CXCL8 /引发CCL5 /咆哮,CXCL2 / MIP-2和CXCL20 / MIP-3),RH-A减轻他们的表达水平在125 - 500年类似的程度μ克/毫升(减少了80%)。RH-B诱导基因表达的变化与RH-A所观察到的,虽然在金属蛋白酶- 1有数量差异,MMP-13, il - 1、CXCL8 /引发和CCL-2 / MIP-2:一般来说,RH-B施加较弱的影响比RH-A(参见“褶皱变化”在表4)。这与PBL(表的观察3)。值得注意的是,CCL5 /咆哮基因表达显著诱导il - 1β软骨细胞治疗,但它不是在PBL调节。这个观察点细胞和组织的行为模式的右投手,RH-A和RH-B截然不同的影响,分别在PBL和软骨细胞。
3.4。比较野玫瑰果感应变化的变量在不同的细胞类型
为了全面评估野玫瑰果诱导OA生物标志物的变化,我们进行了主成分分析(PCA)。PCA是一种降维方法,允许将一个复杂的高度相关的数据集(例如,所有OA生物标志物)到一个小得多的组不相关的变量,即主成分(pc)。在我们的实验数据集,电脑被视为“meta-biomarker”和派生降低重要性顺序,第一个PC解释大部分的变异(因此代表)的大部分信息包含在原始数据集。策划OA生物标志物在PCA空间允许可视化和解释这些变化,这是非常困难的在高维设置。三种不同的PCAs运行,说明RH-A的全球影响和对人外周血RH-B NHAC-kn上的蛋白和基因水平和基因水平。PCA是基于17 PBL的表达蛋白质,10 PBL基因,分别和14 NHAC-kn基因。在蛋白质水平,有限合伙人/干扰素-γ激活PBL显然是与有限合伙人/干扰素-分离γ激活/ RHP-treated细胞显示PC1治疗效果。另外浓度效应为PC1 RH-A可以观察到。对RH-B浓度影响主要是由主成分2(图可视化4)。在基因层面上,有限合伙人/干扰素-γ激活PBL从高剂量LPS /干扰素-中分离了出来γ激活/ RHP-treated细胞在第一主成分。聚类相似的治疗在PC2表明治疗效果也被观察到。此外,RH-B PC2内产生了比RH-A歧视效应。累积解释变异性(CEV)(解释变化PC1 + PC2 +生物)PBL在蛋白质和基因水平是96%和94%,分别与PC1解释变异的51%和45%。NHAC-kn, CEV 94%变化观察到基因水平(PC1 + PC2 PC1本身解释80%)。治疗效果是可以观察到的,主要反映在PC1,而物质浓度的影响(特别是对比其他剂量)的高剂量主要是区分主成分2。更强的影响RH-B相比RH-A PC1中也可以观察到。综上所述,数据显示的和有益的RH对OA生物标志物的影响比RH-A RH-B是强鉴别器。
(a) PCA所学蛋白(上)和基因(中)
(b)的PCA NHAC-kn基因
4所示。讨论
在这项研究中,一组生物活性的野玫瑰果粉末准备从整个水果或贝壳比较。它提供了证据表明,细胞功能相关的炎症反应和软骨破坏被调制的复杂混合物物质包含在右投手(见表1)。这些已经在小鼠和人类细胞测量模型和完全符合这些之前报道20.]。LPS-activated小鼠巨噬细胞的右投手展出主要是消炎的特性包括减少一氧化氮的生产,cox - 2相关的铂族元素2、各种趋化因子和促炎细胞因子(20.]。在PBL、白细胞介素的表达和细胞因子主要是减轻右投手,而生长因子gm - csf和g - csf增加生产。我们观察到一个二分法对趋化因子表达:CCL5 /咆哮,CCL11 / eotaxin和CXCL10 / IP-10大幅下降,而另一些增强的右投手(例如,CXL8 /引发CCL3 / MIP-1和亚兰/ MIP-1β)。关于CCL5 /咆哮和CXCL8 /引发细胞释放被右投手调制,而基因表达并没有改变。因此,右投手的振幅和长度可以有助于改善急性炎症反应通过更积极动员的淋巴细胞和巨噬细胞,同时抑制了过度细胞动员在OA等慢性炎症过程。这需要进行进一步的实验,右投手应该测试在不同的亚种群PBL如中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。
观察的模式在体外活动更明确的目标组织细胞相同,也就是说,软骨细胞,基因表达的CCL5 /咆哮,CXCL10 / IP-10 CXCL2 / MIP-2, CCL20 / MIP-3降低了右投手。与此同时,基因的表达,降解ECM减弱,从而反映出chondroprotective右投手对软骨组织的影响。以往的研究强调趋化因子在OA的重要性27),与CCL5 /咆哮和CXCL8 /引发被激活在软骨细胞(9- - - - - -11,28]。同样,il - 1β激活强劲修改趋化因子和趋化因子受体表达在软骨细胞(12]。本研究的结果证实了先前的右投手的另一个来源(获得的数据20.]。
还为时过早,明确定义RH-A和RH-B的生物活性成分,其成分明显不同(表1)。把种子从野玫瑰果准备导致更高的抗炎物质内容和桦木酸一样,乌索酸,galactolipids, EPA和DHA。另一方面,种子中脂肪酸的大部分可以作为炎症介质衬底,如铂族元素2。右投手的多个测量作用在不同细胞利用主成分分析法(PCA)进行比较。这些分析表明,RH-A和RH-B强劲的修改或集群模式生物反应,作为营养增补剂的有利影响的预期(综述,例如,29日])。更重要的是,两三个PCAs执行(PBL和NHAC-kn基因层面的)显示,RH-B表现出整体更强的影响比RH-A OA生物标志物。鉴于野玫瑰果在临床研究证明健康的好处(审查看,例如,17]),我们假设在临床研究RH-B更有效或可用于低剂量比RH-A治疗OA的条件。事实上,最近完成了随机active-controlled试验提供证据表明,在原始剂量的一半,这本小说增强玫瑰果粉(RH-B)症状OA患者类似的效果与原始玫瑰果产品(RH-A) [30.]。
5。结论
一种新形式的玫瑰果粉增强了在体外抗炎和chondroprotective属性在人类外周血白细胞和初级软骨细胞。
缩写
| IL: | 白介素 |
| 有限合伙人: | 脂多糖 |
| 没有: | 一氧化氮 |
| MMP的: | 基质金属蛋白酶 |
| 办公自动化: | 骨关节炎 |
| 出版广播公司: | 外周血白细胞 |
| 铂族元素2: | 前列腺素E2 |
| RH: | 野玫瑰果 |
| 右投手: | 野玫瑰果粉末。 |
利益冲突
这项研究是由Axellus inc .)和DSM营养产品,所有作者目前就业。
作者的贡献
约瑟夫Schwager和娜塔莉理查德了同样的工作。
确认
作者感谢j . Schierle和k·谢弗提供数据的玫瑰果成分和s·约翰森在纸上宝贵的意见。