文摘

乙胺嗪(12月)是一个antifilarial药物强有力的抗炎特性结果的干扰花生四烯酸的代谢。本研究的目的是评估的抗炎活动12月急性炎症的小鼠模型(carrageenan-induced胸膜炎)。注射角叉菜胶进入胸膜腔诱导液含有大量的积累多形核细胞(中性粒细胞)以及中性粒细胞在肺组织的渗透和增加产量的亚硝酸盐和肿瘤坏死因子-α和增加interleukin-1的表达式β、环氧合酶(cox - 2)和诱导一氧化氮合酶。角叉菜胶诱导核转录因子的表达——κb的口服12月(50毫克/公斤)三天前角叉菜胶的挑战导致显著减少炎症标记物。目前的研究结果显示,12月是一个潜在的药物治疗急性肺的炎症。

1。介绍

自1947年以来,枸橼酸乙胺嗪(DEC)被用于淋巴丝虫病的治疗和控制,这是由线虫引起的班氏丝虫,与象皮病马来丝虫和b . timori使用的药物,是消除淋巴丝虫病全球计划(1]。然而,尽管其长时间的使用,关于其作用机制所知甚少。

药理研究表明12月影响花生四烯酸的代谢,从而作为一种抗炎药物。大量证据表明,12月块许多步骤在环氧合酶(COX)和脂氧合酶途径。白三烯生产的这种药物是一种有效的拦截器,和支气管血管收缩的物质,还能抑制前列腺素的生产(PGE2),环前列腺素(PGI2)和血栓素A2 (TXA2) [2]。

据马修斯和墨菲(1982)(312月),抑制LTB的形成₄和sulfidopeptide白细胞三烯,强有力的vaso /支气管收缩的,肥大细胞瘤,同时刺激5-hydroxyeicosatetraenoic酸的形成,表明该网站12月的行动抑制白细胞三烯可能白三烯的形成₄合成酶的反应。此外,巴赫和Brashler (1986) (4)12月发现抑制的形成sulfidopeptide白细胞三烯在老鼠嗜碱细胞白血病细胞。

临床研究发现,12月是非常有效的治疗支气管哮喘的症状(5,6]。最近的研究在我们实验室合作进行显示,12月起着重要的作用在阻塞肺嗜酸性小鼠炎症与卵清蛋白致敏,有效地防止后续的气道阻力的影响,Th1 / Th2细胞因子的生产,肺嗜酸性粒细胞聚集,eosinophilopoiesis在活的有机体内和体外。此外,12月直接抑制interleukin-5-dependent eosinophilopoiesis在天真的骨髓7]。

Carrageenan-induced炎症局部急性炎症模型通常用于评估抗炎药的活动(8)和评估细胞和介质炎症过程的贡献(9]。炎症过程总是以生产前列腺素,白细胞三烯、组胺、缓激肽,platelet-activating因子、白细胞介素(IL)和细胞迁移10]。招聘多形核细胞(中性粒细胞)循环的发炎组织有一个关键功能的受损组织的分解和重构(11,12]。此外,巨噬细胞参与实验胸膜炎的进展产生促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子α)和il - 1β(13]。carrageenan-induced急性炎症的初始阶段(0到1小时)不被非甾体类抗炎药物,如消炎痛、归因于释放组胺,5 -羟色胺、缓激肽,紧随其后的是一个晚期阶段(1 - 6 h),主要由前列腺素释放归因于持续的感应cyclooxygenase-2 (cox - 2)13,14]。

考虑到12月的消炎作用的结果对花生四烯酸代谢的影响,本研究的目的是探讨这种药物的抗炎作用的模型carrageenan-induced胸膜炎(4小时),确定后炎症反应的终点:(1)中性粒细胞浸润;(2)肺损伤(组织学和超微结构);(3)TNF的表达α(ELISA和免疫组织化学);(4)il - 1的表达β、cox - 2(免疫组织化学和免疫印迹)、一氧化氮合酶(间接宾语),免疫组织化学和核因子-κB p65 (NFkB p65)(免疫印迹);和(5)的合成一氧化氮(NO)(亚硝酸盐浓度)。

2。材料和方法

2.1。动物

男性瑞士老鼠(重量:20 - 25克;CPqAM /聚乙烯、巴西)制度批准后使用协议(CEUA # LW-47/10)。动物们被安置在一个受控环境和提供标准的啮齿动物食物和水。

2.2。实验小组

老鼠被随机分配到下面的组:(我)假+水组:卡拉胶组中相同的手术(汽车)进行,但是盐水是管理,而不是卡拉胶(胸膜内的)();(2)车+水组:老鼠受到carrageenan-induced胸膜炎(胸膜内的)();(3)汽车+ 12月组:老鼠受到carrageenan-induced胸膜炎和乙胺嗪(50毫克/公斤,口服途径)卡拉胶的挑战(前三天);(iv)汽车+挪作他用组:老鼠受到carrageenan-induced胸膜炎和消炎痛(5毫克/公斤,口服途径)卡拉胶的挑战(前三天)。

淋巴丝虫病的治疗剂量方案由世界卫生组织推荐为12天(6毫克/公斤15]。老鼠的总代谢率大约是人类的七倍,50毫克/公斤的12月是根据体重调整(16]。吲哚美辛的剂量(5毫克/公斤)是基于一项研究[17]。

2.3。Carrageenan-Induced胸膜炎

肌内注射的小鼠麻醉的10%盐酸氯胺酮(115毫克/公斤)和2%甲苯噻嗪(10毫克/公斤)。确认镇痛后,右边的胸部被剃和无菌生理盐水或无菌生理盐水含有1%λ卡拉胶(0.1毫升)管理进入胸膜腔在第六肋间隙。角叉菜胶注射后4小时,动物是通过公司牺牲₂吸入。胸部是小心地打开了,胸膜腔冲洗1毫升含有肝素的生理盐水(5 U /毫升)18]。渗出物和清洗解决方案被移除的愿望。任何分泌物污染的血液被丢弃。胸膜腔的流体样品收集确定总白细胞含量。

总白细胞测定在纽鲍尔室与土耳其的渗出物稀释的解决方案(1:20)17]。随着carrageenan-induced胸膜的炎症反应空间的老鼠有两相的概要文件,达到4和胸膜炎感应48 h后,炎症介质的表达测量4 h后注射角叉菜胶,基于以前的研究(8]。

2.4。组织学检查

肺活检是基础4 h后注射角叉菜胶。肺碎片在PBS洗两次,pH值7.2,和固定在Bouin的解决方案(1%饱和苦味酸、甲醛和40%冰醋酸)8小时,越来越乙醇系列脱水,二甲苯清除,嵌入在纯化石蜡(VETEC、圣保罗、SP、巴西)。组织部分5μm是减少使用切片机(徕卡RM 2125 rt), deparaffinized二甲苯,与苏木精和伊红染色,研究了使用光学显微镜(19]。

2.5。电子透射显微镜

肺片段被固定在一个解决方案包含2.5%戊二醛和4%多聚甲醛在0.1甲次砷酸盐缓冲。样本然后洗两次相同的缓冲和后缀在溶液中含有1%的四氧化锇,2毫米氯化钙、铁氰化钾和0.8% 0.1甲次砷酸盐缓冲,pH值为7.2,在丙酮脱水,嵌入在嵌入812。聚合进行了60°C三天(20.]。超薄部分被收集在300 -镍网网格,复染色以5%醋酸双氧铀及柠檬酸铅,并检查使用范Morgani 268 d透射电子显微镜。

2.6。免疫组织化学定位TNF -α,il - 1β、cox - 2和进气阀打开

五个部分(5μ米厚)从每组剪切和坚持幻灯片处理3-aminopropyltriethoxysilane(猿(美国σ))。短暂,部分deparaffinized二甲苯和患者分级乙醇(70%到100)。尽量减少内源性过氧化物酶活动,幻灯片处理10% (v / v) H₂O₂在水中了15分钟。部分是用0.01 PBS (pH值7.2),然后用1% BSA屏蔽,0.2%在PBS渐变20 1 h在室温下。一夜之间,部分被孵化与anti-TNF - 4°Cα抗体(美国CA ABCAM 1: 250), anti-IL-1β美国圣地亚哥抗体(GenWay CA, 1: 250), anti-COX-2抗体(美国CA ABCAM, 1: 400),和anti-iNOS (ABCAM、钙、美国,1:50)。的抗原抗体反应是可视化avidin-biotin过氧化物酶(Dako普遍LSAB +工具包,过氧化物酶),使用3,3-diaminobenzidine色原体。幻灯片和苏木精复染色。布朗阳性染色导致反应产物。五张照片在同一放大定量分析使用Gimp 2.6软件程序(GNU图像处理程序,UNIX平台)。

2.7。髓过氧化酶(MPO)活动

MPO活性,中性粒细胞聚集的一个指标,确定如前所述[21]。肺组织和体重,获得每一个均相溶液中含0.5% (w / v) hexadecyltrimethylammonium溴铵溶解在10毫米磷酸钾缓冲(pH值7)和离心机在20000×30分钟g在4°C。上层清液的整除然后被允许与溶液反应tetramethylbenzidine过氧化氢(1.6毫米)和0.1毫米。吸光度的变化率测量spectrophotometrically 450海里。

2.8。测量肿瘤坏死因子-α水平

肿瘤坏死因子-α渗出液中进行评估水平4 h后注射角叉菜胶诱导胸膜炎。进行了分析通过使用immunoenzymatic化验,商业酶联免疫试剂盒(ABCAM、钙、美国、猫。不。ab100747)。较低的检出限的测定是60 pg / mL。

2.9。没有测量

格里斯比色反应是用于测量一氧化氮,包括亚硝酸盐的检测)和胸膜液的氧化。一式两份,50μL的胸膜液添加到96 - ELISA板,其次是同样体积的格里斯试剂,由1%磺胺稀释2.5% H₃阿宝₄(解决方案)和N-1-naphtyl-ethylenediamine也稀释2.5% H₃阿宝₄(解决方案B)。准备的标准曲线,亚硝酸钠溶液初始浓度的100μM是连续在PBS稀释。在黑暗中孵化后10分钟,阅读在490 nm的分光光度计。比较了不同样品的吸光度标准曲线和结果表示为平均值±标准错误的重复,使用GraphPad棱镜程序(v . 5.0) (22]。

2.10。免疫印迹分析cox - 2, il - 1β和NFκB

肺部很快被切割和均质惠顿开销搅拌器(没有。903475)在一个提取鸡尾酒(10毫米乙二胺四乙酸(EDTA), 2毫米phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF), 100毫米氟化钠(氟化钠),焦磷酸钠10毫米,10毫米原钒酸钠(衣饰归宿₄抑肽酶),10毫克,100毫米三(羟甲基)氨基甲烷,pH值7.4)。匀浆在3000×g离心10分钟。上层清液储存在−70°C到用于免疫印迹。布拉德福德蛋白质含量测定的方法使用牛血清白蛋白作为标准(23]。蛋白质(40μ克/μL) 10% (cox - 2和NF中分离了出来κ(il - 1 B)或14%β),十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳在简化条件下,electrophoretically转移到硝化纤维素膜(生物Rad、钙、美国Ref。162 - 0115年)。阻塞后一夜之间在4°C和5%脱脂牛奶TBS-T (Tris-buffered盐水渐变20 0.1% + 0.05%,pH值7.4),膜是在室温下孵化3 h和兔多克隆抗体对cox - 2(1: 1000稀释;美国CA ABCAM), il - 1β(1:2000稀释,Genway,圣地亚哥,美国)和NFκB(1: 200稀释,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA,美国)在缓冲溶液稀释TBS-T含有3%脱脂牛奶。洗后六次TBS-T(10分钟),膜的进一步反应辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit或anti-mouse二级抗体(1:80000 (Ref A6154)和1:80000 (Ref A5420),分别;美国σ)稀释在TBS-T 1%脱脂牛奶在室温下1小时30分钟。一个增强化学发光试剂(超级信号,皮尔斯,Ref。34080)被用于制造标记蛋白乐队可见光和x射线胶片上的墨迹了(富士医疗、柯达、裁判Z358487-50EA)。量化,每个乐队的像素密度确定使用ImageJ 1.38程序(可用http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html;由韦恩Rasband NIH,马里兰州贝塞斯达,美国)。对于每个蛋白质研究,研究结果证实了在三组实验。免疫印迹,β肌动蛋白作为控制执行上述蛋白质印迹。

后的可视化增强化学发光的蛋白质印迹蛋白质抗体被膜,reprobed单克隆抗-β肌动蛋白抗体(1:2000稀释,σ,美国),和蛋白质微随后被执行。

2.11。数据分析

所有的值表示为均值和标准平均误差(±S.E.M.)观察。在在活的有机体内研究中,代表的动物数量研究。分析的结果是单向方差分析之后,图基的后续测试,使用GraphPad棱镜程序(v . 5.0)。所有值小于0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。12月对白细胞游走的影响

胸膜腔的注射角叉菜胶诱发小鼠急性炎症反应的特点是液体含有大量的中性粒细胞的积累。然而,中性粒细胞的数量显著降低,治疗前三天与12月和印度尼西亚(和白细胞、职责)相比,接受了卡拉胶未经治疗的那组(白细胞)(图1)。

3.2。乙胺嗪对Carrageenan-Induced组织损伤的影响

组织学分析显示,动物carrageenan-induced胸膜炎展出离散肺泡增厚由于增加了细胞结构,轻度出血和拥堵,凋亡细胞,炎症细胞(单核和多形核的细胞)和肺水肿和肺气肿(图2(一个))。治疗三天,12月减伤和中性粒细胞的浸润的程度(图2 (b))。肺部虚假的组表现出保存形态特征。

动物的肺超微结构分析虚假组显示保存形态模式,如呼吸空间,包括肺泡上皮由pneumocytes(没有显示)。动物的肺组织carrageenan-induced胸膜炎透露II型pneumocytes与含有electrodense颗粒的层状的身体,液泡,髓鞘的身体,描述细胞的痛苦。大量的胶原纤维也被观察到的间隙空间,增加其厚度(数字3(一个)和3 (b))。动物治疗12月表现出相似的保护肺泡上皮假组(图中找到3 (c))。

3.3。12月在老鼠MPO活性的影响

中性粒细胞的胸膜渗透似乎与白细胞的涌入到肺组织;因此我们调查了12月对中性白细胞浸润的影响测量的MPO活性。这种酶活性显著升高4 h后车管理。12月显著减毒治疗嗜中性粒细胞浸润肺组织(图4)。

3.4。12月对TNF的表达的影响α,il - 1β、cox - 2和进气阀打开

TNF的表达α,il - 1β、cox - 2和伊诺的肺组织被免疫组织化学检测评估。组织部分来自汽车组的小鼠对TNF -阳性染色α在肺泡细胞、巨噬细胞和血管壁(图5(一个);微分析:图5 (c))。相比之下,没有染色TNF -α被发现在小鼠的肺治疗12月(图5 (b);微分析:图5 (c))。同样,没有积极的染色TNF -α在从sham-treated小鼠肺组织被发现。

从小鼠肺组织部分汽车集团展示了il - 1的阳性反应β在肺泡巨噬细胞(图6(一);微分析:图6 (c))。12月三天治疗显著降低il - 1的程度β表达式(图6 (b);微分析:图6 (c))。没有对il - 1标记β从小鼠肺组织获得虚假的组。

从小鼠肺组织部分汽车组显示相当大的cox - 2表达(图7(一);微图分析7 (c)),而cox - 2表达显著降低肺部分来自老鼠(图12月处理7 (b);微分析:图7 (c))。小鼠的肺部分虚假组基线水平的cox - 2表达。

从汽车组小鼠肺部分显示阳性染色为伊诺在肺泡巨噬细胞(图8(一个);微分析:图8 (c)),而12月治疗显著减毒伊诺表达式(图8 (b);微分析:8 c)。小染色观察伊诺的肺组织获得虚假的组。

3.5。12月对肿瘤坏死因子的影响α也没有在胸膜渗出物浓度

肿瘤坏死因子-的浓度α胸膜渗出物中使用酶联免疫吸附分析(ELISA)进行了分析。Carrageenan-induced胸膜炎促进高水平的肿瘤坏死因子-α胸膜渗出物中比较虚假的集团,而治疗12月三天前诱导胸膜炎显著减毒TNF -的生产α。相比之下,用消炎痛治疗推广没有减少促炎细胞因子的水平(图9(一个))。

没有在胸膜渗出物通过格里斯反应进行了分析。渗出物中没有水平显著增加在汽车组相比,虚假的组。然而,治疗12月和印度尼西亚没有显著降低水平相比汽车集团(图9 (b))。

3.6。免疫印迹分析cox - 2, il - 1β和NFκB

cox - 2在肺匀浆的研究通过免疫印迹分析归纳后4小时胸膜炎。基线水平的cox - 2在小鼠中发现在虚假的集团,而肺组织中cox - 2水平显著增加汽车集团。然而,治疗12月显著降低cox - 2的表达。出人意料地,用消炎痛治疗没有降低cox - 2的水平相比,汽车集团(图10)。

基线水平的il - 1β表达式中检测到肺匀浆的骗局,而增加水平被发现在汽车集团。12月和印度尼西亚治疗显著降低il - 1β水平相比汽车集团(图11)。

NFκ肺的B p65水平也显著增加4 h后注射角叉菜胶假组相比,而12月和显著减少了NF挪作他用κB水平相比汽车集团(图12)。

4所示。讨论

急性肺部炎症与促炎细胞因子的形成增强TNF -α和il - 1β、诱导cox - 2和活性氧(ROS)的生产,如过氧化氢、过氧化物和羟基自由基(9,24]。在目前的研究中,进入胸膜腔注射角叉菜胶诱导中性粒细胞浸润,肺损伤(细胞浸润、水肿、肺泡厚度、髓鞘的身体,和大液泡),和促炎细胞因子的生产以及cox - 2和NOS。此外,组织学和超微结构的分析表明,12月有效地阻止carrageenan-induced肺损伤。

氧化应激可以扮演关键角色在急性和慢性炎症反应,如肺损伤。激活白细胞、中性粒细胞等,参与急性炎症前细胞反应过程促进多种活性氧的释放(17]。没有合成了伊诺在炎症和另一个自由基存在可以相互交流ROS增加自由基的作用[25]。这些激进分子被释放各种细胞类型对TNF -刺激做出的反应α和il - 1β,所有这些转录因子的激活胞质形式NF-kappaB通过释放一种抑制蛋白质亚基(26]。

实验证据显然已经表明NF -κB的调节中起着重要的作用的大量基因负责介质或蛋白质的生成carrageenan-induced急性肺部炎症,如肿瘤坏死因子-α,il - 1β,进气阀打开,cox - 2 (8]。目前的研究结果表明,注射角叉菜胶引起的炎症过程胸膜腔导致TNF水平,大幅增加α和il - 1β渗出物和肺部组织。因此,抑制肿瘤坏死因子的释放α和il - 1β本研究中描述的12月可以归因于抑制NF -激活的影响κ然而,还需要进一步的研究来阐明相关的信号转导途径。

在人类肺,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,巨噬细胞,血小板,气道上皮细胞被描述为lipoxygenase-derived花生四烯酸的主要细胞来源的产品和12月已经作为一种强有力的肺泡巨噬细胞的脂氧合酶抑制剂通过阻断趋化因子的释放活动(27]。此外,Stenmark et al。28]发现12块脂肪氧合酶途径在肺动脉高压的发病机制野百合碱诱导的小鼠。脂氧合酶产品强有力的炎性因子,诱导血管渗透性和支气管收缩。根据作者引用,治疗12月改善血压和心脏重量,减少中性粒细胞的数量在支气管肺泡灌洗液,和减少前列腺素和血栓素的水平。

Carrageenan-induced胸膜炎是一个良好的实验模型,用来评估炎症细胞迁移和其他炎症参数。非甾体类抗炎药物是有效地抑制细胞迁移和渗出物(29日]。根据目前的结果,进入胸膜腔注射角叉菜胶诱导中性粒细胞浸润,但12月治疗显著降低白细胞的渗出物的数量。

使用carrageenan-induced模型的急性炎症,汤姆林森et al。9]证明了大量中性粒细胞增加生产COX - 2和伊诺胸膜炎的感应后,随着炎症的进展和细胞群从中性粒细胞单核概要和考克斯和NOS活性降低。作者建议,选择性cox - 2抑制剂的使用和伊诺在急性炎症可能比现有的疗法更有利。一般来说,iNOS-derived没有而且COX-2-derived后卫都参与急性和慢性炎症30.]。

有足够的证据在卡拉胶和其他炎症模型,增强诱导后的前列腺素类cox - 2的形成导致炎症的病理生理学31日,32),选择性cox - 2抑制剂发挥强有力的抗炎作用。目前的结果表明,治疗12月明显降低肺组织中cox - 2的水平,观察与其他非甾体类抗炎药。12月能抑制血小板聚集,可能是由于其对COX通路的影响(2没有相似的途径),因为都有本构和诱导酶的亚型和炎症反应的关键调节因素33,34]。

在一项研究中对伊诺基因敲除小鼠(伊诺−−),Mcgarry et al。35]表明一氧化氮合酶(间接宾语)通路可能施加影响12月通过与环氧酶的交互活动。作者发现,12月没有microfilaricidal活动iNOS-deficient老鼠感染马来丝虫有一个显著的减少COX-1腹膜渗出物中蛋白质。因此,进气阀打开/ COX通路似乎是一个重要的事件的快速隔离治疗12月后微丝蚴。

Queto et al。7]表明,12月有一个重要的行动阻止嗜酸性小鼠肺部炎症和卵白蛋白致敏。12月减少了治疗支气管肺泡液体和组织嗜酸性粒细胞的渗透和改变了一代的细胞因子参与生产、活化、迁移的嗜酸性粒细胞。作者提供了第一个证据的治疗机理模型中12月嗜酸性肺部炎症。有趣的是,12月块肺代答,Th2细胞因子的生产,和嗜酸性粒细胞的积累以及eosinophilopoiesis在活的有机体内和在体外通过进气阀打开/ CD95L机制。

抑制剂的NOS活性降低carrageenan-induced炎症和指示作用的发展没有与这个炎症模型相关的病理生理学(36,37]。目前的结果表明治疗12月后的抑制NOS活性,因为亚硝酸盐的形成是在胸膜渗出液明显减少。

总之,目前的研究结果首次证明,政府12月的角叉菜胶引起的急性炎症模型,导致肺损伤,减少中性粒细胞迁移,没有生产的形成,和促炎细胞因子的释放和COX - 2,从而证实了先前的观察,12月有效行为通过NOS /考克斯机制。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这个研究是企业管理学院德基金会支持的“Ciencia e Tecnologia做Estado de伯南布哥(FACEPE) Aggeu Magalhaes Oswaldo Cruz基金会研究中心在累西腓,巴西(CPqAM / FIOCRUZ)和国家结构生物学与Bioimagem (INBEB)。