文摘
二次外层膜的分子机制形成后(erm)增生性糖尿病视网膜病变(PDR)或主要特发性erm仍知之甚少。因此,目前的研究集中在评估IGF1,IGF1R,IGFBP3erm的mRNA水平和PBMCs PDR患者。检查小组由6后二次erm PDR患者和对照组的11例特发性erm。量化的IGF1,IGF1R,IGFBP3信使rna是由实时存在技术。嗯,IGF1和IGF1RmRNA水平明显高于糖尿病患者与对照组相比。PBMCs,没有显著差异IGF1,IGF1R,IGFBP3表达在糖尿病和非糖尿病的病人之间。总之,我们的研究表明IGF1和IGF1Rerm的微分表达式,但不是PBMCs,糖尿病和非糖尿病的病人,这表明这些因素可以参与发病或增生性疾病适应症的进展。这个试验是注册NCT00841334。
1。介绍
增生性糖尿病视网膜病变(PDR)是一种常见的和特定的糖尿病微血管并发症。炎症、血管生成和纤维化的发病机理主要过程PDR (1]。此外,大镰刀刀柄et al。2)表明,缺氧和新生血管性细胞因子的生产可能发挥重要作用在外层膜(ERM)形成PDR患者。
外层膜是一层病理组织,它只生长在视网膜的内表面3,4]。erm可以特发性(iERM)或次要一些病理条件,包括增生性糖尿病视网膜病变玻璃体增殖(PVR)、黄斑、高度近视、葡萄膜炎和其他视网膜退行性疾病(5]。根据erm的持续时间和严重程度,感觉症状病人可以从轻微到严重视不同,视力下降引起的视网膜扭曲和牵引适应症甚至牵引性视网膜剥离等问题(6]。众所周知,erm PDR主要是由新的病理血管。相反,特发性erm包括nonangiogenic fibroglial组织(7]。然而,分子机制形成的主数据和辅助erm在糖尿病和非糖尿病的病人仍知之甚少。
一些细胞因子,包括胰岛素样生长因子(IGF),参与erm的发展(8- - - - - -10]。IGF家族由配体:IGF1 IGF2,胰岛素;六个结合蛋白(IGFBP1到6);和细胞表面受体,包括IGF1R IGF2R,胰岛素受体(11]。许多最近的研究表明,IGF1和IGF2可能参与PDR的发病机理;然而,确切的作用尚未充分理解(12,13]。最近的报告表明,增加IGF1活动可能导致视网膜新生血管形成的特征PDR (14,15]。igf也参与刺激外层膜收缩(9]。此外,胰岛素样生长因子系统是与炎症相关过程(16,17]。
之前已有无数人尝试找出各种蛋白质在血清或信使rna在外周血单核细胞(PBMCs),它可以很容易地访问和作为标记intratissue过程在各种疾病13,18]。然而,当地浓度不同的生长因子在视网膜上可能比系统性重要水平在糖尿病视网膜病变的发病机理。只有一些公布的数据关于mRNA水平间的差异IGF在糖尿病和非糖尿病的患者的眼部组织19- - - - - -22]。因此,目前的研究集中在mRNA水平的评估IGF1,IGF1R,IGFBP3在erm和PBMCs增生性糖尿病性视网膜病变患者。
2。材料和方法
2.1。主题
血液样本17个病人和手术切除erm从17眼睛获得这些患者,分为糖尿病和非糖尿病患者的。审查小组由6例(3女性和男性,平均年龄72.9岁;范围66 - 80年)后与二次erm PDR和对照组由11例(8女性和3男性,平均年龄69.7;与iERMs范围61 - 79年)(表1)。所有患者治疗的眼科学系大学医院5号,医科大学的西里西亚,卡托维兹,波兰。
在诊断的条件和实际手术条件是2到16个月。一些病人,手术两个月之内。当患者无症状或有很好的视力erm临床确诊,不需要立即手术。膜的平均持续时间在场的眼睛之前移除是6.4个月(范围3 - 10个月)对PDR和iERM 8.6个月(范围- 18个月)。所有的受试者都接受一个完整的眼科检查:最佳矫正视力(BCVA),张力测定法,裂隙灯检查前和后段,眼睛的超声和光学相干断层扫描(OCT)的中央视网膜。在分子分析中包含的标准如下:患者白种人的种族,雄性和雌性,≥55岁,患有特发性erm或二级erm PDR。ERM的存在被证实在10月考试。所有患者合格的外科治疗ERM-unilateral术后玻璃体切除术(PPV)。
这项研究是由医科大学生物伦理学委员会批准在卡托维兹(认识/ 0022 / KB1/82/12)符合赫尔辛基宣言关于涉及人类受试者的医学研究。所有患者被告知研究和签署知情同意书。
2.2。组织
期间收集的样本的erm是术后玻璃体切除术,使用人工microforceps,存储为48 h−70°C到RNA提取。静脉血液样本被收集到EDTA-containing管和外周单核细胞分离得到5毫升标本来自每个病人用Ficoll-Conray密度梯度离心法在1500 rpm为30分钟后在室温下采血(比重1.077;免疫生物有限公司,日本群马县)。
2.3。从组织标本中提取核糖核酸
从erm提取的总RNA,用试剂盒PBMCs试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。RNA提取DNase对待我(MBI Fermentas维尔纽斯,立陶宛)根据制造商的指示。提取物的质量检查electrophoretically用0.8%琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色。结果分析和记录使用1 d Bas-Sys凝胶文档系统(Biotech-Fisher,珀斯,澳大利亚)。总RNA浓度的分光光度测量5μL毛细管使用基因定量II RNA / DNA计算器(法玛西亚生物技术,剑桥,英国)。
2.4。定量实时聚合酶链反应测定
的表达的检测IGF1,IGF1R,IGFBP3和glyceraldehyde-3-phosphate (GAPDH)mrna进行了使用中存在与SYBR绿色化学技术(SYBR绿色Quantitect rt - pcr装备,试剂盒)和一个内髓发动机连续DNA荧光检测器(MJ研究)如前所述23]。所有样品都测试了一式三份。GAPDH为每个样品测量排除可能的rt - pcr抑制剂。寡核苷酸引物,具体IGF1,IGF1R,IGFBP3设计的基础上,参考序列(加入基因库。NM_000618.3、NM_000875.3 NM_000598.4、职责)使用底漆ExpressTM 2.0版本软件(PE应用生物系统公司,福斯特城、钙、美国)。检测GAPDH如前所述(执行mrna23)(表2)。一步法rt - pcr的热剖面如下:逆转录50°C 30分钟,变性为15分钟在95°C,和40周期包括以下温度和时间间隔:15秒94°C, 60°CGAPDH61.1°CIGF156.4°CIGF1R和54.2°CIGFBP330年代,30年代的72°C。每次运行完成后使用融化曲线分析确认扩增的特异性和没有引物二聚体。rt - pcr产物分离与银盐6%聚丙烯酰胺凝胶和可视化。
2.5。量化目标基因的表达
量化与rt - pcr的结果IGF1,IGF1R,IGFBP3,GAPDH,一个标准曲线法23,24]。商业上可用的标准β肌动蛋白cDNA (TaqMan DNA模板试剂装备,PE应用生物系统公司,福斯特,CA)是在五个不同浓度(0.6,1.2,3.0,6.0,和12.0 ng /μL),同时检测每一个研究基因的表达谱。对于标准,拷贝数的计算值是基于以下关系:1 ng = 333基因组DNA等价物(PE应用生物系统公司)。放大图每个稀释的商用标准模板被用来确定Ct值。绘制标准曲线生成的Ct值与已知数量的日志β肌动蛋白互补脱氧核糖核酸复制数据。标准曲线的相关系数从0.988到0.995不等表示高度的信心拷贝数的测量每个样品的分子。
2.6。统计分析
使用Statistica 9.0统计分析软件(StatSoft,塔尔萨,美国),和水平的意义是。值表示为值25和75质量,和最小值和最大值。的Mann-Whitney以及应用于评估表达水平的差异IGF1,IGF1R,IGFBP3。使用斯皮尔曼等级相关检验相关性进行评估。
3所示。结果
3.1。特异性的实时逆转录聚合酶链反应测定
rt - pcr特异性的靶基因被证实实验的基础上amplimers融化温度。对于每一个rt - pcr产物,一个峰值在预期的温度下观察:IGF177.6°C;IGF1R77.4°C;IGFBP382.4°CGAPDH80.0°C(数据未显示)。凝胶电泳还显示一个单一产品的存在预测长度(数据没有显示)。
3.2。的差异IGF1,IGF1R,IGFBP3表达水平在糖尿病和非糖尿病的患者
IGF1和IGF1R信使rna被发现在所有测试erm和PBMCs从控制和获得学习小组。然而,IGFBP3只有在PBMCs发现所有的病人。嗯,mRNA水平IGF1明显高于糖尿病患者(值= 271信使rna复制/μ克总RNA)比非糖尿病患者组的控制iERMs mRNA(值= 85 /副本μ克总RNA)。在的情况下IGF1R,表达也显著大于在erm PDR(值= 1341 mRNA /副本μ克总RNA)相比,特发性erm mRNA(值= 938 /副本μ克总RNA) (,Mann-Whitney以及)(图1)。
在PBMCs,没有表达明显不同IGF1,IGF1R,IGFBP3糖尿病(值= 163之间的信使rna /副本μ克总RNA;298信使rna复制/μ克总RNA;1211信使rna复制/μ克总RNA, resp)和非糖尿病的患者(值= 144 mRNA /副本μ克总RNA;308信使rna复制/μ克总RNA;1209信使rna复制/μ克总RNA,职责。)(IGF1 ,IGF1R ,IGFBP3 ,Mann-Whitney以及)(图2)。
3.3。之间的相关性IGF1,IGF1R,IGFBP3表达水平以及诊断和手术之间的时间间隔
之间没有相关性之间的时间间隔的诊断条件和实际手术和的表达IGF1,IGF1R,IGFBP3erm和PBMCs糖尿病的样本。对应于糖尿病患者的结果,在iERMs和PBMCs非糖尿病的病人,没有的表达之间的相关性IGF1,IGF1R,IGFBP3基因和诊断之间的时间间隔检测(表条件和实际手术3)。
4所示。讨论
IGF1 / IGF1R IGFBPs复杂可以参与的生理和病理事件发生在视网膜。先前的研究显示IGF1,IGF1R,IGFBPs表达微血管内皮细胞、周和视网膜色素上皮细胞(RPE)在体外(25- - - - - -27]。因此,建议这些生长因子也会导致汇率机制的进展,特别是在增生性糖尿病性视网膜病变(11]。另一方面,igf的眼睛水平的组织可能的结果,在某种程度上,从损伤到血视网膜屏障。此外,血清中igf / PBMCs水平之间的关系和PDR的发展仍不能完全解释(12]。因此,测定igf的mRNA水平之间的差别在erm和PBMCs糖尿病患者与非糖尿病患者相比使用实时存在似乎是重要的。在目前的研究中,IGF1,IGF1R,IGFBP3mRNA水平在PBMC样本被发现,但在ermIGF1和IGF1R信使rna被确定。它可以解释说,IGFBP3没有造成视网膜细胞的增殖28]。此外,Spoerri et al。29日]表明,外生IGFBP3管理局可以诱导视网膜细胞的生长抑制和凋亡。另一方面,据报道,IGFBP3神经、视网膜损伤后凋亡,抗炎(30.,31日),并可能防止PDR的发展(32]。之前的研究也表明,igf没有参与这些细胞扩散但外层膜收缩的刺激(9]。相比之下,Spraul et al。12)和高木涉et al。25表明IGF1和IGF2能够影响RPE细胞的迁移和增殖能力。反过来,Ruberte et al。33)确定新血管形成一致的增加引起的血管内皮生长因子水平IGF1的视网膜细胞。
统计上显著的更高的mRNA水平IGF1和IGF1Rerm的PDR患者与对照组相比在我们的研究结果证实,iERMs igf可能发挥关键作用PDR的开发或发展。类似的结果证明了其他作者发现蛋白质PDR的IGF1水平显著高于控制病人但人类玻璃样品(34- - - - - -36),而Gerhardinger et al。37)的mRNA水平较低IGF1糖尿病视网膜后期从人类获得捐助者和他们没有观察到的表达变化IGF1R。
有趣的是,我们的研究结果的定量分析IGF1,IGF1R,和IGFBP3在PBMCs发现的三个基因没有明显的统计学差异之间的糖尿病和非糖尿病的病人可能表明,过程发生在眼组织不受系统性影响这些细胞因子的表达水平在糖尿病。对应于我们的结果,佩恩et al。13和跳等。36)发现糖尿病受试者类似IGF1水平比非糖尿病的受试者血清样本。同样,其他作者显示血清IGF1水平之间没有相关性,PDR的发展或进展13,38]。另一方面,一些研究与这些研究结果;例如,莳萝et al。39)和Merimee et al。40)揭示了糖尿病患者的血清IGF1水平更高。此外,Chen等人。14]表明,血清IGF1水平可能是一个因素在糖尿病性视网膜病变。然而,这些差异可能是由于试验方法用于测量IGF1水平。此外,传输机制和igf IGFBPs血液和眼睛之间不是很有名,可能取决于血视网膜屏障的破坏是一个重要的事件在糖尿病视网膜病变的发病机理和其他眼部疾病12]。Haurigot的研究表明,人工IGF1,但不是系统性IGF1,足以引发blood-retinal障碍分解(15]。它可能表明,治疗策略应该比系统旨在抵消当地IGF1的影响(15]。相比之下,跳等。36]表明,分解血视网膜屏障和血清IGF主要决定intravitreal IGF水平而非本地生产。血视网膜屏障的破坏也会导致免疫细胞PDR主管膜的渗透;因此,炎症反应可能发挥作用在外层膜的发展PDR (41]。它也知道IGF1抗炎作用和炎症标记物可以是负相关(16]。之间没有相关性的玻璃和血清水平PDR患者各种生长因子和nonproliferative糖尿病性视网膜病变也被观察到42- - - - - -44]。血清和眼内组织之间缺乏相关性水平可以表明,血清和PBMC各种生长因子的水平可能不是一个有用的预测的糖尿病性视网膜病变严重程度42,43]。此外,我们的研究并没有显示任何相关性IGF1,IGF1R,IGFBP3信使rna水平和诊断之间的时间间隔的条件和手术。
总之,我们的研究表明IGF1和IGF1Rerm的微分表达式,但不是PBMCs,糖尿病和非糖尿病的病人,这表明这些因素可以参与发病或增生性疾病适应症的进展。不幸的是,我们的研究的主要限制是一个相对少量的样本。然而,分析眼样本通常是困难的,因为相关的技术障碍和提取足够量的样品。因此,有必要研究一个更大的人口,进行进一步的分析,例如,蛋白质含量,为了澄清的贡献这些intravitreal生长因子在糖尿病和非糖尿病erm的发展。此外,这将有助于确定更好的增生性糖尿病视网膜病变的治疗策略。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。