文摘

肺结核的诊断仍是挑战与困难的个人提供优质痰样本等孩子。宿主炎症标记物的生物特征可能是有价值的在这种情况下,特别是如果他们是基于更容易获得如唾液样本。探索潜在的唾液作为替代样本在结核病诊断/生物标志物的调查中,我们评估了33个主机水平标记唾液样本从个人表现与肺结核的症状,而他们获得的血清。38个人包括在这项研究中,肺结核疾病确诊11(28.9%)通过痰培养。结核病例和noncases,大多数标记的水平以上的探测下限样品类型,但是没有一致的模式对血清中标记/唾液的比率。Fractalkine IL-17, il - 6、IL-9 MIP-1β、CRP、VEGF和IL-5唾液和il - 6水平,2、SAP和血清SAA含量都明显高于肺结核患者()。这些初步数据显示,在主持人的水平有显著差异表达的标记在血清和唾液表示相比炎症标记物在两个样本类型是潜在的诊断肺结核疾病的候选人。

1。介绍

结核病仍然是一个全球卫生问题。估计有870万新发病例和140万人死亡的2011年疾病(1]。延迟或失败在疾病的诊断结果在治疗延迟传播的机会随之增加,可能十人感染每年每未经处理的情况下(2]。涂片镜检的低灵敏度,最常用的结核病诊断测试在资源受限的环境中,是众所周知的3,4]。结核分枝杆菌(M.tb)文化设施不是在资源有限的环境中广泛使用和文化结果可能需要42天可用(5]。爱视宝MTB的发展/ RIF测试(美国CA造父变星Inc .)已经在这个领域进步最重要的2小时内测试产量结果加上利福平耐药性的检测(6]。测试有一个汇集了67 - 98%的敏感性和特异性约98%的成人(7]。然而,限制,包括高成本和要求稳定的电力供应和耗材(保质期短8),阻碍测试的大规模推广资源受限和经常高负担的设置。此外,诊断测试基于痰不适合那些有困难的儿童等提供优质痰样本(9)和肺外结核病患者。Immunodiagnostic技术使用宿主生物特征的炎症标记物可能是有价值的在这种情况下10,11),特别是基于更容易获得样本,如唾液和发展成为快速的即时检测。

通过腮腺唾液主要是分泌,颌下和舌下的腺体。它是由98%的水和含有其他物质包括电解质、粘液、抗菌化合物,和各种酶(12]。是大量生产的平均个人所有年龄组和人类产生0.3 - 7毫升唾液,总是约1毫升每分钟在口腔12]。收集唾液很简单,无损伤,和不携带不便或风险的血(13]。

最近有兴趣探索唾液潜在有用的炎症生物标记(13]。基于唾液诊断测试,如艾滋病口腔液体快速测试(14),是商用。尽管大量的结核病生物标志物发现可用的文学研究,其中大部分是基于血清或尿液在较小程度上,(15- - - - - -18)(审核(19- - - - - -21]),唾液,相对容易获得和丰富的样本类型,尚未引起了浓厚的兴趣。在目前的研究中,我们评估了唾液的33个主机标记水平的个体呈现症状暗示肺结核和比较他们的血清中检测到的水平。我们表明,有水平的巨大差异标记表达唾液与血清和唾液的标记可能有潜在的结核病的诊断疾病。

2。材料和方法

2.1。研究参与者

个人疑似肺结核病是从Fisantekraal社区招募在开普敦郊区,南非,作为正在进行的一部分EDCTP-funded非洲欧洲肺结核财团(AE-TBC)研究(http://www.ae-tbc.eu/)。2010年10月招募研究对象开始。当时这个试点研究,50个参与者一直在研究网站,注册和肺结核病已证实11 (22%)。样本的所有11个人确诊结核病和27无结核病随机选择样本银行包括初步研究。这项研究提供了样本中的所有个人包括两(唾液和血清)。

所有的参与者在农村医疗机构肺结核疾病的症状暗示。短暂,参与者提供持续的咳嗽持续≥2周,至少以下之一:发热,不适,最近减肥,盗汗,与结核患者密切接触的知识,咯血、胸痛,或食欲不振。研究参与者的资格,如果他们18岁或以上,愿意给书面知情同意参与这项研究,包括艾滋病毒检测。患者被排除在研究如果他们没有居住在研究区超过3个月,严重贫血(HB < 10 g / L),在抗结核治疗,接受抗结核治疗在过去的90天内,或在喹诺酮氨基糖苷类抗生素在过去60天。在招生,病例报告的形式完成对每个参与者在血液和唾液样本连同其他样本之前,包括尿液和唾液所需的主要研究,收集。卫生研究伦理委员会批准的这项研究是Stellenbosch大学的(参考号N10/08/274)和开普敦的城市。

2.2。样本收集和诊断测试

血液被收集到4毫升纯BD真空采血管管(BD生物科学)和运输环境条件的实验室。在2500 rpm管被离心10分钟后血清是收获,整除,冻结(−80°C),直到使用。唾液收集从所有参与者salivette管(Sarstedt、Numbrecht、德国),根据制造商的指示。唾液样本之后被运送在冰上(4°C)到实验室后salivette管离心机2分钟(1000克),唾液是收获,整除标记管,保持在−80°C到分析。

痰液样本收集的所有参与者被MGIT培养方法(BD生物科学)。积极MGIT样本检查空军基地使用Ziehl-Neelsen方法,检查污染,之后PCR实验进行确认的隔离M.tb复杂的生物。所有人分为结核病例在这项研究有积极的M.tb复杂的种痰文化和其他临床特征符合结核病,包括典型的胸部x光检查。“没有结核病”组的个人负面痰涂片和文化和没有其他迹象暗示的结核病包括消极的胸部x光检查。这些non-TB病例治疗结核病的国家结核控制项目。所有的痰和唾液样本在BSL3实验室处理。

2.3。Luminex多重免疫测定

33主机的水平标记,包括干扰素(IFN)γ白介素(IL) 1β,il - 1α2、il - 4 IL-5, il - 6, IL-7,引发,IL-9, il - 10、il - 12 (p70) IL-13, IL-15 IL-17、可溶性受体α- 2 (sIL-2Rα)、干扰素诱导蛋白(IP) -10年,肿瘤坏死因子(TNF)αfractalkine,粒细胞单核细胞集落刺激因子(gm - csf)、表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白1 (MCP),巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 1β、可溶性CD40配体(sCD40L),转化生长因子(TGF)α、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(g - csf),处于受控(GRO)、c反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A (SAA),血清淀粉样蛋白P (SAP)、基质金属蛋白酶(MMP) 2,和MMP-9评价血清和唾液样本中所有参与者。这是通过使用定制Milliplex套件(默克密理博圣查尔斯,密苏里州,美国)Bio-Plex平台(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。所有样本分析未稀释的(除了MMP-2样本,MMP-9, CRP, SAA,和SAP)和盲法的方式,根据制造商的指示(默克密理博)。样本MMP-2和MMP-9 prediluted 1: 100和c反应蛋白、SAA、和SAP prediluted 1: 8000年,优化后实验(在血清)。血清和唾液样本来自同一个体进行评估在同一个盘子里。试剂质量控制中的所有分析物的水平是在预期的范围内。Bio-Plex管理软件6.0被用于珠平均荧光强度的采集和分析。

2.4。统计分析

结核病患者和参与者之间的差异,分析物的水平之间没有结核病或标记水平检测Mann-Whitney唾液和血清水平进行评估非参数检验数据分析。诊断准确性的标记被接收机研究算子特征(ROC)曲线分析。最优截止值和相关的敏感性和特异性选择基于似然比最高。分析物的组合的预测能力估计通过执行最佳子集一般判别分析(GDA),与分析交叉验证。非正态的分布数据进行对数转换前GDA过程。组之间的差异被认为是重要的如果值< 0.05。数据分析使用GraphPad棱镜,版本5.00 (GraphPad软件,圣地亚哥,加利福尼亚,美国)和STATISTICA(美国俄亥俄州StatSoft)。

3所示。结果

38岁的参与者包括在这项研究中,27(71%)是女性。所有的研究参与者的平均年龄为38.0±10.2。可用的28个研究参与者,Quantiferon管结果,67.9%是积极使用制造商的推荐截止(≥0.35国际单位/毫升)。8(21%)的被调查者艾滋病毒感染(表1)。

3.1。主机在唾液和血清标志物检测

我们评估主机标记的水平高于最低检测浓度(MDC;从制造商获得的包插入),唾液和血清,然后标记的水平相比在唾液中发现血清中获得。33的水平的五个标记评估(MMP-9、IP-10 MIP-1β、MCP-1 sCD40L)高于MDC,血清和唾液样本从所有参与者(100%)。6的水平(引发,g - csf, TGF -α表皮生长因子,VEGF和GRO)高于争取民主变革运动在两个样本类型至少90%的研究对象,而il - 4的水平和IL-9察觉或难以觉察的只有在这两个示例类型,研究参与者(表2)。

平均有3年来更高水平的干扰素-γ,il - 1α白介素(p70)、IL-13 IL-15, IL-17, fractalkine, gm - csf, EGF唾液样本中所有参与者相比,血清水平。il - 1的水平β2、IL-5 il - 6、IL-7引发,il - 10, g - csf, VEGF, MMP-9也明显高于唾液(表2,图1)。平均有4倍更高水平的IP-10 MIP-1βGRO, CRP血清样本中发现的研究参与者相比,唾液的水平。SAA, SAP, sIL-2Rα,MCP-1 sCD40L和MMP-2水平也明显高于血清(表2,图2)。当标记水平获得血清水平相比获得的唾液在结核病或non-TB情况下,相同的表达式模式(获得所有参与者,即两组)观察(数据没有显示)。

3.2。标记的准确性检测唾液中结核病的诊断疾病

当标记的水平在唾液的结核病病例发现水平相比获得的唾液noncases, 8 33的标记(il - 6、CRP、IL-9 IL-5, MIP-1β,IL-17 fractalkine和VEGF)明显不同,或显示两组之间的差异(表的趋势3)。除了VEGF, 8标记都是高水平的中位数在结核病例(表3)。标记的诊断准确性评估时接收机算子特征(ROC)曲线分析、il - 6、CRP, MIP-1β,fractalkine显示潜在的结核病诊断(AUC≥0.70)(表3)。虽然标记诊断结核病的敏感性≥64%截止电平对应于似然比最高,唾CRP, MIP-1β,fractalkine水平确定结核病特异性≥93%(表3,图3)。

当数据从唾液被安装到总体判别分析(GDA)模型、最优预测结核病或没有结核病取得标记是5的组合使用。IL-5、il - 6、IL-15 TNF -α,CRP准确预测81.8%的结核病例和81.4%的noncases后分析交叉验证。最频繁发生的分析物在20最精确的歧视性的模型包括IL-5, il - 6, IL-15, CRP, TNF -α,GRO(图4)。

3.3。标记的准确性在结核病的诊断血清中检测到

当血清标志物水平获得结核病病例相比noncases获得的水平,取得了显著差异四个标记(白介素- 2,SAP, SAA)。il - 6的水平,2和SAP都显著的高于结核病例(),而noncases SAA含量高(表4)。

当诊断血清标志物检测的准确性研究通过ROC曲线分析,所有四个标记显示的AUC显著差异(2、il - 6、SAP和SAP)≥0.70(表4,图4)。的四个标记,只有SAP确定结核病敏感性55%,但特异性85.2%至96.3%为所有四个标记在截止水平对应于最高的似然比(表4,图5)。

当数据从血清样本被安装到GDA模型,预测的准确性5-marker血清分析物往往是贫穷比获得唾液数据生成的模型。il - 6的组合,IL-12p70, g - csf MMP-9, MIP-1β只能预测54.6%的结核病例和81.5%的noncases后分析交叉验证。GDA过程重复时,获得的数据与血清和唾液的总和,模型的预测精度增加。IL-5唾液+ g - csf和il - 6水平,IL-12p70,血清中il - 6准确分类(100%)的结核病例和85.2%的noncases后分析交叉验证。最频繁发生的分析物的预测模型包括标记来自血清和唾液包括血清il - 6、g - csf, IL-12p70唾IL-5, il - 6, IL-7(图4)。

4所示。讨论

我们评估33宿主免疫生物标记物的水平在唾液和血清样本来自个人疑似肺结核病。我们的研究的主要发现是不同的样本中检测到的主机标记表达式类型,高达6倍更高水平的一些标记表示唾液。我们已经表明,唾液、相对容易获得样本类型,可能是一个非常有价值的样本在结核病生物标志物发现调查。有趣的是,一些标记在唾液中发现包括il - 6、CRP, MIP-1β,fractalkine显示潜在的结核病的诊断疾病。

本研究中的所有标记评估炎症标记物包括细胞因子,趋化因子,生长因子,急性期蛋白,和基质金属蛋白酶广泛研究和证明中扮演不同的角色不同的疾病的发病机制,包括结核病。值得注意的是,IL-5的水平,il - 6, IL-9, IL-17 MIP-1βfractalkine、CRP和VEGF在唾液和2,血清中il - 6, SAA, SAP或显示趋势明显不同()之间没有活动性结核病的结核病例和个人疾病。2、il - 6、MIP-1βfractalkine CRP, SAA,唾液和血清中SAP或显示潜在的结核病诊断的候选人,所确定的ROC曲线下的面积。

(综述[- 222])是一种重要的免疫调节细胞因子是由多种细胞类型包括激活t细胞、树突状细胞、NK细胞和免疫反应的都是至关重要的对许多传染病和宽容的维护22]。一直在广泛调查尤其是- 2 t细胞基础研究和显示潜在的结核病诊断标记(23,24]。il - 6(了25])是一种多效性的细胞因子和不同影响免疫反应的规定,炎症、肿瘤形成,造血作用在他人和被广泛称为急性期反应的诱导物。il - 6曾被证明是在更高的生产水平在结核病患者26,27),是唯一的标记显示潜在的诊断候选人在血清和唾液样本。Fractalkine诱导内皮细胞和抗原呈递细胞的各种TH1支持包括干扰素信号γ、CD40L和TNF -α,抑制il - 4的存在/ IL-13 [28]。MIP-1β主要由巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞和t细胞(29日,30.]。已经调查诊断候选人在T细胞为基础的研究中,但一些成年人的研究中所示的潜力(31日,32)是没有证实的儿童(33]。在这项研究中,MIP-1β显示潜在的结核病诊断的唾液而不是血清。CRP, SAA, SAP急性期蛋白和分泌炎症急性期期间,他们作为调理素或细胞炎症的招聘网站(34]。这些非特异性炎症标记物,主要是由肝脏和研究了在许多疾病34,35]。CRP曾被认为是一个标记为诊断(35,36结核病[]和疾病的严重程度37,38]。SAA被建议作为一种比CRP(发炎的敏感指标39),而血清水平增加1000倍,以应对感染(40]。像SAA, SAP在结构上类似于c反应蛋白序列同源性(51%)和SAP水平已经被证明是高结核病小鼠模型,而纯化小鼠SAP抑制的增长M.tb在肺泡巨噬细胞(41]。我们的观察,这些标记具有潜力诊断结核病符合这些先前的发现。

的一个最明显的观察我们的研究的显著差异水平在唾液和血清标志物检测,更高水平的大部分的唾液中标记了。大部分的标记,我们越发表达血清趋化因子(IP-10 MIP-1β和MCP-1),急性期蛋白(CRP、SAA、SAP)和sIL-2R sCD40L,两者都是配体分子激活和分化所需的T细胞,和格罗是一种血管生成中介。更高水平的最常见的促炎细胞因子和生长因子调查获得的唾液。我们的观察与发现协议许多生长因子的唾腺是一个水库在啮齿动物42]。在人类中,EGF、基本成纤维细胞生长因子、胰岛素和胰岛素样生长因子家族成员已发现在唾腺,尽管他们的生理作用还不清楚42]。

虽然调查唾液在结核病生物标志物领域有限,唾液被广泛调查在其它疾病,特别是白血病,口腔癌,口腔扁平苔癣,牙周炎在别人(43,44]。美国FDA批准唾液商业艾滋病毒快速测试目前存在(45]。使用唾液作为诊断的许多优点示例讨论了其他地方(44]。我们的观察证实唾液在结核病生物标志物的潜在有用性的研究。主人的高水平标记唾液意味着这些标记可能更可靠地测量甚至与横向流设备,通常是容易执行,甚至适合远程设置,但往往低检测的局限性。虽然诊断测试基于唾液炎症标记物可能缺乏特异性,这些标记物的水平在其他疾病也可能高,结合临床时标记可能有用的信息。这样的测试将非常有用在结核病诊断领域,考虑到困难时获得诊断结核病痰不足了,当有一个无法咳出痰在年幼的孩子9)和肺外结核病例。本研究中的所有结核病例评估成年人和所有被诊断为肺结核疾病。我们不能确定,根据数据提出了在这项研究中,这些标记是否有用在儿童和肺外结核病患者。因此需要进一步调查的孩子,那些与额外的肺结核和其他肺部疾病。特别是儿童和肺外结核病患者将受益从小说,最容易执行nonsputum诊断测试。虽然生命指标包括炎症细胞因子的使用是非常可取的,需要在结核病诊断提起,谨慎是很重要的,大多数标记确定在本研究中(例如,急性期蛋白)在其他传染病会升高。因此,从这种诊断方法获得的数据将需要解释,考虑到病人的临床情况。

这一个更大的研究是作为一个试点,正在进行的研究,因此,被小样本大小有限,缺乏与其他肺部感染人。然而,我们的观察将作为更多的研究在这个领域概念考虑到诊断测试基于易得的样品像唾液将彻底改变结核病的诊断,特别是如果这些标记并入横向流设备。我们没有调查的影响因素,如食物或饮料摄入量不足前抽样唾生物标志物的水平。这些因素的潜在影响可能需要在进一步的研究调查。

5。结论

总之,本研究中提供的数据表明,有许多不同的主机标记表达的水平相比,血清和唾液样本中检测到的一些标记类型有潜在的结核病的诊断疾病。我们的发现表明唾液可能是一个更好的选择在结核病血清生物标志物发现调查。我们的发现在更大规模的研究值得进一步调查。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢研究参与者,我们研究护士特别是雪莉Mcanda,夫人和SUN-Immunology研究小组的成员为他们的各种角色在确保本文所需的数据。这项工作是由EDCTP通过非洲欧洲结核联盟(AE-TBC,格兰特没有。卓越IP_2009_32040)和试验在非洲南部(德莎、项目代码CG_cb_07_41700),首席研究员:Gerhard Walzl教授。NN Chegou支持由克劳德·莱昂博士后奖学金基金会和南非MRC。