文摘

日益流行的酗酒和与创伤需要准确的动物模型研究中毒对响应的影响,结果烧等伤害。虽然许多研究都集中在酒精剂量和持续时间的影响在随后的炎症参数燃烧后,几乎没有证据表明存在于酒精的路由管理的效果。之前,我们检查了中毒的程度燃烧乙醇是由腹腔内时损伤导致全身炎症(i.p)注射或口服填喂法。我们发现回肠中毒强化postburn损害,肝脏和肺部的老鼠在同等程度上时乙醇使用管理路线。我们也发现了相似的血液反应和循环白细胞介素- 6 (il - 6)水平当乙醇燃烧之前范式实现了中毒。此外,ip和填喂法导致相似的血液酒精浓度在所有时间点测试。总体而言,我们的数据显示一个平等的炎症反应燃烧伤害当中毒是通过腹腔注射或口服填喂法,研究表明结果使用乙醇范式直接可比性。

1。介绍

乙醇是最常见的在美国滥用物质和可预防的死亡的第三大主因1),其中许多与意外伤害(2]。酗酒,定义为血液酒精含量达到0.08 [3尤其是],是中毒越来越普遍的形式(4和创伤病人的饮酒模式特点5]。中枢神经系统抑制剂,酒精可能在许多事故起着决定性作用,但不同的细胞的影响酒精及其代谢产物也可以消极地改变生理反应损伤(6]。小中性化合物能够自由地穿越脂质膜,酒精会影响体内几乎所有的细胞与效果依赖于暴露的持续时间和数量(7]。甚至一个单一剂量的酒精在动物恶化后全身炎症损伤,如烧伤(8,9]。燃烧是一个毁灭性的损伤与一个复杂的自然历史和高与酒精(10]。将近一半的成年烧伤患者有积极的血液酒精浓度(BAC)入学的时候,这容易使他们恶化患者临床结果与类似的伤病不会影响下11]。特别是醉酒的病人被发现是两倍获得感染,需要更多的手术,较长时间呆在重症监护室,和所产生的成本比nonintoxicated同行12]。有趣的是,这些病人不是通常慢性酗酒者但被认为是酗酒13),符合大多数的酒精消费在美国(4]。每年有近450000名烧伤需要就医在美国医疗保健系统(14),酒精大大有助于社会经济负担的破坏性损伤恢复的病原体和复杂的因素。尽管高患病率和建立狂欢中毒的后果在燃烧的时候受伤,目前一些烧伤患者的治疗和管理的差异之前,没有酒精暴露。这可能是部分原因是上述燃烧的动态自然历史以及复杂的酒精依赖和持续时间的影响。为了发展急需的靶向治疗,中毒的影响生理反应燃烧伤害需要受控条件下的学习和操作。为此,暴乙醇暴露和燃烧的小鼠模型已经应用了近20年,产生了深刻的信息转化为乙醇的机制加剧了燃烧反应。值得注意的是发现,乙醇可以加强burn-induced损伤肠(15,16),肝脏(17,18),和肺(19,20.)增加血清白细胞介素- 6起着重要的作用在这些器官的炎症21,22]。大多数的这些研究管理乙醇填喂法或腹腔注射达到所需的BAC在老鼠身上。虽然可能中毒的存在和水平是最重要的因素在这些模型中,迄今为止没有人调查路线乙醇的影响政府在燃烧。重要的是要建立如果从历史实验结果使用ip注入和填喂法直接可比性以及注意在将来的研究中无意的混杂因素。这里我们研究乙醇的影响,由填喂法或腹腔注射,在postburn肠道炎症和损伤,肝脏和肺的老鼠。

2。材料和方法

2.1。老鼠

雄性野生型(C57BL / 6)老鼠从杰克逊实验室购买(巴尔港,我),在8 - 10周大牺牲。老鼠被安置在无菌microisolator笼子在特定的无菌条件下比较罗耀拉大学医学中心医学设备。所有实验按照制度动物保健和使用委员会。

2.2。小鼠模型的乙醇和燃烧伤害

一个暴乙醇中毒的小鼠模型和燃烧损伤采用使用ip注射或口服填喂法如前所述[23,24]。短暂,ip老鼠都被赋予了一项单一的ip 150剂量L 20% (v / v)乙醇溶液(1.12克/公斤)或生理盐水控制。填喂法老鼠都被赋予了一项单一剂量的300L 10% (v / v)乙醇溶液(1.12克/公斤)或水控制。然后老鼠麻醉(100毫克/公斤氯胺酮和10毫克/公斤甲苯噻嗪),他们的背部剃,他们放置在一个塑料模板暴露总量的15%体表面积和受到烫伤受伤92 - 95°C水浴或虚假的受伤在室温水。烫伤损伤的结果在一个无情的,全层燃烧(25]。然后老鼠复苏与1.0毫升生理盐水和允许恢复变暖垫。8和9点之间的所有实验进行,避免混杂因素与昼夜节律有关。

2.3。血液酒精浓度(BAC)

老鼠被牺牲在30分钟、1小时、4小时后一剂乙醇(1.12 g / kg)由ip注入或填喂法。全血收集通过心脏穿刺,在室温下孵化20分钟然后离心机在3000 rpm在4°C 20分钟。血清是孤立和BAC测量使用GM7 Micro-Stat分析仪(Analox Lunenburg, MA)。

2.4。血液和血清测量

在损伤小鼠安乐死后24小时内,血液通过心脏穿刺收集,和一个整除存入一个微细管管,读一个完整的血细胞计数与微分Hemavet (Drew科学、达拉斯、TX)。剩余的血液已经收获血清如上所述和存储−80°C。血清整除被用来测量il - 6酶联免疫吸附测定(ELISA) (BD生物科学,富兰克林湖,新泽西)或肝脏转氨酶水平使用DRI-CHEM 7000 (HESKA, Loveland有限公司)。

2.5。回肠和肝脏的病理组织检查

在24小时后损伤小鼠安乐死和回肠,肝脏和肺是收获。回肠是固定在10%福尔马林,嵌入在石蜡,切割5点m,苏木精和伊红染色(H & E)。5个人绒毛的长度在5个领域的观点(100 x)是测量为共有25测量每一个动物。一般被认为是代表的绒毛长度回肠和示范图片了。整个肝脏被牺牲的时候,身体总重量重,规范化。

2.6。细菌易位

细菌易位是评估如前所述26]。短暂,3 - 5肠系膜淋巴结/鼠标被移除,放置在寒冷的RPMI,不停地在冰上。节点被分开结缔组织和均质磨砂玻璃幻灯片。匀浆镀在胰蛋白酶的大豆琼脂和孵化一夜之间在37°C。

2.7。肺癌的病理组织检查

的右上叶肺膨胀了10%福尔马林固定过夜如前所述27),把嵌入在石蜡,在5m,苏木精和伊红染色(H & E)。照片拍摄于盲评10大功率领域(400 x) /动物和分析使用基于java的成像程序ImageJ (National Institutes of Health),马里兰州贝塞斯达)。图像被转换为二进制区分从空气空间,然后分析肺组织肺组织的覆盖面积百分比每个字段的视图(如前所述21]。中性粒细胞计数在高功率的10个领域里的盲评(400 x)。

2.8。KC分析肺匀浆

的右中肺叶snap-frozen液氮。1毫升的组织被均质BioPlex细胞裂解缓冲根据制造商的指示(BioRad大力神,CA)。匀浆的过滤和分析细胞因子生产使用ELISA KC (BD生物科学,富兰克林湖,新泽西)。结果规范化使用BioRad蛋白质测定总蛋白(BioRad大力神,CA)。

2.9。统计分析

统计ip和填喂法动物之间的比较是假的,虚假的乙醇,燃烧汽车,和燃烧乙醇治疗组,导致8总组织进行了分析。单向方差分析是用来确定治疗反应差异,和图基的事后测试一旦实现意义()。数据报告为平均值标准错误的意思。

3所示。结果

3.1。血液酒精浓度等于ip注射后或填喂法

确定乙醇路线管理影响吸收的动力学和间隙,老鼠的血液酒精浓度(BAC)决定在30分钟,1小时,4小时后一个剂量的1.12克/公斤乙醇腹腔注射或填喂法。通过腹腔注射小鼠接受乙醇发现143 mg / dL的BAC 30分钟,由1小时下降了33%和69%(图4小时1)。同样,老鼠接受乙醇填喂法证明了BAC的141 mg / dL 30分钟,1小时是下降了41%和77%(图4小时1)。BAC小鼠接受乙醇之间没有显著差异通过腹腔注射或填喂法在每个时间点被发现,表明等量的乙醇被吸收到血液中,与出口增速。

3.2。中毒后通过腹腔注射或填喂法增加外周血粒细胞燃烧

检查如果政府路线影响血液中毒反应,燃烧循环粒细胞的数量被自动计数器枚举燃烧或虚假的伤害后,之前注射乙醇由ip或填喂法。在老鼠强饲法,增加了2倍()在血液陶醉烧伤小鼠粒细胞相对于虚假的受伤的老鼠不管之前中毒状态(图2)。同样在老鼠身上得到一个ip乙醇喷射燃烧之前,增加了三倍()血液中粒细胞被发现虚假的受伤的老鼠相比,有或没有事先中毒(图2)。之间没有显著差异被发现腹腔内注射和填喂法小鼠治疗组表明乙醇路线政府诱导同等嗜中性白细胞增多后燃烧伤害。

3.3。血清il - 6时升高中毒之前燃烧伤害无论政府路线

循环il - 6水平量化了各治疗组腹腔注射和ELISA填喂法老鼠。单独燃烧伤害增加的数量大于25倍以上假受伤动物血清il - 6在ip和填喂法小鼠(图3)。中毒发生燃烧时,进一步增加3到4倍()燃烧就观察到,不管乙醇路线的政府(图3)。没有发现显著差异之间的ip和填喂法在治疗组小鼠表明中毒之前燃烧伤害增加血清il - 6无论使用的乙醇范式。

3.4。绒毛削弱类似ip和填喂法醉酒小鼠后燃烧

我们以前报道,中毒的ip注入进一步的减少烧伤后回肠绒毛(26]。符合我们之前的观察,在燃烧后24小时(数字4 (e)- - - - - -4 (f)),绒毛在回肠相比,缩短了虚假的受伤动物无论中毒状态(数据4(一)- - - - - -4 (d))。此外,当小鼠腹腔注射(图陶醉了4 (g))或填喂法(图4 (h)),绒毛削弱明显超出单独燃烧。

回肠的绒毛长度平均燃烧受伤的老鼠,削弱了大于20% ()相比,假受伤动物无论中毒状态或管理方法(图5(一个))。前期中毒通过腹腔注射或填喂法引起了进一步减少~ 20% (比单独燃烧(图)5(一个)),证明这增加肠道损伤存在类似的程度是否中毒是通过腹腔注射或填喂法。这种绒毛削弱与增加的肠系膜淋巴结细菌易位中毒集落形成单位的数量增加了400倍在虚假的动物,在单独燃烧(图5倍5 (b))。ip之间没有显著差异,填喂法小鼠发现治疗组内表明乙醇路线政府影响烧伤后肠道损伤损伤以类似的方式。

3.5。ip或填喂法中毒同样加剧肝损伤后燃烧

肝损伤是衡量水平的血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)和由肝脏重量全身重量比。单独燃烧增加血清ALT水平大于6倍比虚假的受伤的动物(图6(一))。增加被发现无论存在与否的乙醇或虚假的受伤之前给药途径。当ip或填喂法小鼠醉酒的时候燃烧,然而,大于12海拔()观察假受伤动物与一个~ 2倍增加()燃烧(图6(一))。类似的模式被发现与烧伤血清AST单独导致大于5倍增加相对于虚假的受伤组腹腔注射和填喂法小鼠没有乙醇(图6 (b))。陶醉在ip和填喂法小鼠烧伤血清AST增加额外的2倍()这是一个大于20倍高度(在虚假的受伤的老鼠(图6 (b))。

最后,肝脏重量全身重量比(LW: BW)记录的测量肝水肿。无显著变化,LW: BW被发现虚假的组之间不管乙醇中毒或政府路线(图7)。同样,燃烧就没有造成显著改变LW: BW相对于虚假的受伤的老鼠。然而当老鼠收到乙醇通过腹腔注射或填喂法在燃烧之前,(~ 47%增长最重要的是观察其他组。综上所述,血清转氨酶和LW: BW表明乙醇强化肝损伤后燃烧伤害无论中毒的路线。

3.6。ip或填喂法管理的乙醇燃烧后提高肺泡壁厚

在24小时后中毒,烧受伤,有一个肺泡壁的厚度显著增加,增加了细胞结构,比单独燃烧后更明显(数字8和9)。肺泡壁厚和多孔性量化使用成像软件测量的面积肺组织高功率的10个领域里的每个动物的报道占整个视野。显著增加组织区域,对应于一个相对空气的空间,减少燃烧受伤后被发现,而虚假的动物()。中毒后增加了组织区域燃烧不管它是如何实现的(<),这表明更大程度的肺充血。

3.7。中性粒细胞积聚和肺KC水平放大后ip或填喂法中毒和燃烧

类似于以前的研究(19,20.,27),结合侮辱后ip乙醇注入和燃烧,有肺中性粒细胞增加20倍相比,虚假的动物()和仅增加了2倍烧()(图10 ())。中性粒细胞积聚在ip陶醉KC动物与6倍增长相比,虚假的动物()和一个2倍高度而单独燃烧(图10 (b))。当等量的乙醇是由填喂法,也观察到类似的结果陶醉烧伤小鼠有嗜中性粒细胞数量和KC水平15 - 6倍以上虚假的动物()和2.5 - 2倍以上单独燃烧,分别(图10)。ip之间没有显著差异,填喂法在治疗组小鼠发现表明中毒提高烧伤患者肺中性粒细胞积累和KC不管政府路线。

4所示。讨论

上述研究表明,在小鼠烧伤病人的上下文中,陶醉在一个等价的BAC和持续时间类似程度加剧器官发炎和受损是否由口腔填喂法或ip注入。平等•巴受伤的时候导致相当数量的器官损伤的结果是一致的,表明乙醇行为通过恶化缺血性损伤(28[],改变细胞因子网络29日,30.,损害免疫反应(31日]燃烧后受伤,也许不是通过交互网站的吸收。乙醇的无限的水溶解度附近允许快速分布在整个血液和我们观察到峰值BACs附近30分钟当乙醇是由口腔填喂法或ip注入。见图1,相同剂量乙醇的模式导致了几乎相同的BAC 30分钟,1小时,4小时后管理。ip的吸收时间和BAC老鼠同意我们先前发表的研究(17,26,30.]但BAC概要文件之间的等价填喂法和腹腔注射与李维等的工作。32]的结论是,在老鼠,乙醇的BAC填喂法导致低于腹腔注射等量的乙醇。他们提出,这种差异可能是由于胃酒精脱氢酶代谢,它只发生在乙醇遍历胃肠道。而对比结果的原因尚不清楚,几个可能性,包括乙醇量的差异(3.8克/公斤和1.12 g / kg),乙醇的体积管理(0.41毫升与0.15毫升(i.p)),和差异车辆用于ip注射(水和盐水)可能是促成因素。然而,我们的研究中使用的老鼠,它被给予相同剂量的乙醇填喂法和ip注入,证明了等价的BAC概要文件和一个在燃烧后的炎症反应。进一步讨论考虑ip和填喂法乙醇政府可以找到其他地方看过的D’索萨El-Guindy et al。33]。

中性白细胞增多是出现在各种各样的疾病和条件和被公认的指标感染或炎症。创伤也能导致白细胞增多,它被认为是急性期标记,是临床与发病率和死亡率的增加有关风险(34]。我们观察到,在图2,中毒通过范式诱导类似引起白细胞增多在24小时后燃烧。这些循环的封存在结束后器官损伤提出了中性粒细胞多器官功能衰竭的发病机制的主要机制(35]。我们和其他人已经表明,中毒时燃烧导致中性粒细胞浸润到肠道,增加肝脏和肺部的老鼠在24小时内(8,9,36),图10 ()。此外,预防中性粒细胞轮回在此设置减少使用ICAM基因敲除小鼠肺部炎症(20.),强调中性粒细胞浸润的重要作用在此设置。

循环血液中的中性粒细胞迁移到组织化学引诱物的密度梯度,而在老鼠,老鼠包括KC。燃烧伤害增加肺KC和乙醇可以放大这种积累都没有(19- - - - - -21)和一个气管内的感染的存在铜绿假单胞菌(30.,37]。我们观察到乙醇模式增加肺KC同样燃烧后(图10 (b)),这与肺中性粒细胞数量增加(图10 ())。中毒和燃烧后的白细胞增多,加上中性粒细胞化学引诱物的增加,可能在随后的肺部炎症中扮演着重要角色,似乎是独立于乙醇的方法管理。

循环il - 6的水平升高也与创伤患者的死亡风险(38),进一步增加时中毒之前燃烧伤害(7,17,39]。我们确认我们之前发现单独燃烧增加小鼠血清il - 6水平和中毒受伤时进一步提高循环il - 6。我们现在报告这放大il - 6水平时中毒之前燃烧伤害不受乙醇路线影响政府(图3)。il - 6在乙醇和燃烧的设置在肠道损伤[有决定性作用22和肺部炎症21]虽然系统性il - 6目前未知的来源。感兴趣的是发现中毒和燃烧伤害要比任何一种单独的侮辱(肠道细菌易位导致更大的26),这可能会引起肝脏的反应,包括il - 6生产。

肠道细菌和脂多糖(LPS)进入门户系统遇到枯氏细胞在肝脏。肠道微生物之间的相互作用和肝脏内稳态被称为“gut-liver轴”,在无数的疾病中扮演了重要的角色。燃烧和酒精都是已知的操纵者gut-liver轴和这些侮辱的组合可以实现协同加重肝损害小鼠(18]。临床上,燃烧后肝功能与死亡率密切相关(40]gut-liver轴的重要性进行了强调,动物实验证明改进的结果创伤后肠道抗生素预防性消毒(41,42]。肝损伤和LPS刺激的增加可能会导致肝的生产过量的系统性il - 6,正如上面提到的,起着决定性作用的增加燃烧醉酒小鼠的肺部炎症。这是后常见的临床意义,因为多个器官衰竭实质性损伤和肺是第一批器官失败。

我们现在报告填喂法或ip中毒疗效postburn肠道损伤的组织学(图做了演示4)和绒毛长度(图5(一个))。此外,肠道损伤与增加细菌易位(图5 (b))和肝损伤评估血清转氨酶水平(图6(图)和肝重量7)。这些发现是乙醇独立的管理路线在我们的模型和支持的想法改变gut-liver轴当中毒时存在燃烧伤害。值得注意的是血清il - 6水平上升(图3),模拟损伤肝脏(图中观察到的模式6)。

增加血清il - 6与穷人生存在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者43]。ARDS的特征是肺实质炎症和水肿导致受损的气体交换。当通过组织学检查(图8),小鼠的肺填喂法和ip范式出现拥挤的相对于其他治疗组。当组织的数量相对于空气空间量化(图9),肺泡壁增厚和丰富视觉被发现增加了燃烧后,进一步增加了与之前中毒。这个发现同意我们之前报道与腹腔注射小鼠(21),给药途径的影响。

5。结论

中毒的社会经济影响和临床相关性时燃烧伤害机制值得深入调查这些患者恶化的结果。动物实验用小鼠提供条件控制,运算的基因组,药物干预人类的不可用。水平的一个重要的变量是陶醉在燃烧和动物研究在历史上实现管理已知数量的乙醇通过腹腔注射,口服填喂法被认为是更多的生理中毒的方法。我们现在描述,回肠postburn炎症和损伤,肝脏和肺部的老鼠之前中毒时加剧了在同等程度上通过腹腔注射或填喂法。此外,政府的路线没有影响血液变化观察到当中毒之前燃烧。总的来说我们的数据表明,腹腔注射或填喂法适合研究乙醇对postburn炎症和响应的影响。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究得到了美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所(研究所)的美国国立卫生研究院(NIH)奖号。R01AA012034 (EJK) T32AA013527 (EJK) R01AA015731 (MAC), F30AA022856 (MMC), F31AA022566(洁),和F32AA021636(贝)。内容是完全的责任作者,不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。伊利诺斯州支持的工作也是学术卓越医学格兰特,玛格丽特·a .酒精研究白马捐赠基金和拉尔夫博士和玛丽安·c·福尔克医学研究信任和特里奇洛约拉大学医学院的医学博士/博士。程序。作者想给特别感谢玛丽·布朗,凯尔西Gallo,路易斯·拉米雷斯技术援助。