文摘

理解的时空分析炎症介质及其关联MΦ积累对阐明复杂的免疫性能是至关重要的。巯乙酸在这里,我们使用小鼠引起腹膜炎的浓度来确定23前腹膜渗出液和血浆炎症介质(0)和巯乙酸(天1和3)政府后腹膜腔;这些介质包括TNF -αFGF-9,干扰素-γIP-10咆哮,il - 1αil - 10、il - 6、IL-7, IL-11, IL-12p70, IL-17A, lymphotactin, OSM, KC / GRO MIP-1自洽场β,TIMP-1 MIP-2 VEGF-A、MCP-1 MCP-3, MCP-5。我们的研究结果表明,大多数介质在渗出液和等离子体浓度达到峰值水平1天,明显减少了3天。相反,米数量开始增加在第一天和第三天达到峰值水平。此外,有限合伙人治疗在体外显著诱导中介产品在细胞培养基和溶菌产物孤立的3天。我们的研究结果还表明,0天,许多等离子体介质的浓度高于渗出液,1天,而这一趋势逆转。总的来说,巯乙酸引起腹膜炎的结果表明,可逆趋药性的腹膜渗出液和血液之间的梯度存在于基底和炎症条件和炎性介质生产在活的有机体内是与巨噬细胞炎症期间积累解决分离。

1。介绍

在炎症性疾病的早期阶段,渐变的一些炎症介质扮演重要角色在招募白细胞炎症区域。在这个阶段,单核细胞和巨噬细胞(MΦ)后炎症细胞中性粒细胞的支线。与招募中性粒细胞与短寿命由于细胞凋亡1),MΦ寿命更长,并且发挥更重要的作用在中性粒细胞的间隙通过吞噬作用。除了白细胞招聘外,另一个主要炎症反应的分泌炎症介质,包括促炎介质如白介素(IL) 1、白介素、肿瘤坏死因子(TNF)α和抗炎介质如il - 10。这些介质中的主要由白细胞产生发炎的地区和他们引起特定的免疫反应靶细胞或组织通过特定的受体和信号通路。因此,重要的是要理解炎性介质之间的时空关联分析和白细胞积累。

小鼠巯乙酸引起腹膜炎是一个合适的模型来研究炎症事件伴随着炎性介质生产和白细胞积累。在这个模型中,中性粒细胞数量开始增加,达到峰值水平治疗后4至24小时,在24小时而MΦ数量开始增加,达到峰值水平在3到4天。我们报道了铜积累在腹膜MΦ缺乏ATP7A [2]。腹膜腔与白细胞殖民。在稳定的条件下,居民包括MΦ腹膜细胞,T细胞、B细胞、NK细胞、肥大细胞、树突状细胞(3,4]。居民MΦ和树突细胞提供一个基础免疫监视。值得注意的是,新描述人口的脂肪组织,相关淋巴集群,已经观察到小鼠腹腔(5]。除了这些免疫细胞,也行腹膜间皮的细胞作为一个来源的腹腔内炎症介质(6,7]。虽然在这个问题上存在争议,居民的角色腹膜MΦ巯乙酸在引起小鼠腹膜炎似乎很小。例如,选择性耗尽后居民MΦ(减少86%)的预处理小鼠脂质体含有氯₂巯乙酸MDP (clodronate),政府并没有改变嗜中性粒细胞聚集到腹膜腔(8]。类似的发现也发生在肥大细胞选择性耗尽(减少95%)的预处理小鼠化合物(48/808]。有趣的是,居民MΦ损耗抑制中性粒细胞涌入脂多糖(LPS)引起腹膜炎,而MΦ损耗增加中性粒细胞涌入酵母聚糖诱导腹膜炎(8]。以前,研究还显示,巯乙酸治疗被几乎所有的居民腹膜MΦ在4小时内引流淋巴结9,10]。虽然大规模研究执行调查巯乙酸诱导炎性介质之间的联系生产和腹膜白细胞积累在活的有机体内,这些研究通常被用来阐明优雅的机制,是有关这些事件的特定蛋白质的功能。因此,需要一个全局视图的炎性介质分析及其与白细胞积累。因此,我们最近调查多个炎症介质在腹膜渗出液的浓度和血浆(0)天之前和之后巯乙酸(1和3)政府小鼠腹膜腔。本研究揭示了重要的免疫趋化梯度相关的属性和抑制MΦ中介生产在活的有机体内。

2。材料和方法

2.1。老鼠

雄性C57BL / 6(杰克逊实验室,巴尔港,我,美国)被用于这项研究在10 - 14周大。动物协议批准机构动物保健和使用委员会在圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心。

2.2。巯乙酸诱导腹膜炎

腹膜腔灌洗与3%啤酒巯乙酸肉汤(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)建立急性无菌性腹膜炎。在腹膜渗出物收集、老鼠排除在进一步的研究如果明显粘连腹膜和皮肤之间的观察和/或如果显著增加观察腹膜的腹膜厚度。

2.3。血液和腹膜渗出液的集合

小鼠安乐死在表示时间,肝素化血液收集的心。血液样本在250×g离心5分钟为等离子体隔离。随后,为了收集腹膜渗出液,1毫升1 x磷酸缓冲盐(PBS)是通过腹腔注射(i.p)注入。腹膜渗出液是收获60秒后腹膜按摩。在250 g×5分钟,离心后的上层清液渗出液收集。等离子体和分泌物样本进一步研究之前储存在−80°C。第一个管理1毫升的PBS后,老鼠管理第二个剂量的3毫升1 xpbs。细胞颗粒这两个政府的结合和resuspended 1毫升的红细胞裂解缓冲(Hybri-Max Sigma-Aldrich)在室温下为1分钟。接下来,混合物被洗RPMI 1640介质(Hyclone,洛根,UT)补充10%胎牛血清的边后卫,100单位/毫升的青霉素,链霉素100 mg / L。细胞被颗粒状和resuspended在同一生长介质在室温下进行进一步的研究。

2.4。流式细胞术

腹膜渗出物细胞最先孵化与Fc块(anti-CD16 / CD32) (BD生物科学,圣何塞,CA) 20分钟和彩色表面表达使用anti-Ly6G-PE (BD生物科学)和/或anti-F4/80-AF647 (Serotec,牛津大学,英国)30分钟。所有洗涤和染色进行2%的边后卫在PBS。至少22000个细胞对每个样本进行了分析。中性粒细胞和巨噬细胞的数量计算总细胞数乘以每个应用的阳性细胞百分比。

2.5。腹膜MΦ隔离和治疗脂多糖(LPS)

腹膜渗出物细胞被放置在培养皿聚苯乙烯()1 - 0.5×10⁶细胞/毫升两小时37°C公司在空气湿润95% - 5%₂的气氛。那么这些细胞被洗两次删除不依从细胞。证实了MΦ纯度F4/80染色和形态。

有限合伙人(Sigma-Aldrich)提取大肠杆菌血清型O55: B5和凝胶过滤层析纯化。有限合伙人原液在双重蒸馏水制备5毫克/毫升的浓度。在实验中,小鼠腹膜MΦ0.5×10⁶细胞/毫升首先放入24-well板和增长领域在2厘米²4 h。细胞然后用LPS处理24小时。细胞后的细胞培养介质中,颗粒细胞溶解了50 mM Tris-HCl 2毫米EDTA, pH值7.4。细胞培养基和溶菌产物都储存在进一步研究前−80°C。

2.6。检测炎症介质

23在血浆炎症介质进行分析,腹膜渗出液,细胞培养基,溶解产物使用bead-based多路复用免疫测定(无数遏制、奥斯汀、TX) [11,12]。这些介质包括TNF -α纤维母细胞生长因子(FGF) 9日干扰素(IFN)γ干扰素-γ诱导蛋白(IP) 10、咆哮、IL-17A, IL-12p70, IL-11, il - 10, IL-7, il - 6、il - 1α、lymphotactin oncostatin-M (OSM), growth-regulatedα蛋白质(KC / GRO)、干细胞因子(SCF),巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 1β、MIP-2的金属蛋白酶组织抑制剂1 (TIMP),血管内皮生长因子(VEGF)——,单核细胞趋化蛋白1 (MCP), MCP-3, MCP-5。分析,样本先解冻,漩涡,离心机之前被加载到96 -微量滴定板。接下来,微量滴定板被放置到液体处理程序的机器的样本自动添加到反应井包含捕获珠子。珠子被孵化的样品在室温1小时,让感兴趣的抗原结合他们的目标。生物素化的多路复用鸡尾酒,为每个多路记者抗体被添加到珠混合,并在室温下培养1小时。多放映场影剧院是使用过度的开发streptavidin-phycoerythrin完全混合到每个多路复用的解决方案,并在室温下培养1小时。盘子被清洗去除的检测试剂和阅读Luminex 100仪器,激发光束的发现每个珠子的荧光信号。至少50个珠子每蛋白质检测,每样品。所有值都作为手段。对于每一个多路复用,校准器和控制都包括在每个微量滴定板。 This assay was validated by ELISA [13,14),已被广泛用于确定小鼠炎性介质分析在蛋白质水平(15]。

2.7。统计数据

对于每个炎性介质,平均值±标准误差(SE)是计算每个实验小组。通过学生的数据进行了比较t以及(两个尾巴)。显著差异被定义为拥有P值< 0.05。炎性介质检测在等离子体和渗出液,如果50%以上的样本一个实验组低于检出限,该组织是标记为检测不到。如果少于或等于50%的样本一个实验组低于检出限,至少可检测剂量被用作进一步统计这些样本的浓度。有限合伙人的褶皱增加测定治疗研究,如果预处理样本值低于检出限,至少可检测剂量被用来估计成倍增加。

3所示。结果

在我们的研究中,我们首先确定细胞总数及中性粒细胞的数量和MΦ巯乙酸前后腹膜渗出液治疗。如图1腹膜渗出细胞的总数增加了近10倍1(天×10⁶中性粒细胞,×10⁶MΦ;一天0(相比)×10⁴中性粒细胞,×10⁶MΦ;),3天达到峰值水平(×10⁶中性粒细胞,×10⁶MΦ;)。

3.1。腹膜渗出液炎性介质浓度达到峰值后第一天巯乙酸治疗在活的有机体内

我们分析了23炎症介质的浓度在三个时间点后腹膜渗出巯乙酸治疗。如图2,所有介质的浓度达到峰值水平1天。基于第一天渗出液的浓度水平(表1),这些介质被分成三组。第一组的浓度,包括MCP-1, MCP-3, FGF-9 MIP-1β,TIMP-1达到毫微克水平。考虑到这些中介浓度均高于其他组,这些最重要的候选人可能会影响感应MΦ积累的第三天。第二组的介质的浓度测定在沙克范围,包括IL-17A KC / GRO干扰素-γ、il - 6、IL-11 MIP-2、IL-12p70 lymphotactin, TNF -α,IL-7 MCP-5 IP-10, il - 10、il - 1αOSM,自洽场,VEGF-A。第三组的浓度低,毫微微克范围,包括咆哮。值得注意的是,为了收集腹膜渗出液,一毫升PBS管理腹膜腔。虽然我们不能准确地评估前原始腹水PBS的卷管理到目前为止,我们的观察表明,成交量低于0.5毫升。因此,三倍稀释前后PBS政府认为评价的原始介质在腹膜渗出液的浓度。

3.2。炎症介质的浓度在活的有机体内通常是低血浆比腹膜渗出巯乙酸治疗后1天吗

如图2和类似的观察渗出液,大多数介质的生产,除了lymphotactin,第一天在等离子体达到最高水平。IL-7, il - 10, IL-11 IL-12p70没有血浆样本中发现。因为比较分泌物之间的中介浓度和血浆将允许介质浓度的增加的来源在第一天确认,我们计算平均值的比值之间渗出液与血浆浓度为每一个中介。基于我们之前的假设分泌物可能稀释三倍,我们选择0.33任意阈值:如果比率高于0.33,中介可能更高的浓度比血浆渗出液,和介质的浓度增加的来源可能是渗出液。如果比率低于0.33,中介的浓度在等离子体很可能高于渗出液,和介质的浓度增加的来源可能是等离子体。有19个介质检测浓度水平在渗出液和等离子(表1)。其中,5介质表现出比率高于0.33除了渗出物和血浆浓度之间的显著差异();这些包括lymphotactin, MIP-1β咆哮,TIMP-1, TNF -α从分泌物,说明它们的起源。十三介质表现出比率高于0.33和渗出物和血浆浓度之间没有显著差异();这些包括MCP-1 MCP-3, FGF-9, il - 6, MIP-2,干扰素γMCP-5 IP-10, il - 1αIL-17A OSM,自洽场,VEGF-A。然而,一个明显的趋势是观察渗出液的浓度高于血浆,表明这些介质高度可能起源于渗出液。只有一个中介,KC / GRO比率低于0.33,一个微不足道的渗出物和等离子体浓度之间的区别()。这些发现表明,炎症介质,介质浓度的增加在第一天可能源自渗出液。

3.3。炎症介质浓度在活的有机体内通常是在腹膜渗出液明显减少了巯乙酸治疗后第三天还是第一天吗

如图2,有十个调解人的渗出液中的浓度低于检测限制在每天0和3;其中包括KC / GRO IL-17A,干扰素γ、il - 6、IL-11 IL-12p70, TNF -αIL-7, il - 10, OSM。有3介质,咆哮,MCP-1和il - 1α,渗出液的浓度检测3天,但不是天0;这些介质的浓度显著降低3天相比,那些在第一天()。另一组10介质被发现在所有三个时间点;除了VEGF-A,这些介质的浓度显著降低3天比第一天()。其中10介质,第三天FGF-9和MIP-2的浓度降低到0(天的水平)。因此,介质的浓度(VEGF-A除外)在腹膜渗出液3天在第一天相比显著降低。

3.4。基底的炎症介质浓度在活的有机体内较高的等离子体的分泌物吗

如图2,有八个炎症介质,发现等离子体和渗出液在0天:IP-10, lymphotactin, MIP-2, MCP-3, MCP-5,自洽场,TIMP-1, VEGF-A。表2相比这些探测介质的浓度并计算平均值的比值等离子体和渗出物浓度之间的关系。使用估计阈值0.33如前所述,这些八介质的浓度明显高于等离子体的分泌物在基底条件()。

3.5。LPS诱导炎症介质的产生在体外在腹膜MΦ隔绝老鼠巯乙酸处理了三天

相比的最大数量的腹膜MΦ巯乙酸治疗后观察3天(图1),炎症介质的一般生产显著降低在这个计算腹膜渗出液和血液(图2)。因此,一个有趣的问题是一个子集的腹膜MΦ开关不可逆转的低能力生产这些天1和3之间的调解人。为了解决这个问题,腹膜MΦ分离3天,纯化和LPS处理24小时。如表所示3治疗后,炎性介质产品明显增加细胞培养基和溶菌产物。有十一个调解人大于10倍生产增加培养基;其中包括il - 1α,MCP-1 MIP-2 MCP-3,干扰素-γTIMP-1, TNF -αIP-10 MCP-5, il - 6, MIP-1β。值得注意的是,褶皱增加中介之间的浓度培养基和细胞溶解产物通常是一致的(),除了il - 6, MCP-3咆哮,TIMP-1,暗示转译后的机制参与的规定这些介质的生产。

4所示。讨论

在这项研究中,我们调查了时空分析多种炎症介质在不同的时间(0,1,3)在不同的位置和巯乙酸(腹膜腔和血管)治疗在活的有机体内。因此,我们的讨论将集中在两个免疫属性所揭示出的多个介质的调查,而不是一个特定中介的生物学意义。

4.1。趋化现象的梯度之间的血液和腹膜渗出液

白细胞聚集在炎症组织中是一个至关重要的炎症免疫反应,也就是遵循趋化现象的梯度的促炎介质的粘稠液体。事实上,巯乙酸诱导腹膜炎已被广泛用作模型来调查背后的机制之间的相关性趋药性的梯度和白细胞积累。使用这个模型,新发现的蛋白质的过程中白细胞积累包括heterotrimeric G_我蛋白质(16),多肽N-acetylgalactosamine transferase-1 [17],slp - 76 (18],改编电影[18],鞘氨醇1-phosphate受体2 (19]。我们目前的研究提供了额外的证据来证明这些概念,在基础水平,中介通常在血液中浓度高于分泌物(表2)。这一发现表明存在梯度逆转的趋化作用在基础水平之间的血管和腹腔,这可能发挥了至关重要的作用预防MΦ移民从外周血循环。尽管只有一些分泌物和血液之间的介质显示显著差异在第一天巯乙酸治疗后,这一趋势是明显的(表1):所有检测到的平均值比中介渗出液和血液中浓度低于0.33(0.07到)0天,虽然比率都高于0.33(9.75)在第一天。这一发现表明,尽管渗出液和血液中炎性介质浓度增加巯乙酸治疗后的一天,大多数在渗出液介质的浓度增加高于血液。这些结果说明,重叠化学引诱物梯度存在于血液和腹膜渗出巯乙酸治疗后1天,它允许MΦ迁移到3天达到最高水平。

之前提出了几个模型来评估趋药性的渐变等在体外琼脂糖制成组织培养皿(20.),体外cocultures用鼠标提睾肌在琼脂糖凝胶21]。我们的研究提供的证据表明,巯乙酸诱导腹膜炎是另一个模型来研究趋化现象的梯度在活的有机体内,如转基因老鼠。

4.2。抑制炎性介质在MΦ生产

最初我们惊奇地发现,几乎所有的产品在渗出液和血液减少炎症介质巯乙酸治疗后第三天,因为MΦ被认为是炎症介质的主要生产者和MΦ号码在3天达到峰值水平。然而,这个结果可以解释由前发现凋亡中性粒细胞的吞噬作用MΦ结果抑制促炎介质生产(22]。虽然这个先前的发现是基于在体外模型,我们的结果提示,早期发现可以应用到在活的有机体内模型。因为增加了细胞死亡,表现为早期和晚期凋亡细胞,能被探测到的最早巯乙酸治疗后4小时(23),很有可能MΦ逐渐失去的能力产生炎症介质在凋亡细胞在活的有机体内。但是,我们之间有一些差异在活的有机体内研究和之前的在体外研究。例如,先前的研究表明,治疗期间与凋亡细胞单核细胞活化抗炎细胞因子il - 10的生产增加,而在我们的模型中,il - 10的生产并不是增加3天,暗示监管il - 10的生产在活的有机体内是更复杂的。

我们的研究还表明,增加中性粒细胞和MΦ积累促进炎性介质产品在巯乙酸治疗后第一天,表明中性粒细胞和MΦ积累的水平决定了炎症炎症的早期强度。炎症的决议阶段的时间间隔定义为最大中性积累的中性粒细胞是完全从组织中删除(24]。在这个阶段,中性粒细胞发生细胞凋亡,随后通过MΦ和其他吞噬细胞。我们的研究也表明,在炎症的决议阶段,增加MΦ积累与中介无关产品和MΦ水平积累可能决定了炎症的持久性。

广泛的证据来自临床研究和动物模型的失调与炎症介质作为一个因素在心血管疾病的病理生理过程,如动脉粥样硬化(25)、腹主动脉瘤和心肌梗死(26]。此外,腹膜MΦ是一个合理的模型来模拟心血管MΦ反应(27,28),包括泡沫细胞的形成(29日,30.],MΦ招聘[31日,32],MΦ凋亡[33),和细胞因子的生产(34]。在这方面,MΦ积累的规定已被建议作为一个治疗方法调节炎性介质生产(35,36]。我们的结果提示,这些治疗干预的最佳时期很可能是早期的炎症。

缩写

的边后卫:	胎牛血清
FGF:	纤维母细胞生长因子
干扰素:	干扰素
IL:	白介素
i.p。	腹腔内
IP-10:	干扰素-γ诱导蛋白10
KC / GRO:	Growth-regulatedα蛋白质
LDD:	最小可探测的剂量
有限合伙人:	脂多糖
MCP:	单核细胞趋化蛋白
MIP:	巨噬细胞炎性蛋白
MΦ:	巨噬细胞
OSM:	Oncostatin-M
咆哮:	T-cell-specific蛋白质
自洽场:	干细胞因子
SE:	标准错误
TIMP:	的金属蛋白酶组织抑制剂
肿瘤坏死因子:	肿瘤坏死因子
VEGF:	血管内皮生长因子。

确认

这项工作是由美国心脏病协会的一个国家的科学家发展格兰特(0835268 n)。d·林的作品被沃克尔支持生物医学研究学院。