文摘

介绍。增生性玻璃体(PVR)视网膜脱离是一种严重的炎症并发症。病理外层视网膜表面的膜生长导致收缩,和手术失败在5%到10%的情况下。我们评估VEGF-A的表达,Otx1 Otx2, Otx3, p53家庭成员从PVR标本关联作用,诱导或防止病理。方法。十二个视网膜样本取自患者治疗期间受到PVR retinectomies手术适应症。基因表达是评估使用定量实时逆转录酶聚合酶链反应和免疫组织化学分析,使用四个健康人类视网膜感觉控制。结果。控制显示基底所有基因的表达。PVR样本显示,很少或根本没有表达的Otx1 VEGF-A变量表达式,Otx2, Otx3, p53、p63基因。之间的显著相关性被发现VEGF-A Otx2, p53、p63和Otx1和Otx3之间。结论。第一项同源框、p53的家人和VEGF-A基因表达在PVR人类视网膜。我们个性化两种可能的途径(VEGF-A Otx2, p53、p63和Otx1和Otx3)参与PVR进展可能以不同的方式影响的病理变化。个性化的基因通路PVR代表PVR治疗的新方法。

1。介绍

增生性玻璃体视网膜脱离(PVR)是一个复杂的和发生在大约8 - 10%的病人发展中视网膜脱离(1- - - - - -3]。在视网膜脱离,全层视网膜打破了细胞,巨噬细胞,视网膜色素上皮细胞、神经胶质细胞和成纤维细胞迁移到玻璃,丰富的生长因子和细胞因子与PVR活动(4- - - - - -6]。所有这些细胞增殖的玻璃,生存,形成细胞外基质蛋白,组装成膜。这些膜视网膜上的合同,导致弧PVR和慢性炎症(7]。在眼睛的前部分,提高激光在房水闪光测光值对应于一个改变profibrotic眼内细胞因子环境(8]。

PVR可分为多个类别根据视网膜的配置和疤痕组织的位置(6,9],独特与手术治疗选择[10]。尽管外科技术的进步,呈PVR的比例居高不下,导致视网膜从5%到10%的失败手术修复。由于上述原因,近年来它已成为越来越重要的个别化炎症和遗传机制参与PVR的发病机制,以突出设计可能被利用在临床试验中(11- - - - - -16]。

血管内皮生长因子A (VEGF-A),血小板源生长因子(PDGF)和non-PDGFs(生长因子PDGF家族以外的)与PVR发病机制有关,因为他们的作用抑制p53水平通过不同的途径(17]。这可以促进环境的细胞生存、增殖,组织成一个膜,和随后的膜收缩,所有相关过程和内在PVR发病机理。

p53的动态调节VEGF的家庭成员使其监管复杂,尤其是考虑到所有的三个转录因子(p53、p63和p73)能够诱导和抑制VEGF,这似乎是依赖于细胞上下文和刺激18]。第一家庭包括Homeodomain-containing转录因子参与的一个重要类感应neuroectoderm的形态发生,导致脊椎动物中枢神经系统的形成,包括视网膜。Otx1基因表达在喙的神经管的一部分,需要corticogenesis和感觉器官的发展。后天,是视网膜前部的一个标记,然后将发展成睫状体。Otx2在视网膜的功能发展过程中发挥作用,它表示在产前和成人阶段;的发展和分化有必要视杆细胞和视锥细胞和双极细胞,这是视网膜色素上皮细胞中检测到。此外,Otx3表达观察的眼睛发展在胚胎发生(19]。

本研究的目的是评估VEGF-A的表达水平,Otx1 Otx2, Otx3, p53家族基因在成人健康的人类视网膜感觉相比,视网膜感觉受到PVR和尝试理解他们的角色在诱导或阻止这只眼睛病理学。

2。材料和方法

2.1。视网膜样品

人类视网膜感觉样品都是从12患者受到PVR手术适应症相同的操作在外科医生(CA)。PVR分级根据视网膜社会术语委员会(9]。病人的数据如表所示1。所有患者被告知,他们签署了知情同意(Ospedale di Circolo,瓦雷泽,意大利)。四个成年人视网膜感觉健康从解剖被用作控制的组织。这项研究是由当地伦理委员会批准和遵循赫尔辛基宣言的原则。

2.2。手术

手术也在所有的病人进行的。准确和玻璃基地切除玻璃体切除术后(Stellaris Bausch&Lomb,罗切斯特,纽约,美国),endoilluminator和室温注入流体在手术显微镜(OPMI 1,卡尔蔡司,耶拿,德国),而准确的外层膜的剥离手术器械,再植周边视网膜是不可能的,因为强大的epi - intraretinal PVR组织周边视网膜。因此,外围retinectomy之前endodiathermy相邻视网膜组织在每个病人是必要的,以使最终总年底视网膜复位手术(图1)。视网膜脱离retinectomy通常是摧毁防止其他PVR出现和避免眼睛的前新血管形成刺激VEGF来自缺血性视网膜部分。在这些情况下,小视网膜标本被孤立,抓住nontraumatic仪器(图2),通过术后巩膜切开术洞中删除用于进入手术器械。视网膜样本放置在RNA后解决方案(美国Ambion、奥斯汀、TX)和存储在−20°C到RNA提取。手术持续使用全氟化碳液体(20.)它允许后续排水视网膜下液的查尔斯flut-needle和适当的激光endophotocoagulation [1,21]。全氟化碳liquid-silicone石油1000厘沲交换后来执行最后的术后视网膜复位的稳定。硅油是两到三个月后手术切除达到稳定的视网膜回贴,最终视力。

2.3。RNA隔离和反转录

总RNA RNA分离使用EuroGold迷你包(Euroclone、米兰、意大利)和量化的总RNA是由NanoDrop ND 1000分光光度计(美国威明顿热科学)。总RNA (1μg)是使用高容量反向转录cDNA工具包(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)根据协议。

2.4。定量实时逆转录酶聚合酶链反应

定量实时逆转录酶聚合酶链反应(存在)是由TaqMan技术使用ABI棱镜7000设备(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。基因表达分析完成TaqMan Assays-on-Demand包含引物和荧光探针组合(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。PCR反应混合包含12.5μL TaqMan普遍PCR大师混合,没有AmpErase)(美国应用生物系统公司,培育城市,CA), 1.25μL Assays-on-Demand 3μcDNA、L和8.25μL nuclease-free水。Thermocycler程序由一个初始热开始循环50°C 2分钟和90°C 10分钟,其次是40周期在95°C 15秒和最后一个周期60°C 1分钟。对所有基因,反应进行了一式三份。负控制由PCR没有cDNA混合。人类beta-actin基因作为内生控制规范化基因表达水平相对定量分析通过比较循环阈值(ΔCt)方法。最后,ΔΔCt方法被用来比较基因表达之间的成人视网膜健康和人类视网膜组织PVR的病人。

2.5。统计分析

之间的统计相关性基因表达式计算与分散的情节。我们为图形和价值观相关的两个基因被认为是重要的线性回归系数(22]。

2.6。免疫组织化学

免疫组织化学分析formalin-fixed,石蜡包埋的样本健康人类视网膜作为控制。三个μ米部分是安装在poly-L-lysine-coated幻灯片,deparaffinized和水分通过分级醇水。内源性过氧化物酶活动被3%的过氧化氢溶液10分钟。抗原进行检索与柠檬酸缓冲(10毫米,pH值6.0)在国内微波炉720 w。部分是孵化一夜之间在4°C兔子anti-Otx2多克隆抗体(Chemicon国际,泰梅库拉,CA,猫。不。AB9566)的稀释1:2000,后来Ultravision检测系统设备(热科学、弗里蒙特,CA)根据生产的建议。的免疫反应是使用0.03% 3.3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),和核与哈里斯苏木精复染色。使用完整的重组的主要抗体产生人类Otx2免疫原。由于氨基酸序列之间的同源性Otx1 Otx2和蛋白质,抗体识别的蛋白质。-特异性控制是由遗漏主要抗体和替换多发地血清的稀释。

3所示。结果

3.1。基因表达分析在成人健康的人类视网膜和PVR的病人

据我们所知,这是第一次,第一项的表达基因存在于成人视网膜和PVR组织。在控制样本,我们发现基底所有基因的表达。在PVR样本,我们发现小(样品1、2、3、4、8、9和10)或不表达(样品5、6、7、11、12)Otx1,证明nondifferentiated的视网膜组织(23),变量表达式VEGF-A Otx2, Otx3, p53、p63。我们发现高Otx3水平与小样本的水平Otx2(图3和4(样本)3)。特别是VEGF-A Otx2, p53、p63基因趋势(图显示相同的表达式4)。Otx2,我们发现高水平的VEGF-A p53、p63基因反向Otx1和Otx3表达在PVR样品受到更严重的疾病的特性(更严重的PVR,更多数量的外科手术)(样品5、6、7、11、12)。我们无法评估Otx3水平的病人1,6和8由于低数量的样本。

3.2。统计分析

显示存在相关性()在VEGF-A与Otx2、p53和p63;Otx2和VEGF-A、p53、p63;p53与VEGF-A、Otx2和p63最后p63和VEGF-A, Otx2和p53。此外,我们发现Otx1和Otx3之间的密切相关性。没有统计Otx1之间的关系被发现,Otx3,和所有其他基因(图4)。

3.3。免疫组织化学

通过免疫组织化学分析我们观察到的积极性anti-Otx2抗体在不同视网膜层成人健康的人类样本。光感受器(视杆细胞和视锥细胞),水平细胞、双极和神经节细胞显示积极Anti-Otx2抗体,相反Muller细胞。我们确认第一项的存在蛋白质在细胞核和细胞质的人类视网膜(图5)。

4所示。讨论

斑马鱼,像许多成员的鳍刺类鱼(硬骨鱼),有天赋能力再生组织(例如,鳍、心脏和眼睛)(24]。在硬骨鱼类的鱼,视网膜神经发生持续在成年以后胚胎发生发展。此外,视网膜神经元的破坏后,视网膜可以再生和恢复视功能(25]。受伤后,穆勒神经胶质细胞去分化成干细胞样状态和增殖,以取代失去的视网膜细胞(24]。视网膜的posthatch小鸡,穆勒神经胶质演示的能力去分化成视网膜祖,但重要的视网膜神经元的再生并不发生(26]。与硬骨鱼的持久的神经发生在视网膜上,视网膜神经发生的哺乳动物是在预处理和围产期开发完成27,现在还没有证据表明持续的神经发生或在成人视网膜再生。

PVR是增生性疾病和一些关键调控基因的表达的知识可能有助于理解疾病和,希望视网膜再生。本研究的目的是评估的表达VEGF-A, Otx1, Otx2, Otx3、p53、p63基因在成人健康的人类视网膜的解剖和手术切除PVR影响患者的视网膜感觉。

我们确认VEGF-A和p53的家庭成员的存在,第一次,我们发现第一项的表达基因控制,通过免疫组织化学分析也证实,在PVR组织(数字3和5)。

统计分析显示VEGF-A之间的相关性、Otx2 p53、p63和Otx1和Otx3之间(图4)。这些数据可以一一列举两种可能的途径参与PVR的发病机制。分子遗传路径代表一个假设或模型的不同基因的表达在一系列的生化关系相互影响,最终导致一个特定的表型表达(28]。

两组基因显示反向趋势。事实上,患者更高的VEGF-A表达式,Otx2, p53、p63(样品5、6、7、11、12)没有表达Otx1和低水平的Otx3相比其他样本。相反,患者表现出低水平的VEGF-A Otx2, p53、p63基因(样品3和4)有更高水平的Otx1和Otx3。因此,Otx1和Otx3显示显著相关,反向中观察到Otx2表达式。事实上,据报道,Otx3显著抑制Otx2-induced转录活动,表明Otx3功能的转录阻遏Otx2通过竞争性行动共识TAATCC序列(15]。此外,患者表现出很严重的PVR和接受手术数量升高(样品5、6、7、11、12)有更高水平的VEGF-A, Otx2, p53、p63基因。

在我们的例子中,视网膜感觉的功能基因研究的类似手术和六个月的观察(结果见表1):这个证据反映了文学的最终结果,正如所料,因为我们执行一个标准手术没有新疗法。积极的手术成功地阻止PVR在大部分的情况下发展。情况更严重的PVR和更高水平的VEGF-A Otx2, p5和p63基因显示更糟糕的最终功能的结果。

这是表明p53可以影响VEGF-A表达增加,抑制其水平,同样,不同亚型的p63 VEGF-A表达式(有不同的效果17]。还需要进一步的研究来更好地理解有效的作用和关联VEGF-A和p53的家庭成员之间在视网膜和视网膜受到PVR的影响。

在标准的手术适应症使用室温注入液体,视网膜玻璃体切除术腔和体温过低。关闭输液线后,眼内组织再迅速(29日,30.]。这些温度波动可能影响许多生理功能如出血,玻璃体的细胞因子表达,诱导蛋白的特定模式,和神经保护。低温会导致降低VEGF表达(31日]。相反,在我们的研究中我们发现更高的VEGF基因表达,突出我们的结果。

免疫组织化学分析显示第一项的存在蛋白质内部感光细胞的一部分,水平细胞、双极细胞和神经细胞。尽管Otx1的角色,Otx2, Otx3已经证明了在胚胎发育期间,对成人视网膜的功能。我们假设Otx2可以维护的身份和生存的函数成人视网膜分化细胞,PVR患者,其高表达与分化的细胞进入增殖周期的再入和雄蕊的地位。前体细胞,可能为了再生视网膜细胞死亡,相反可能会在成纤维细胞产生fibrocellular膜成熟。有趣的是,在非常严重的PVR的情况下这个过程更刺激,它是伴随着更高的Otx2表达式。

基因研究的主要目标之一是证据和福利转化为临床实践。在我们的研究中,我们试图在两种不同的方式达到这一目标。首先,我们的研究显示在PVR VEGF-A患者的高表达,和VEGF-A发现促进病人的生物活性玻璃与PVR和兔子。在后者中,vegf初注入intravitreally发现中和PVR [17]。因此,在结果和作者的观点,它可以假定intravitreal之初可能来自发展中PVR的有效保护病人。intravitreal使用之初应考虑(即在PVR诱发因素。,retinal detachment secondary to trauma, long-lasting intraocular surgical procedures, or visible signs of PVR during standard surgery and during postsurgical followup). Secondly, during retinal detachment surgery, we could perform an intraoperative extemporaneous low-cost examination of retinal gene expression and, if high levels of PVR-related genes are shown, it could be useful to perform a more aggressive surgery instead of a low invasive one. Nowadays, technical and organizational hurdles do not allow performing this procedure in a useful timeframe; the exploitation of the above mentioned technique would be a valid attempt to try in the near future.

5。结论

我们发现的表情VEGF-A, p53的家庭,,第一次,第一项同源框基因在健康成年人视网膜感觉和视网膜感觉受到PVR的影响。我们个性化两种可能的途径,VEGF-A Otx2, p53、p63和Otx1 Otx3参与PVR的基因模式,可以以不同的方式影响的病理变化。特别是,在很多患者的样本PVR的更严重的特性,我们发现高水平的VEGF-A,反向p53、p63基因Otx2 Otx1和Otx3表达式。抗VEGF初分子,视网膜VEGF中和,可以保护视网膜免受PVR。

人类健康的免疫组织化学分析视网膜显示第一蛋白质的存在在很多层的视网膜,证实假说的作用作为一种生存的因素。与PVR视网膜感觉,表达的高水平的Otx2表明这个基因的作用在视网膜干细胞的增殖替代坏死细胞。还需要进一步的研究来更好的理解基因机制∠PVR exogenesis。

更好的理解细胞和分子机制,调节生长-诱导神经发生在视网膜上可能会导致新方法增强或控制增殖和未来治疗使用的再生能力。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢Elisa Muscianisi诺华的支持和资金的建议和对她的写作援助的准备。他们感谢设计师大卫。Bonadonna插图和高科技仪器的中心大学的苏。